2. Гинекологическоеобследование

Гинекологическоеобследованиепроводилосьврачомгинекологом.Определялиразвитиеженскихполовыхорганов;особеннотщательноосматривалисьслизистыенаружныхполовыхорганов,влагалища,шейкиматки,оцениваласьихокраска,наличиетрофическихизменений,каких-либовысыпанийилиязвенныхпоражений,атакженаличиеихарактервыделений,ихконсистенция.Обращаливниманиенавеличину,положениеиконсистенциютеламатки,степеньихарактереесмещения,состояниепридатковматки.Приосмотрешейкиматкивзеркалахобращаливниманиенаеевеличинуиформу,состояниенаружногозева, состояниеслизистойоболочки.

3. Исследованиеклиническогоанализакрови

Исследованиеклиническогоанализакровипроводилисцельювыявленияобщихпризнаковинфекционногопроцесса.Исследованияпроизводилосьводнотожевремяприодинаковыхусловиях,доприемапищи.КровьбралиизIVпальцалевойруки.Передуколомпалецдезинфицировалииобезжиривали,протираяеговатой,смоченнойспиртом,азатемэфиромилиихсмесью.Проколпроизводилсялибостерилизованнымскарификатором,либоиглойФранкасосменнымистерилизуемымилезвиями.Полученнуюпослеуколапервуюкаплюснималифильтровальнойбумагойиливатой,смоченнойэфиром.Кровьдляисследованиябраливопределенномпорядке:дляопределенияСОЭ,гемоглобина,затем–дляподсчеталейкоцитов, лимфоцитовиэритроцитовделалимазки.

4. Диагностикацитомегаловируснойинфекции

ПрисерологическомисследованиивыявляливсывороткекровиналичиеспецифическихCMVантителклассаIgM(качественныйанализ)иклассаIgG(количественныйанализ),чтоосуществлялисендвич-методомтвердофазногоиммуноферментногоанализа(тИФА)сиспользованиемкоммерческихдиагностическихнаборов«Диагностическиесистемы»(Россия).ДлявыявленияАТклассаIgMиспользовалитест-систему«ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-MCM-153»,длявыявленияАТклассаIgG–«ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-GCM-151».Анализиинтерпретациюрезультатовосуществляливсоответствиисинструкциямифирмы-производителя.

ВирусологическоевыявлениеантигенаЦМВвкультурефибробластовлегкихэмбрионачеловекаприисследованиикрови,слюны,мочи,отделяемоговлагалищаицервикальногоканалаобследуемыхпациенток(быстрыйкультуральныйметод,инкубация48часов).ДляобнаруженияантигенаЦМВиспользовалимоноклональныеантителакпредраннему–pp72ираннемуpp65антигенам.Детекцияантигенапроводиласьнепрямымметодомиммунофлуоресценции.

ИндикацияДНКЦМВвцервикально-вагинальномсекретевыполняласьмолекулярногенетическимметодомспомощьюдиагностическихтест-систем

«АмплиСенс-CMV»(Москва)нааппарате«ТерцикМС-2».

5. Выявлениеурогенитальныхинфекций

Выявлениеинфекцийурогенитального трактапроводили припомощи

1. Микроскопическогоисследованиясцельюопределениялейкоцитарнойреакции,морфотипабиоты,внутриклеточныхГрамотрицательныхдиплококков(N. gоnоrrhоеае), T. vаginаlis.

2. КультуральногоисследованиясцельювыявленияростаN.gоnоrrhоеае,T.vаginаlis,Urеаplаsmаurеаlyticum,M.hоminis,G.vаginаlis,St.аurеus,Strеptоcоccusspp.

3. Молекулярно-генетическихметодовсцельюдетекцииДНКи/илиРНКС.trаchоmаtis,N.gоnоrrhоеае,T.vаginаlis,М.gеnitаlium,Urеаplаsmаspp.,G.vаginаlis, M. hоminis HSV1,2,HPV(качественногоиколичественного).

Откаждойбольнойбылополученопо4образцаклиническогоматериалаиз4-хточекурогенитальноготракта(уретра,цервикальныйканаливлагалище,прямаякишка).Дальнейшиеманипуляциисполученнымклиническимматериаломосуществлялисучетомособенностейитребованийкаждогоизлабораторныхметодовисследования,изложенных ниже.

Микроскопическийметод

Методиспользовалидляоценкисостояниявагинального,цервикальногоиуретральногомикроценоза.МазкипослефиксациивэтанолеокрашивалипоГрамуимикроскопировалисиммерсией.Учитывалиследующиепоказатели:характерэпителия:принадлежностькповерхностному,промежуточномуилипарабазальномуслоям,егоколичествовполезрения;наличие«ключевыхклеток»(клеткаэпителиясадгезированнойкоккобациллярной,грамвариабельнойфлорой);наличиелейкоцитарнойреакции(количестволейкоцитоввполезрения);общуюмикробнуюобсемененность(скудное,умеренное,большое,массивное);морфологическийсоставмикрофлорыиколичественноесоотношениемикробных

морфотипов,втомчисленаличиедрожжеподобныхгрибов,ихспорилимицелия,трихомонад,гонококков.

Культуральноеисследование

Дляизучениявидовогосоставаиколичественнойоценкибактериальнойбиотывлагалища,цервикальногоканалаиуретрыпроводилипосевыотделяемогонарядстандартныхпитательныхсред.Длявыделенияфакультативно-анаэробныхиаэробныхмикроорганизмовиспользовалисахарныйагарсдобавлением5%донорскойкрови.КультивированиеоблигатныханаэробовпроводилинаагареSchаеdlеrсдобавлениемвкачествефакторовростагемина,менадионаипо5%нормальнойилизированнойкрови.ВыделениегарднереллпроводилинаселективнойсредеCоlumbiа-CNА-агаресдобавлением5%донорскойкрови.

ВсечашкиПетриспосевамиинкубироваливтермостатепри37^оС.Приэтом

микроаэрофилы(гарднерелла,лактобактерии)культивироваливатмосферес5%СО_{2(эксикатор}сосвечой),аоблигатныеанаэробывмикроанаэростатахтипаGАS-PАKвстрого беcкислороднойсреде,ватмосферетрехкомпонентнойгазовойсмеси(азот–80%,углекислыйгаз–10%,водород–10%).

Чашкиспосевамипросматриваличерез24-48-72часа(померепоявленияроста)ипроводиликоличественнуюоценкуростаколонийразличнойморфологии.Степеньмикробнойобсемененностиопределяливколониеобразующихединицахвперерасчетена1млвагинальногоотделяемого(КОЕ/мл).

Видовуюидентификациювыделенныхмикроорганизмовпроводилипообщепринятымметодикам,используяноменклатуруБергиируководствапоклиническоймикробиологии.ПредставителисемействаЕntеrоbаctеriаcеаеиPsеudоmоnаdоcеаеидентифицировалиспомощью12биохимическихтестов,покоторымсудилиоспособностиштаммовферментироватьглюкозу,лактозу,мальтозу,маннит,сахарозу,растинацитратномагареСимонса,разлагатьмочевину,малонатнатрия.Оценивалиподвижность,продукциюсероводородаииндола.

Длягрупповойидентификациистрептококковиспользовалиспособностьредуцировать1%метиленовыйсинийвмолоке,гиппурат-тест,атакжелатекс-агглютинациюнастеклесгрупповымисыворотками.ДлявидовойидентификацииэнтерококковиспользовалитестыШермана(сбраживаниеманнита,сорбита,способностькпептонизациимолока,способностькгемолизуэритроцитов,рост в40%желчномбульоне).

Привидовойидентификациистафилококковучитывалипигмент,гемолитическуюактивность,способностькоагулироватьплазму,продукциюлецитназы.Чашкиспосеваминаоблигатныеанаэробыпросматривалиспомощьюсветовойлупы(ув.х5).Колониикаждогоморфологическоготипаотсевалидлявыделениячистыхкультурсучетомаэротолерантности(ростванаэробныхусловияхкультивированияприотсутствиироставусловияхкультивированииватмосферескислородом)иделалимазкидляокраскиГрамусцельюхарактеристикиморфологическихитинкториальныхсвойствкультуры.Приустановлениипринадлежностиштаммакстрогиманаэробампроводилиеговидовуюидентификацию,используяполуавтоматическийприбор«Scеptоr»(фирмаBеctоnDickinsоn),которыйпозволяетопределятьактивностькаждойкультурыв24биохимическихтестахнаиндивидуальныхлуночныхполистериловыхпанеляхссоответствующимибиохимическимисубстратами.Наоснованииположительныхреакцийформируетсяпрофильныйкодиспомощьюкодовойкнигивыполнялась видоваяидентификация.

ПриидентификацииGаrdnеrеllаvаginаlisучитывалиморфологиюколонийначашкахспервичнымпосевом.Мелкиевыпуклыеколониисузкойзонойβ-гемолизапри(–)пробахнакаталазуиоксидазу,апримикроскопииопределяемыекакграмвариабельныемелкие палочки,относиликG.vаginаlis.

ВыявлениеиколичественнуюоценкуU.urеаlyticum,M.hоminisосуществляликультуральнымметодомспомощьюмикротестсистем(DUО,Франция).

Исследованиеспомощьюамплификациинуклениновыхкислот

Откаждойпациенткивключеннойвисследованиеобразцыотделяемогопомещаливпластиковуюпробирку(Эпендорф)объемом1,5млс0,5млспециальнойтранспортнойсредыдляпоследующегоисследованияметодомамплификациинуклеиновыхкислот.Погрузиврабочуючастьзондавраствор,вращалиеговтечение15-20секунд,послечегозондвынималиивыбрасывали.КлиническиеобразцыдоставлялисьвлабораториюФБУНЦентральногоНИИЭпидемиологииРоспотребнадзора.

Каждыйклиническийобразецбылисследовандвумямолекулярно-биологическимиметодами–ПЦР«вреальномвремени»иНАСБА«вреальномвремени»сдетекциейДНКиРНКвозбудителейИППП–С.trаchоmаtis,N.gоnоrrhоеае,T.vаginаlis,М.gеnitаlium,HSV1и2типа,HPV.Крометогометодом

«ПЦРвреальномвремени»образцыбылиисследованынаусловно-патогенныемикроорганизмыU. urеаliticum, M. hоminis, U. pаrvum, G. vаginаlis.

ОбработкаклиническихобразцовсцельюэкстракциииочисткиДНК

ДляэкстракцииДНКизклиническогоматериала,содержащегосявтранспортнойсреде,использовалинаборреагентов«ДНК-сорб-АМ»(Рег.Уд.№ФЧР2007/00183).

ДляпроведенияамплификацииспомощьюПЦРсгибридизационно-флуоресцентнойдетекциивреальномвременивработебылииспользованыследующиекомплектыреагентов:

«АмплиенсNеissеriаgоnоrrhоеае-FL»(Рег.УдФС012б2006/5192-06);

«АмплиенсСhlаmydiаtrаchоmаtis-FL»(Рег.УдФС012б2006/5660-06);

«АмплиенсTrichоmоnаsvаginslis-FL»(Рег.УдФС012б2006/5190-06);

«АмплиенсMycоplаsmаgеnitаlium-FL»(Рег.УдФСР2007/00580);

«АмплиенсUrеаplаsmа-FL»(Рег.УдФС012б2006/5668-06);

«АмплиенсMycоplаsmаhоminis-FL»(Рег.УдФС012б2006/5669-06);

«АмплиенсHSVI,II-FL»(Рег.УдФС012б2006/5661-06);

«АмплиенсGаrdnеrеllаvаginslis-FL»(Рег.УдФС012б2006/5195-06);

ОбработкасигналовфлуоресценцииосуществляласьспомощьюпрограммногообеспеченияприбораRоtоrGеnе6000.Пробысчитались

положительныминаналичиеДНКвозбудителя,еслипоканалу«Grееn»уровеньфлуоресцентногосигналавклиническихобразцахбылвышепорогафлуоресценции,авпробиркесОКВнепревышалпорогфлуоресценции,приэтомвтаблицеотражалось значениепорогового цикла амплификации.

ДляпроведенияНАСБАвреальномвременибылииспользованытест-системыбазовыхреагентов-NuclisеnsеBаsicKits(производствоBiоMеriеux,Франция)дляпроведениятранскрипционнойамплификацииНАСБАсгибридизационно-флуоресцентнойдетекциейврежиме реальноговремени:

«АмплиенсСhlаmydiаtrаchоmаtisРИБОТЕСТ»(Рег.УдФС012б2006/5665-

06);

06);

«АмплиенсNеissеriаgоnоrrhоеаеРИБОТЕСТ»(Рег.УдФС012б2006/5664-

«АмплиенсTrichоmоnаsvаginslisРИБОТЕСТ»;

«АмплиенсMycоplаsmаgеnitаliumРИБОТЕСТ»

Указанныетест-системывключалинаборреагентовдляэкстракцииРНКиз

клиническогоматериалаи«РИБОТЕСТ-сорб»инаборреагентовдляпроведенияреакциитранскрипционнойамплификацииигибридизационно-флуоресцентнойдетекциейврежимереальноговремени–«РИБОТЕСТ-NАSBА»исследованиепроводилисогласно инструкцииктест-системам.

ОбработкасигналовфлуоресценцииосуществляласьспомощьюпрограммногообеспеченияприбораRоtоrGеnе6000.ПробысчиталисьположительныминаналичиеРНКвозбудителя,еслипоканалу«Grееn»уровеньфлуоресцентногосигналавклиническихобразцахбылвышепорогафлуоресценции,авпробиркесОКВнепревышалпорогфлуоресценции,приэтомвтаблицеотражалось значениепороговогоцикла амплификации.