2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ
.pdf
Глава 7 | Метод тканевых мульти-блоков
Rashmil Saxena BFA, HT(ASCP)CM, Sunil Badve MD, FRCPath
перевод Н.В. Даниловой
В последние годы наблюдается интенсивное развитие высокопроизводительных методов исследования, таких как сравнительная геномная гибридизация и кДНК микропанели (твердый носитель небольшого размера, (например, стекло, нейлон или металлическая пластинка), с прикрепленными к нему в определенном порядке короткими олигонуклеотидами или фрагментами ДНК), которые позво-
лили открыть тысячи новых биомаркеров. Однако, эти данные должны оцениваться в исследованиях на тканях в больших выборках, чтобы продемонстрировать свою потенциальную пользу. Поскольку
эти выборки в основном
представлены материалом, |
|
Донор |
|
Донор |
|
Донор |
|
|
Донор |
|
|
|
Донор |
|
Донор |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
зафиксированным в форма- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
лине и залитым в парафи- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
новые блоки, идеальным |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
для такой оценки стано- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
вится иммуногистохимиче- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ский метод исследования |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
Реципиент |
|
|
|
|
|||||||
(IHC). Тем не менее, приго- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
товление полноразмерных |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
срезов с каждого блока из |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
тысяч требует огромной |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
22 TA |
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
затраты ресурсов, реагентов |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
(BIOG) VEGF .U.I LAB IHC |
RESEARCH |
|
|
|
|
|||
и времени. В дополнение |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
к этому, с одного блока |
Рис. 7.1. Принцип метода тканевых мульти-блоков (ТМА). Цилиндрические |
||||||||||||||||||
|
|
||||||||||||||||||
можно сделать не более |
столбики получают из большого количества (порядка 1000) индивидуальных |
||||||||||||||||||
300 стекол с |
толщиной |
парафиновых блоков. Они переносятся в блок-реципиент ТМА. С каждого ТМА |
|||||||||||||||||
срезов 5 мкм |
каждый. |
блока-реципиента может быть изготовлено порядка 300 срезов. Одинаковые |
|||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Метод тканевых мульти- |
ткани во всех изготовленных с блока стеклах имеют одни и те же координаты. |
|
Отдельные стекла могут быть использованы для различных видов тестов. |
||
блоков (tissue-microarray, |
||
Такая методика значимо экономит реагенты и при этом обеспечивает высокую |
||
|
||
TMA) позволяет решить |
информативность и производительность метода. |
|
|
||
некоторые из этих проблем. |
|
|
Основоположником ТМА |
|
|
можно считать доктора |
|
|
Hector Battifora, который |
|
|
изготавливал так называ- |
|
|
емые «колбасные» (парафи- |
|
|
новые) блоки [1]. |
|
|
|
Рис. 7.2. Обычно из каждого блока-донора (случая) берется 3 столбика |
|
|
ткани, диаметром 0,6 мм. |
| 69
Метод тканевых мульти-блоков |
Глава 7 |
|
|
В один такой блок заливались ткани разных органов и исследовалось распределение антигена или белка. У этой методики был существенный недостаток: если поместить в один блок ткани опухолей или ткани, взятые из одного и того же органа у разных пациентов, то практически невозможно потом различить где какой образец. Это делает невозможным адекватный анализ прогностической ценности маркеров. Многие лаборатории (включая нашу собственную) адаптировали данную технологию для производства мульти-тканевых или мульти-органных блоков. Следующий этап развития ТМА был описан WH Wan et al. [2]. Он использовал 1.651 мм иглу, вручную высверливал столбики из парафиновых блоков и располагал их в виде матрицы в определенной, четко маркированной последовательности. Этот метод в дальнейшем модифицировал Y.Kononen et al. [3], используя 4 мм дерматом. Они использовали матрицу с небольшим количеством расплавленного парафина, чтобы записать положение каждого биоптата.
Это знаковое исследование привело к изобретению специального точного инструмента для ТМА с х-у координатной шкалой (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI), что сделало реальным анализ с высокой пропускной способностью с получением порядка 1000 столбиков в одном блоке (рис. 7.1., 7.2.).
Преимущества и недостатки
Преимущества ТМА: Главное преимущество ТМА в том, что метод позволяет использовать тканевой анализ (иммуногистохимию, гистохимию, гибридизацию in situ) на большой выборке образцов эффективно и экономно. Используя ТМА технологию, возможно совместить на одном стекле для анализа материал в виде столбиков от нескольких сотен пациентов и, соответственно, из нескольких сотен блоков. Таким образом сохраняется гораздо большее количество ткани, чем при исследовании стекол с отдельных блоков. ТМА может производиться на всех типах тканей, включая декальцифицированную кость и трепанобиоптаты. Последние обычно поворачивают на 90° и заливают вертикально, чтобы убедиться в наличии интересующей врача ткани на серийных срезах. Помимо этого, существуют методы, позволяющие составлять ТМА-матрицы из свежезамороженных тканей, находящихся в блоках,
как из наполнителя для оптимальной температуры резки, так и из смеси желатина и сахарозы.
Недостатки ТМА: Главным недостатком ТМА, как считалось на заре развития технологии, является то, что каждый столбик (или группа столбиков из одного блока) содержит только частичку исходного образца. Однако, многочисленные исследования, использовавшие материал из разных систем органов, показали, что в ТМА и в серии срезов с целых блоков могут быть получены сопоставимые результаты. Для получения сопоставимых результатов применяются 2 стратегии. Во-первых, увеличение количества столбиков, изготавливаемых из одного блока-донора. Обычно, если речь идет о столбиках диаметром 1 мм, то из каждого блока берется как минимум 2 столбика, а если речь идет о столбиках диаметром 0,6 мм, то как минимум 3 из каждого блока. Несмотря на то, что теоретически столбик диаметром 2 мм может быть более информативен, чем несколько столбиков меньшего диаметра, на практике это не подтверждается. Более маленькие столбики позволяют взять образцы из различных участков опухоли и, таким образом, являются более репрезентативными в отношении целой опухоли. В дополнение к этому, изготовление маленьких столбиков позволяет наносить ткани
в блоке-доноре меньшие повреждения (рис. 7.3.). Вторая стратегия состоит в увеличении количества
70 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 7 |
Метод тканевых мульти-блоков |
|
|
опухолей, включаемых в исследование. Эта стратегия усредняет ошибки, ассоциированные с гетерогенностью опухолей при использовании ТМА.
Ограничение использования ТМА
ТМА не рекомендуется использовать при исследовании отдельных опухолей, таких как глиобластома, где наблюдается значительная гетерогенность ткани опухоли. В дополнение к
этому, ТМА не очень информа- Рис. 7.3. Фотография мульти-блока низкой плотности.
тивен при исследовании такого фокального параметра, как коли-
чество иммунных клеток в опухоли. Также трудно оценивать взаимодействие паренхимы опухоли со стромальными компонентами, поскольку стромальный компонент может быть не адекватно представлен в столбиках ткани. Для таких исследований возможно использование толстых столбиков диаметром 2 мм.
Варианты метода тканевых мульти-блоков
Типы ТМА выделяются в зависимости от задачи, поставленной исследователем. Приведены наиболее распространенные:
Мульти-блок клеточных линий – это блок, составленный из нормальных или раковых клеточных линий, выращенных в культуре. Главная цель создания такого мульти-блока – определить присутствие белков, о которых известно, что они представлены одной или нескольких клеточных линиях. Дополнительно такой подход может быть использован при анализе рентабельности (и специфичности) антител, детектирующих белки. Наиболее распространенный пример использования такого мультиблока – контроль трех клеточных линий, который используется при тестировании на HER2/neu при раке молочной железы.
Смешанные, тканевые/опухолевые мульти-блоки – содержат как опухолевые, так и неопу-
холевые ткани из различных локализаций. Маленькие мульти-блоки такого рода могут использоваться для контроля качества, например для исследования срока годности реагентов/антител или для титрования новых реагентов. В дополнение к этому такие мульти-блоки могут использоваться как исследовательский инструмент. Например, анализ экспрессии CD10 в опухолях разного происхождения привел к открытию его диагностической значимости при исследовании стромальных
опухолей матки [4].
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 71
Метод тканевых мульти-блоков |
Глава 7 |
|
|
Мульти-блок из последовательных случаев – составляется с использованием материала последовательных случаев, взятого от одного пациента. Такой тип блоков чрезвычайно полезен для контроля качества, включая качество реагентов. Он удобен и при исследовании распространенности конкретных антигенов/белков в отдельном типе опухоли, и при анализе взаимоотношений между различными биомаркерами.
Мульти-блок, основанный на какой-либо характеристике опухоли – это специфический тип блоков, конструирующийся исключительно на основе одной заданной характеристики (возраст пациента или стадия опухоли).Применяются при оценке частоты экспрессии маркера в зависимости от степени дифференцировки. Также блоки могут составляться на основе уровня экспрессии какоголибо маркера, например рецептора эстрогена или HER2/neu положительных или тройных негативных раков молочной железы.
Мульти-блок прогрессии – используется для анализа роли белка(ков) в прогрессии рака и составляется из нормальных тканей от здоровых людей, нормальных тканей от пациентов с раковыми заболеваниями, преинвазивных изменений и опухолевых (взятых из первичных очагов или из метастазов). Расположение нормальной ткани рядом с опухолевой или вдали от нее позволяет также изучать эффект поля.
Мульти-блоки, основанные на исходах – являются наиболее ценными и наиболее трудными для составления. В них производится сравнение тканей от пациентов с одним заболеванием и сходным лечением, наблюдаемых в течение длительного периода времени с различными исходами. Период наблюдения зависит от вида болезни или типа исследуемой опухоли. Такие блоки используются для определения прогностической ценности маркеров. Присутствие биомаркеров в отдельных подтипах опухоли затем может быть использовано для разработки новых терапевтических стратегий.
Другие специфические типы мульти-блоков – блоки могут составляться в зависимости от
конкретного запроса исследователя. Например, сравнение по расовому признаку (кавказская с афроамериканской), по половому (мужчины и женщины) или блок, ориентированный на определенную ткань (исследование центра опухоли и ее инвазивного края).
Персонал, необходимый для конструирования тканевых мульти-блоков
Конструирование тканевого мульти-блока – это командная работа. Первый и главный вопрос: зачем конструируется блок? Ответ на него определяет состав персонала. Для составления простейшего блока может потребоваться только один лаборант. Однако для составления большинства блоков требуется тесное взаимодействие врача-патологоанатома, который будет определять зоны интереса и маркировать их, и лаборанта, изготавливающего столбики. Кроме того, лучше привлечь специалистов по биологической статистике с самого начала, чем требовать от них простой анализ данных. Эти специалисты могут помочь в определении необходимого количества столбиков, для каждого случая, общего количества случаев и их распределения по мульти-блоку, для предотвращения системати-
ческих ошибок. Количество случаев, включаемых в блок, зависит от величины ожидаемой разницы
72 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 7 |
Метод тканевых мульти-блоков |
|
|
|
|
и от степени вариабельности образцов; расчет величины выборки лучше производить при содей-
ствии специалиста по статистике. Результат, полученный путем анализа блоков, возможно, потребует консультации лечащего врача или онколога.
Этапы конструирования тканевых мульти-блоков
Рекомендуемые этапы конструирования тканевых мульти-блоков (на примере молочной железы):
Этап 1. Определение цели
Как упоминалось выше, мульти-блоки конструируются для ответа на определенный вопрос. Очень важно ясно поставить задачу в начале работы. В зависимости от специфики задачи определя-
ется величина выборки и количество столбиков для конструирования блока. Например, блок, содержащий 20 случаев, подойдет для контроля качества, но не подойдет для исследования биомаркера.
Этап 2. Обзор случаев, включаемых в мульти-блок
Соберите все случаи, которые хотите включить в мульти-блок, вместе. Если с выбранных блоков уже делались срезы в диагностических или исследовательских целях, может понадобиться изготовление одного свежего стекла, окрашенного гематоксилином-эозином для того, чтобы убедиться, что блок содержит интересующий вас материал. Пересмотрите все стекла и отметьте зоны интереса. Полезно отмечать множественные области более, чем в одном блоке, так как блок может быть перепутан или исчерпан. Необходимо идентифицировать области, из которых будут браться образцы (опухоль, здоровая ткань, предопухолевые изменения).
Этап 3. Определение диаметра столбиков и их количества
Диаметр столбиков: при конструировании мульти-блоков обычно используются столбики стандартного диаметра: 0,6 мм, 1 мм, 1,5 мм, 2 мм. Многие считают стандартным для практики диаметр 0,6 мм. Использование маленького диаметра позволяет извлечь из блока-донора большее количество столбиков и включить в состав мульти-блока большее количество столбиков. В дополнение к этому, маленькие столбики меньше повреждают блок-донор и блок-реципиент, их легче извлекать и менять местами.
Преимуществом столбиков большого диаметра является их большая прочность и меньшая подверженность разрушениям во время манипуляций. Однако большой диаметр столбика увеличивает вероятность возникновения трудностей при изготовлении столбиков, также как и возможность сломать блок донор или сделать в нем трещину.
Количество столбиков: оптимальное количество столбиков включаемых в матрицу является вариабельной величиной и меняется в зависимости от степени опухолевой гетерогенности. В целом
чем больше внутриопухолевая гетерогенность по одному из признаков, тем большее количество столбиков может потребоваться. Если диаметр столбика составляет 0,6 мм, то обычно из одного блока-
донора берут три столбика. Три столбика минимального диаметра лучше, чем один диаметром 1,0 мм,
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 73
Метод тканевых мульти-блоков |
Глава 7 |
|
|
даже если поверхность ткани внешне выглядит однородной. Изготовление трех столбиков диаметром 1,0 мм может привести к разрушению блока-донора. Поэтому в исследованиях, для которых применялись столбики диаметром 1,0 мм, как правило, брали два столбика с одного блока [5]. Кроме того, количество столбиков и их диаметр зависят от исходного размера кусочка ткани.
Плотность: максимальное количество столбиков, которые можно поместить в один блок, варьирует в зависимости от их диаметра, размера блока и иммуногистохимической методики. Лучше избегать изготовления слишком большой матрицы, если при этом на стекле область со срезами будет больше области покрытия антителом, запрограммированной в автостейнере (Dako A/S). Слишком большое количество столбиков также может создать трудности при резке материала, так как толщина парафина по краям блока меньше. Необходимо размещать столбики, отступив как минимум 3 мм от края блока, чтобы предотвратить образование трещин в парафине. Максимальное количество столбиков в блоке также должно определяться комфортным уровнем для лаборанта, который будет изготовлять мульти-блок и для врача-патологоанатома, который будет производить анализ стекол. Поэтому обычно в один мульти-блок помещают от 100 до 300 столбиков, диаметром 0,6 мм.
Расстояние между столбиками: расстояние между столбиками не должно превышать выбранный вами диаметр. Лаборанту проще ориентироваться по рядам и колоннам, если он составляет мульти-блок последовательно, переходя от одного столбика к другому. Если расстояние между ними будет больше, то будет трудно соблюдать одну цепь, что может привести к пропуску дорожки и неверной идентификации.
Этап 4. Выбор контрольных тканей для включения в блок
Контроль должен присутствовать в каждом изготавливаемом мульти-блоке. В первую очередь для контроля качества, а также для приведения в соответствие опухолевой гетерогенности.
Используются следующие типы контролей:
А. Тканеспецифические контроли: нормальные ткани или клеточные линии исследуемого органа помогут в сравнительном анализе экспрессии маркера, а также в калибровке и стандартизации его концентрации.
В. Биологически ассоциированные контроли: их использование полезно для контроля правильной работы реагентов. Они будут хорошим внутренним контролем. В качестве примера можно привести эндометрий для рецепторов гормонов, яички, лимфатический узел или миндалину для пролиферации.
С. Контроль из той же системы органов: ткани надпочечников, мозга, молочной железы, кишки, почки, легкого, поджелудочной железы, плаценты, яичек, слюнных желез, миометрия. Включение таких контролей в матрицу обычно полезно при изучении нового маркера, поскольку одна или несколько из этих тканей может служить внутренним контролем. Если брать по мини-
муму, то из нормальных тканей обязательно должны присутствовать: печень, почка, эндометрий, лимфатический узел, кишка и яичко.
74 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 7 |
Метод тканевых мульти-блоков |
|
|
|
|
Этап 5. Создание ТМА карты, описывающей план расположения столбиков
Карту составить в программе Excel или при помощи специального программного обеспечения (рис. 7.4.). Эта карта будет служить руководством к систематизации блоков и отражать последо-
вательность, в соответствии с которой они должны быть включены в мульти-блок. Таким образом, ТМА-карта содержит информацию о положении каждого случая, включая повторы и контроли. Можно выделить мини-группы («городские кварталы») из столбиков (3х5, 4х5, 5х5, 6х5) для удобства ориентации и расположить контрольные образцы ткани в рядах (строках) между этими мини-
группами.
Рис. 7.4. ТМА-карта и дизайн блока: план расположения столбиков в блоке должен быть ассиметричным, чтобы было проще ориентировать мульти-блок. Эта ассиметрия должна быть безусловно понятна лаборанту, который изготавливает срезы, так как все срезы должны быть размещены на стеклах единообразно. Также удобно ассиметрично располагать контроли в матрице, что упрощает анализ стекол. Можно руководствоваться несколькими правилами:
1.Пустые ряды и колонны, которые отграничивают линии блока-матрицы.
2.Пустые углы для ориентации или диагональ идущая от площадки к одному из углов
3.Ассиметричное расположение контрольных клеточных линий и тканей. Размещение окрашенных столбиков «контроля» по краям решетки может быть полезной меткой для ориентации.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 75
Метод тканевых мульти-блоков |
Глава 7 |
|
|
Выводы по составлению плана:
1.План мульти-блока должен быть ассиметричным (рис. 7.4.)
2.Если для одного проекта изготавливается несколько мульти-блоков, то на другие блоки рекомендуется переносить небольшой процент случаев (около 10%)
3.Столбики из одного и того же случая: если столбики, взятые у одного и того же пациента, помещаются на один блок, лучше разбросать их по блоку. Это снизит риск системной ошибки в интерпретации. Некоторые исследователи предпочитают это распределение, поскольку они могут быстро «нормализовать» результаты анализа разных столбиков от одного пациента. Если столбики от одного пациента распределяются среди нескольких блоков, лучше распределить их в разных частях схемы (снаружи на одном блоке и изнутри на другом) случайным образом, чем помещать в одно и то же место в различных блоках.
Этап 6. Создание мульти-блока
Инструменты: необходимость в инструментах для создания мульти-блока полностью определяется количеством столбиков и ценностью ткани, которую вы собираетесь использовать для ТМА. При создании мульти-блоков, служащих для контроля качества или для тестирования новых реагентов, требуется относительно небольшое количество столбиков. Это позволяет вам использовать столбики большого диаметра и снижает потребность в специализированном инструментарии. Однако, если мульти-блок изготавливается из ценных случаев с небольшим количеством материала, необходимо использовать специальные инструменты. Наиболее простым из них является ручной перфоратор, но в серьезном проекте с применением ТМА он непригоден. В таком проекте требуется техника среднего уровня. Она представляет собой штатив с устройством позиционирования, обеспечивающий вертикальное «сверление» блоков и правильное расположение сетки. Полностью автоматизированные системы дополнительно имеют интегрированные компьютеры, которые могут быть запро-
граммированы на выбор донорских мест в разных блоках и перенос столбиков на блок-реципиент.
Блок-донор: Блок, из которого будут изготавливать столбики, называется блоком-донором. Область блока, из которой будет производиться забор ткани, должна быть определена врачомпатологоанатомом. Несмотря на то, что это интуитивный процесс, необходимо убедиться, что материал в блоке-доноре проведен правильно и в нем нет недопроведенных участков. Блок-донор не должен быть излишне срезан. Чем толще блок-донор, тем больше полезных наиболее полных срезов можно будет в дальнейшем получить с мульти-блока. Столбики следует вынимать из мульти-блока аккуратно, поскольку можно повредить иглу и сам блок. При использовании полуавтоматизированных приборов гораздо удобнее отметить глубину на перфораторе до уровня пластика в кассете.
Блок-реципиент (мульти-блок): блок, в который переносятся столбики называется блокомреципиентом или мульти-блоком. Лучше размещать столбики по направлению к центру блока, чтобы не сломать его. После того как все столбики перенесены в блок, его необходимо поместить в термостат при температуре 37ºС на ночь, затем на холодную часть заливочной станции, после чего необхо-
димо повторить два или три раза горячий/холодный цикл (цикл длится 1 час) для того, чтобы скрепить
76 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 7 |
Метод тканевых мульти-блоков |
|
|
мульти-блок. Срезы с блока необходимо изготавливать один раз, чтобы избежать потери ткани при повторном тримминге. Неполные срезы не должны выбрасываться; они могут быть использованы для стандартизации методики
окраски (см. ниже).
Окрашивание ТМА: перед
окраской срезов, изготовленных с мульти-блока, необходимо убедиться, что метод окрашивания действительно работает и протокол окрашивания стандартизован. Если стекла с ТМА-срезами получены из другого учреждения, необходимо получить из той же лаборатории ткани, проведенные там, или неполные ТМА-срезы для стандартизации. После стандартизации ТМА-срезы хорошего качества могут быть пущены в работу. Так как ТМА-срезы обычно большего размера, чем стандартные, необходимо постоянно следить за тем, чтобы реагентом была покрыта вся поверхность среза, иначе есть риск получить неравномерное окрашивание. Одним из ограничений ТМА является разнородность материала: если блоки-доноры были проведены с использованием разных протоколов. Это приводит к оптималь-
ному окрашиванию срезов только части столбиков, а остальные окрашиваются либо слишком сильно, либо слабо. Однако большое количество столбиков, включаемых в матрицу, до некоторой степени компенсируют гетерогенность тканей.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 77
Метод тканевых мульти-блоков |
Глава 7 |
|
|
Этап 7. Тестирование и проверка качества
Тестирование ТМА: использование ТМА предоставляет для анализа большой массив данных, однако это не означает, что эти данные не искажены. Причиной этого искажения может быть место расположения лаборатории (рассовое распределение населения, национальности, доступность медицинского обслуживания) или род деятельности (обычная больница и специализированная). Это может влиять на размер, степень, подтип строения опухолей, включенных в исследование. Такие аномалии в данных необходимо компенсировать. Вовлечение в процесс специалиста по биологической статистике с самого начала (на этапе отбора случаев), поможет предотвратить создание мульти-блоков с системной ошибкой. Полезно также провести анализ изготовленного мульти-блока на общеизвестные биомаркеры, чтобы убедиться в их нормальном распределении. Сравнение полученных данных с имеющимися (напр. анализ ER), полученными при анализе целого среза в прошлом, также полезны для оценки адекватности мульти-блока (рис. 7.5., 7.6.). Частоту экспрессии маркеров в мульти-блоке необходимо сравнивать с данными, опубликованными в литературе (в исследованиях использовавших полноразмерные срезы).
Контроль качества: очень важно изготовить и проанализировать стекла с мульти-блока, окрашенные гематоксилином-эозином, чтобы подтвердить наличие интересующей вас ткани в срезах. Стекла для окраски гематоксилином-эозином должны изготавливаться с определенной периодичностью (каждое 25-е стекло, например) при микротомии с мульти-блока.
Все вышеперечисленные действия должен контролировать и анализировать врачпатологоанатом.
Анализ ТМА
Анализ ТМА состоит из двух этапов. Первый – анализ стекол и документирование результатов. Второй – анализ данных.
Анализ стекол: ТМА-стекла можно анализировать вручную; также доступны автоматические программы для анализа. Необходимость в таких программных средствах определяется объемом работы и плотностью мульти-блока. Некоторые программы генерируют виртуальные стекла с ТМА, и дальнейший анализ может производиться с экрана компьютера. Преимуществом этого метода является предупреждение выгорания стекол, а также то, что все стекла могут быть проанализированы в одних и тех же условиях освещенности и увеличения. Также программа позволяет хранить полученные изображения свежих препаратов в электронном виде и анализировать их по прошествии времени.
Анализ данных
Этап 1. Проверка данных
Поскольку в ТМА исследовании используется очень большое количество образцов, анализ данных становится сложной задачей. Сначала необходимо исключить неинформативные случаи;
нередко теряется около 10% случаев, из-за недостаточной репрезентативности интересующей ткани.
78 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/