2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ

Признаки ненадлежащей обработки.

Для определения качества ферментативной обработки на уже окрашенном препарате требу-

ется оценка нескольких параметров, самыми важными из которых являются следующие:

1.Уровень аутофлюоресценции.

2.Качество окраски DAPI.

3.Распределение сигнала.

Аутофлюоресценция

Образцы с недостаточной ферментативной обработкой могут быть выявлены при использовании подходящего двойного фильтра (например, Texas Red/FITC). Образцы с недостаточной ферментативной обработкой часто характеризуются видимой зеленой аутофлюоресценцией в области цитоплазмы и экстрацеллюлярного матрикса (рис. 11.2. А, С).

При явной недостаточной ферментативной обработке, гибридизация зонда затруднена из-за присутствия белков и многочисленных пептидных связей. Происходит снижение интенсивности сигнала вследствие как более высокой аутофлюоресценции, так и более низкой эффективности гибридизации, таким образом уменьшается соотношение сигнал/шум. Использование меченных PNA олигонуклеотидов или ДНК, как референсных проб, против часто повторяющихся последовательностей (например, центромерных последовательностей), может приводить к появлению зеленых сигналов, несмотря на неудовлетворительную обработку образца (рис. 11.2. А).

FISH окраску с недостаточной ферментативной обработкой можно распознать по аутофлюоресценции цитозоля и экстраклеточного матрикса и отсутствию или снижению количества и интенсивности красных сигналов от интересующего гена (отдельного локуса).

В правильно обработанных ферментом образцах аутофлюоресценция ограничивается только ядром, и ее уровень не перекрывает ни зеленые, ни красные сигналы (рис. 11.2. Е). Анализ аутофлюоресценции в препаратах поможет выявить образцы с недостаточной ферментативной обработкой, однако уровень аутофлюоресценции не помогает отдифференцировать правильно обработанные образцы от слишком сильно обработанных.

Качество окраски DAPI

DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид) формирует флюоресцентные комплексы с двухспиральной ДНК, что делает возможным использование DAPI для определения уровня обработки ферментом. Недостаточная обработка ферментом препятствует образованию комплекса ДНК и DAPI приводит к гетерогенной окраске ядер. Это становится заметно, при сравнении окраски оптимально обработанного образца (рис. 11.3.А) с окраской недостаточно обработанного (рис. 11.3.В). Слишком сильная обработка также видна при окраске DAPI в виде формирования «бублика» или разрушения ядерных мембран (рис. 11.3.С и рис. 11.3.D, соответственно).

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 109

Глава 11

Распределение сигнала

Окрашивание с помощью DAPI (рис. 11.3. A-D) демонстрирует, что ферментативная обработка ядерного материала происходит гетерогенно. В соответствии с окраской по DAPI центр ядра – наиболее подверженная ферментам область. Потеря геномной ДНК, как результат слишком сильной обработки, компрометирует техническую точность метода FISH, поскольку количество генов, на которые направлены зонды, может сократиться. Исследование А.Bolzer, et al. [7] демонстрирует, что локализация геномной ДНК в ядрах клеток человека коррелирует с плотностью генов. Бедные генами домены формируют слой непосредственно под ядерной оболочкой, а домены, богатые генами, сосредоточены

во внутренней области ядра. Направленные на центромеры референсные зонды, используемые в

FISH анализе солидных опухолей в составе смеси зондов, направлены, как следует из названия, на бедные генами домены и должны – согласно наблюдениям А.Bolzer, et al. – располагаться ближе к ядерной оболочке. На этом основывается анализ распределения сигнала при использовании направленных на центромеры зондов для интерфазных окрасок (рис. 11.4.).

FISH зонды, направленные против целевых генов, чаще расположены в богатых генами доменах, расположенных во внутренней части ядра, таким образом, неравномерная ферментативная деградация, затрагивающая центр ядра, может сдвигать соотношение сигналов от таргетных генов и сигналов от центромерных зондов, расположенных ближе к ядерной мембране. Возможный итог слишком сильной ферментативной обработки показан на рис. 11.5.

Гибридизация зондов и отмывка

Гибридизация – следующий этап процесса, состоящий из двух фаз. При осуществлении этого этапа следует убедиться, что зонды связались с таргетными последовательностями. Сперва клеточная ДНК, как и меченные зонды, имеющие двухспиральное строение, подвергаются денатурации путем

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 111

Заключение в гистологическую среду и визуализация

После накрытия покровными стеклами, препараты необходимо оставить в темноте на 15 минут, чтобы DAPI окрасил весь ядерный материал. Стекла исследуют во флюоресцентном микроскопе. Важно использовать рекомендованные настройки фильтров, поскольку неправильный подбор и настройка фильтров снижают интенсивность наблюдаемого сигнала (см. главу 12, «Фильтры для FISH»).

Заключение

Правильная обработка фиксированных формалином и залитых в парафин тканей чрезвычайно важна для достижения корректных результатов FISH. Ключевым фактором для корректировки ферментативной обработки является время фиксации ткани. Для оценки правильности ферментативной обработки необходимо проверить уровень аутофлюоресценции, окраску DAPI и морфологию ядра (табл. 11.1). Распределение сигнала также дает ценную информацию о правильности ферментативной обработки. Оптимально обработанный образец характеризуется наличием интактных ядерных мембран, слабой аутофлюоресценцией и гомогенным окрашиванием DAPI. Референсные сигналы располагаются преимущественно по периферии ядра, а сигналы от исследуемых генов

наблюдается во внутренней части ядра, так как характеризуют богатый генами домен. И наконец,

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 113

участки с нормальными клетками могут служить контролем корректной ферментативной обработки. В нормальных клетках соотношение сигнала от исследуемого гена и от референсных последовательностей будет соответствовать соотношению в нормальной диплоидной клетке. Предпосылкой к использованию областей нормальных клеток, как контроля, является сходство воздействия фиксации на нормальные и злокачественные клетки.

Благодарности:

Мы благодарим Dr. Martina Schmidt, Scientist, and Dr. Oliver Stross, Progect Manager, Biomarker Analytics and

Bioinformatics, Targos Molecular Pathology Gmbh, Kassel, Germany за предоставленные иллюстрации (рис 11.2-11.3.).

114 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 12 | Фильтры для FISH

Dan Osborn

перевод Н.В. Даниловой

Возможности применения гибридизации in situ (ISH) расширились от короткоживующих изотопных методов, до очень специфичных, долгоживущих, многоцветных флюоресцентных методов (FISH). Улучшение оптики, технологии изготовления фильтров, микроскопов, камер, хранения информации, а также эффективность стоимости позволили FISH стать доступным многим исследователям.

Модификация метода mFISH (multiplex-FISH), совмещающее преимущества цифровой микроскопии, значительно улучшило возможности неизотопного обнаружения и анализа кратных последовательностей нуклеиновых кислот в хромосомах и генах [1].

Фильтры и флюоресцентная микроскопия

В прямом микроскопе флюоресцентный источник света располагается в эпифлюоресцентном положении (освещение сверху, падающим светом) по отношению к образцу. В этом канале смонтирован блок фильтров, состоящий из цветного светоделительного (дихроичного) зеркала, фильтра

Рис. 12.1. Строение флюоресцентного микроскопа: http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fl uorescence/

anatomy/fl uoromicroanatomy.html.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 115

Рис. 12.2. Строение типичного флюоресцентного куба фильтров. http://www.microscopyu.com/articles/fl uorescence/

fl uorescenceintro.html.

для выделения подходящих длин волн возбуждения (возбуждающий фильтр) и испускания (запирающий фильтр), которые требуются, чтобы значительно увеличить яркость и контрастность препаратов, даже при использовании нескольких флюорохромов. Рис. 12.1. иллюстрирует базовое устройство флюоресцентного осветителя на прямом микроскопе.

Основными компонентами микроскопа с эпископическим (освещение отраженным светом) освещением являются источник света (на рисунке изображена дуговая ртутная лампа), серия линз для фокусировки света и корректировки оптических аббераций в процессе прохождения луча через

фильтры, диафрагм для обеспечения правильного и равномерного освещения образца и турели фильтров, в которой размещается комплект фильтров. На рисунке схематически изображено, как от широкого луча возбуждающего света из источника с помощью возбуждающего фильтра, находящегося в турели фильтров, отделяется зеленый компонент, который отражается дихроичным зеркалом на образец. Красное флюоресцентное излучение возвращается обратно через линзу объектива, через зеркало и далее через запирающий фильтр попадает на камеру или в глаз наблюдателя.

Развернутая иллюстрация блока фильтров представлена на рис. 12.2. Возбуждающий фильтр показан желтым цветом, запирающий – красным для иллюстрации прохождения света через блок фильтров при использовании Texas Red.

Параметры фильтров

Полосные фильтры могут быть описаны несколькими способами. Наиболее общие – центральная длина волны (Center Wavelenght, CWL) или ширина спектра на уровне 50% амплитуды (Full Width Half

Maximum, FWHM) = ширина полосы пропускания; и нижняя (сге-on) и верхняя (cut-off) критическая

116 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Нижняя и верхняя критическая длина волны используются также для описания двух типов фильтров, известных как longpass, LP (highpass), фильтры (рис. 12.4) и shortpass, SP (lowpass), фильтры (рис. 12.5).

LP фильтр создан, чтобы отражать и/или абсорбировать свет специфической области спектра, переходить в область пропускания в районе нижней критической длины волны (на рис. 12.4. – 570 нм) и пропускать свет, имеющий большую длину волны. То есть пропускают много света в области длинных волн (90% или даже больше) и эффективно отсекают свет тех длин, которые короче

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 117