2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ

В качестве общей рекомендации к протоколу окраски: блокаторы ферментов следует применять перед нанесением антител. Однако, в некоторых случаях блокаторы ферментов могут влиять на ход иммуногистохимической реакции. Например, слабые растворы кислот, применяемые для блокирования эндогенной щелочной фосфатазы, могут менять пространственную ориентацию эпитопов, снижая интенсивность специфического взаимодействия. В этих случаях блокирование активности эндогенных ферментов необходимо проводить после нанесения первичных антител, но обязательно до системы иммунодетекции, меченной ферментом.

Протеиновый блок

Эти белоксодержащие реагенты применяются для подавления неспецифического реаги-

рования, возникающего в результате связывания антител и других используемых реагентов с различными компонентами ткани.

Антитела и системы детекции, применяемые в иммуногистохимии, в большинстве представлены белковыми компонентами, что создает возможности для неспецифического реагирования. Протеиновый блок вступает в конкурентное взаимодействие с неспецифическими сайтами связывания образца, тем самым уменьшая неспецифическое связывание антител. Так как места связывания блокируются перед (или во время) инкубации образца с другими иммуногистохимическими реагентами, неспецифический сигнал, который мог бы проявиться, полностью подавляется. Более развернутое обсуждение различных неспецифических белок-белковых взаимодействий, происходящих при IHC исследовании в тканях, и протеиновых блоков, которые можно применять для предотвращения этих взаимодействий, приведено в главе 17, «Фоновое окрашивание».

160 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

нении последних буферов следует помнить, что эти белки могут связываться с первичными антителами, снижая их чувствительность, а взаимодействие с вторичными антителами, применяемыми для IHC детекции, может обусловить появление ложноположительного результата.

Стабильность антител в растворе не может быть определена без проведения специальных исследований, которые направлены на валидацию стабильности первичных антител в растворе соответствующими методами и соблюдение срока их использования. Одно из преимуществ использования коммерческих разведенных (готовых к употреблению, RTU) первичных антител состоит в защите покупателя, что обеспечивается списком нормативных требований, предъявляемых к производителям реагентов. Производитель должен продемонстрировать устойчивость коммерческих реагентов в течение определенного периода, на основании чего устанавливается срок годности антител.

Важные моменты при выборе растворителя

•рН растворителя может играть определяющую роль в эффективности реакции;

•высокие концентрации хлорида натрия и азидов, часто применяемых в качестве консервантов коммерческих растворителей, могут снизить активность антител. Большая ионная сила может снизить специфическое окрашивание, изменяя взаимодействие антитела и антигена;

•в общем случае менее концентрированный раствор антител является менее стабильным.

•применение сильно разведенных растворов антител лучше прекратить за несколько дней до установленного срока снижения их стабильности;

•рН трис-буферов изменяется в зависимости от температуры. Всегда готовьте буферы при той температуре, при которой они будут использоваться и помните, что нагревание или охлаждение может привести к изменению рН ряда буферов, всегда используйте реагенты комнатной температуры;

•фосфатный буфер (PBS) стоит применять в качестве растворителя только в тех случаях, когда это оговорено производителем антител.

Промывочный буфер

Промывочный буфер следует использовать для удаления остатков реагента с образца ткани после каждого этапа реакции. Наиболее распространенные промывочные буферы, в том числе и коммерческие, состоят из смеси растворов трис-буфера (TBS) и фосфатного буфера (PBS).

Раствор трис-буфера (TBS)

Промывочные буферы, основанные на трис(гидроксиметил)аминометане, часто комбинируются с неионным детергентом Tween 20. В состав коммерческих промывочных буферов могут также входить консерванты, например, 0,01% азид натрия, которые предотвращают рост микроорганизмов в растворе и увеличивают срок годности реагента.

162 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Раствор фосфатного буфера (Phosphate-Buffered Saline, PBS)

PBS широко применяется в качестве промывочного буфера в IHC. Преимуществами фосфатного буфера является его способность снижать аутофлуоресценцию ткани при проведении иммунофлуоресцентного анализа и меньшая стоимость, чем Трис-буфера. Однако, в некоторых случаях PBS увеличивает неспецифическое окрашивание и может снижать специфичность некоторых антител (например, анти-CD30).

Советы по приготовлению и использованию промывочных буферов

•не рекомендуется использовать буферы по истечении срока годности, и смешивать старый и свежий растворы;

•не следует разводить реагенты более того, что указано производителем – при слишком сильном разведении может быть нарушена буферная емкость, ионная сила не будет оптимальной;

•на емкостях с растворами рекомендуется писать дату их приготовления, или когда они были распечатаны;

•нельзя смешивать разные типы буферов;

•для приготовления и разведения буферов следует использовать дистиллированную, деио-

низированную воду или воду высокой степени очитки. Не рекомендуется использовать проточную воду, так как в ней содержатся примеси металлов, неорганические ионы и другие примеси, которые могут взаимодействовать с иммуногистохимическими реагентами.

Усилители хромогенного сигнала для DAB

Хромоген DAB часто используется для визуализации продукта реакции в системах детекции, основанных на пероксидазе. Интенсивность реакции DAB, продукт которой обычно представляет

светло-коричневый преципитат, может быть усилена добавлением одного или смеси металлов. Добавление металла повышает осаждение продукта реакции DAB и придает осадку более темный цвет. Для этих целей используют медь, серебро, никель, золото и кобальт.

Осаждение металлами можно произвести непосредственно при реакции с DAB или отдельно, после обработки ткани DAB, после чего следует промыть ткань дистиллированной водой. Позднее применение предпочтительнее в тех случаях, когда необходим точный контроль интенсивности окрашивания; оптимальное время инкубации с «усилителями» окрашивания определяется эмпирически при контроле интенсивности осаждения хромогена (окрашивания) под микроскопом. Цвет

иинтенсивность конечного продукта реакции с DAB сильно зависит от использованного металла и концентрации его соли, но в большинстве случаев, обработанный преципитат интенсивнее окрашен

иболее выражен, чем необработанный (рис. 16.5). Так как соли металлов взаимодействуют только с продуктом реакции хромогена и пероксидазы, они не вносят значительного вклада в фоновое окрашивание. Время инкубации с осадителями должно определяться индивидуально в каждой лабора-

тории с учетом желаемого оттенка хромогена.

164 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 17 | Фоновое окрашивание

Helle Grann Wendelboe MS и Kristen Bisgaard BSc

перевод Л.В. Москвиной

Фоновое окрашивание – одна из самых распространенных проблем в иммуногистохимии, что связано с появлением новых иммуноферментных методов обработки гистологических образцов и

повышением чувствительности систем детекции. Фоновое окрашивание образцов ткани может быть обусловлено несколькими факторами, одни из которых специфичны для антител или систем иммунодетекции, другие носят общий характер. В этой главе используются такие термины, как «нежелательное специфическое окрашивание» – окрашивание, вызванное взаимодействием антител со специфическим эпитопом, – и «неспецифическое окрашивание», вызванное любым другим взаимодействием. Ниже описаны большинство причин фонового окрашивания, обусловленного антителами, методами детекции и общими факторами, а также предложены возможные пути решения этой проблемы.

Фоновое окрашивание, вызванное системами детекции

Иммунодетекция с использованием пероксидазы хрена

Активность эндогенной пероксидазы

В практических целях в иммуногистохимии активность эндогенной пероксидазы может быть определена как любая активность, приводящая к расщеплению H2O2. Эта активность свойственна большинству гемопротеинов, например, гемоглобину (эритроциты), миоглобину (мышечные клетки), цитохрому (моноциты, гранулоциты) и каталазам (печень и почки). Пероксидазная активность может выявляться в васкуляризированных областях тканей, в результате гемморагического пропитывания нефиксированной ткани.

Для подавления активности эндогенной пероксидазы в образцах тканей, фиксированных формалином, срез чаще всего инкубируют с 3% раствором H2O2 от пяти до десяти минут (рис. 17.1). Также применяется обработка ткани смесью метанола и перекиси водорода (11 частей 3% H2O2 и 4 части 100% CH3OH) в течение 20 минут, но этот метод не рекомендуется применять при выявлении поверхностных антигенов. В результате обработки метанолом, замороженные срезы могут слететь с предметного стекла. Активность эндогенной пероксидазы блокируется также при обработке смесью азида натрия и перекиси водорода [1]. В большинстве случаев при работе с тканью, фиксированной в формалине, активность эндогенной пероксидазы не влияет на интерпретацию специфического окрашивания. Если в ткани, фиксированной формалином, много кровь-содержащих элементов, то все же стоит провести блокирование активности эндогенной пероксидазы. Стоит также блокировать эндогенную пероксидазу при работе с выделенными клетками и замороженными срезами.

Для обработки образцов, содержащих много пероксидазы, можно использовать систему детекции, основанную на щелочной фосфатазе, а не на пероксидазе хрена, что позволит избежать

фонового окрашивания (рис. 17.1).

166 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Двойное окрашивание

Комбинация эндогенной пероксидазы и щелочной фосфатазы

Двойное окрашивание с использованием этих ферментов требует блокирования эндогенной активности обоих. Для достижения хорошего результата рекомендуется использовать Н2О2 для блокирования эндогенной пероксидазы и слабую кислоту для щелочной фосфатазы. Строгой последовательности в обработке нет: методика работает не зависимо от выбора первого шага. Также можно использовать реагенты, одноэтапно блокирующие эндогенную активность обоих ферментов.

Биотин-стрептавидиновые методы иммунодетекции

Эндогенная активность биотин-авидинового комплекса (EABA) регистрируется при использовании любой техники окрашивания, основанной на биотине, так как последний встречается во многих тканях. Биотин связан с ферментами и другими белками печени (гепатоциты), почек (эпителий канальцев) и лимфатических узлов (паракортикальные гистиоциты) (рис. 17.3). EABA обычно выявляется в цитоплазме, больше в замороженных срезах. Ткани, залитые в парафин, также сохраняют эндогенный биотин. Другие примеры EABA включают неиммунохимическое окрашивание миелина [2] и тучных клеток [3] (рис. 17.4) в замороженных и парафиновых срезах [3]. J.-I. Guesdon с соавт. [4] обнаружили EABA в гранулоцитах селезенки мыши.

EABA лучше всего подавляется последовательной обработкой срезов в течение 10-20 мин. перед окрашиванием: сначала 0,01-0,1% раствором авидина, затем 0,001-0,01% раствором биотина [5]. Молекула авидина имеет четыре сайта связывания с биотином, биотин может присоединить только одну молекулу авидина. В результате первого шага обработки срезов авидином, эндогенный биотин эффективно блокируется, вместе с тем в образце становится в три раза больше

сайтов связывания для биотина.

Это может привести к взаимодействию с антителами или системой детекции, обусловливая фоновое окрашивание. Вот почему важно блокировать эти дополнительные сайты связывания, инкубируя срез со свободным биотином.

Авидин – гликопротеин, на 10% состоящий из углеводов, имеет pl 10, – при физиологическом значении рН он связывается с лектиноподобными и отрицательно заряженными компонентами ткани.

Стрептавидин не содержит угле-

Рис. 17.3. Эндогенная экспрессия биотина в почке.

водов и имеет pl 5. Его применение

168 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/