2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ
.pdfГлава 4 |
Стандартизация иммуногистохимических методов |
|
|
|
|
подвергаются воздействию фиксатора. В действительности, практически всегда время фиксации неизвестно и не описано в документации. Сходным образом, время «до фиксации» (иногда назы-
ваемое «время ишемии» – после резекции, до погружения в фиксатор) не документируется, неизвестна его длительность и воздействие. По аналогии, другие этапы обработки ткани, дегидратация, импрегнация, хранение, депарафинирование и регидратация плохо согласованы и также не документируются. Наконец, применяющиеся методы демаскировки антигена (восстановления антигенности многих белков) также различаются. На основании опыта проведения IHC анализов [4, 6-18] пришли
к единодушному мнению, что этапы, перечисленные в рубрике «приготовление пробы» составляют наибольшую преграду для стандартизации и проблему, которую будет нелегко преодолеть.
Вэтом отношении более широкое использование RTU реагентов может иметь преимущество. Это не решает проблему стандартизации, но хотя бы способствует некоторому улучшению практических результатов. Как указано выше, обычно производители, которые выпускают на рынок RTU реагенты, проводят обширные внутренние исследования, которые подтверждают нормальную эффективность RTU реагента при исследовании на широком спектре FFPE тканей, которые были фиксированы в течение разных периодов времени и при разных условиях и содержат разные концентрации антигена. По этой причине использование тщательно проверенного RTU реагента вместе с системой детекции и протоколом, включая установленные условия для демаскировки антигена, может в некоторой степени компенсировать отсутствие стандартизации фиксации и обработки и, таким образом, способствовать общей стандартизации результатов IHC. Этот подход, по общему признанию, является эмпирическим и никаким образом не опровергает замечание о том, что наилучшей стратегией при наличии квалифицированных сотрудников является получение отдельно концентрированных первичных реагентов и вторичных реагентов для мечения, а также выполнение необходимого титрования для установления оптимального протокола для FFPE тканей, имеющихся в каждой лаборатории. Существенное значение при проведении оптимизационных исследований имеет наличие в лаборатории квалифицированных и опытных сотрудников, которых не так легко найти, в особенности если анализы IHC проводятся в не очень крупных учреждениях в относительно малом объеме. Даже
вкрупных академических центрах может присутствовать ограниченное количество квалифицированных специалистов-гистологов, которые также обучены основным иммунологическим методам. В таком случае при некоторых редко проводимых исследованиях хорошей альтернативой может служить использование RTU реагентов.
В«постаналитической» фазе (табл. 4.1.) надлежащая стандартизация интерпретации результатов для разных патологоанатомов также отсутствует [3, 10], особенно при использовании полуколичественных оценок [7, 8]. Интерпретация результатов IHC исследования обученным патологоанатомом, имеющим опыт использования IHC анализа, о котором идет речь, всегда должна сопровождаться
сравнением с соответствующим контролем. В идеале тот же патологоанатом должен участвовать в написании гистологического заключения. Тем не менее, такой подход сложно применить на практике в тех случаях, когда в учреждении имеется обширное хирургическое отделение и IHC сосредоточивается в одном лабораторном комплексе, в котором могут работать множество рассредоточенных по лаборатории патологоанатомов. При этих обстоятельствах проверка контролей должна осущест-
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 49
Стандартизация иммуногистохимических методов |
Глава 4 |
|
|
|
|
вляться опытными специалистами и патологоанатомами, и перед использованием IHC на биопсийном материале должна быть подтверждена соответствующая эффективность метода. Производители RTU реагентов, включая Dako, могут предоставить атласы типичных результатов окрашивания, которые полезны в практике патологоанатомов, имеющих дело с хирургической биопсийной патологией, для рассмотрения ожидаемых результатов окрашивания, особенно для редких исследований. Окончательная интерпретация с использованием анализа изображения является развивающейся тенденцией, которая со временем станет неотъемлемой частью IHC, поскольку является количественным методом [7, 8]. Тем не менее, анализ изображения и количественная оценка являются бессмысленными до тех пор, пока IHC метод не будет стандартизирован максимально, что, в свою очередь, требует интеграции и контроля максимально возможного количества компонентов исследования. Производители могут приблизиться к решению этой большой задачи для всех фаз, за исключением приготовления пробы, поскольку они имеют средства для разработки и внедрения в практику полных систем, от реагентов до процессоров, красящих аппаратов и анализа изображения, в то время как только немногие отдельные лаборатории могут выполнить данные условия. В связи с этим, RTU реагенты, вероятно, играют все возрастающую роль, поскольку производители считают сложным выпуск надежных интегрированных систем, если только также до максимально возможной степени не контролируют оптимизацию реагента и протоколы. Типовые лаборатории, вероятно, приветствуют такую позицию. В конце концов, этот подход отражает ход событий, которые произошли за последние четыре десятилетия с тех пор, как клинические лаборатории перенесли автоматизацию и стандартизацию.
Резюме
Имелось несколько точек зрения в отношении причины, по которой IHC окраски являются сложно воспроизводимыми. Консенсус был достигнут в том, что в этих причин несколько. Их можно легко распределить на три общие категории, представленые в табл. 4.1. В пределах каждой кате-
гории обобщены факторы, которые должны выполняться согласованно для проведения «общего исследования» [10, 16].
Разрешение проблем «преаналитической фазы» (приготовление пробы, фиксация) потребует общего сотрудничества невиданной степени, даже в случае согласованного мнения относительно того, чтобы использовать новый и лучший фиксатор. Мы понимаем, что имеется малая вероятность замены формалина на новый фиксатор в большом масштабе в следующем десятилетии.
Сходным образом имеются огромные научные и материально-технические проблемы, которые должны быть преодолены, при разработке и внедрении в практику набора универсальных эталонных образцов ткани для IHC анализа. В настоящее время рассматривается ряд предложений, касающихся внешних эталонных стандартов, основанных на клеточных линиях, искусственных тканях и пептидных комплексах, [4, 5] вместе с идеей разработки внутренних эталонных стандартов, в том числе и поддающихся количественному определению (QIRS) [7, 8], которые позволили бы провести калибровку IHC анализов в разных лабораториях. Для решения данных проблем требуется время и ресурсы.
50 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 4 |
Стандартизация иммуногистохимических методов |
|
|
|
|
В этой главе внимание было сконцентрировано на более быстром и практичном решении проблем, а именно использовании RTU реагентов. Широкое их применение, вероятно, приведет к
улучшению результатов IHC анализов в плане воспроизводимости в разные дни и в разных лабораториях. Использование RTU реагентов является эмпирическим и ни коим образом не опровергает замечание о том, что наилучшим вариантом в руках квалифицированных сотрудников является получение отдельно концентрированных первичных антител и вторичных реагентов для мечения с последующим выполнением необходимых титрований, разработкой оптимального протокола для каждого
нового антитела с использованием FFPE тканей. Последнее является огромной проблемой, выходящей за пределы возможностей многих лабораторий, и дорогим удовольствием в пересчете на реагенты
ииспользование контрольных тканей.
Вконечном счете, важнейшей движущей силой при внесении значимого изменения является преобразование образа мышления патологоанатомов, по крайней мере, следующего поколения относительного того, что конечный результат протокола IHC не является только «окраской». Он скорее является точным количественным иммунологическим анализом и должен быть выполнен только с такой степенью технической точности и контроля, которая соответствует требованиям любого другого иммунологического анализа, построенного по такому же принципу (а именно ELISA). ELISA является в клинической лаборатории «золотым стандартом» при проведении количественных анализов. Реагенты для ELISA закупаются в готовой форме со всеми сопутствующими реактивами, утвержденными протоколами, а также эталонными и калибровочными стандартами, для использования на предусмотренном оборудовании. Стандартизация исследований, выполняемых in vitro, является задачей более простой, хотя и там есть свои сложности и ограничения. В иммуногистохимии использование RTU реагентов вместе с проверенными системами детекции, установленными протоколами, рекомендованными контролями и автоматической обработкой представляют собой аналогичное решение, которое может привести к повышению надежности и эффективности IHC.
Литература:
1.Taylor C.R. Quality assurance and standartization in the immunohistochemistry // A proposal for the annual meeting of the Biological Stain Commission (June 1991). – Biotech Histotech. – 1992. – 67. – p. 110-117.
2.Taylor C.R. Report from the biological stain commis-
sion: FDA issues fi nal rule for classifi cation/reclassifi cation of immunochemistry (ICH) reagents and kits.
– Biotech Histochem. – 1998. – 73. – p. 175-177.
3.Taylor C.R. An exaltation of experts: concerted efforts in the standardization of immunohistochemistry //Appl Immunohistochem. – 1993. – 1. – p. 232-243.
4.Hammond MEH, Barker P., Taube S et al. Standard Reference Material for Her2 testing: report of a national institute of standards and technology sponsored consensus workshop // Appl Immunohistochem Mol Morph. – 2003. – 11. – p. 103-106.
5.Taylor CR, Cote RJ. Immunomicroscopy // In: A diagnostic Tool for the Surgical Pathologist. 3rd edition. – Saunders Elsevier. – 2006.
6.Taylor CR. Standardization in Immunohistochemistry: the Role of Antigen Retrieval in Molecular Morphology.
–Biotechnic & Histochemistry. – 2006. – 81. – p. 3-12.
7.Taylor CR. Quantifi able Internal Reference Standards for Immunohistochemistry; the measurement of quantity by weight // Applied Immunohistochem Mol Morph.
–2006. – 14. – p. 253-259.
8.Taylor CR, Levenson RM. Quantifi cation of Immunohistochemistry – issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment // Histopathology. – 2006. – 49. – p. 411-424.
9.Miller RT, Swanson PE, Wick MR. Fixation and epitop retrieval in diagnostic immunohistochemistry: A con-
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 51
Стандартизация иммуногистохимических методов |
Глава 4 |
|
|
|
|
cise rewiew with practical considerations // Appl Immunohistochem Mol Morph. – 2000. – 8. – p. 228-235.
10.Taylor CR. The total test approach to standardization of immunohistochemistry // Arch Pathol Lab Med. – 2000. – 124. – p. 945-951.
11.Shi S-R, Gu J, Cote RJ, et al. Standardization of routine immunohistochemistry: where to begin? // In: Shi S-R, Gu J, Taylor CR eds. Antigen retrieval technique: immunohistochemistry and molecular morphology. – Natick, MA: Eaton, 2000. – p. 255-272.
12.Rhodes A, Jasani B, Balaton AJ et al. Study of interlaboratory reliability and reproducibility of estrogen and progesterone receptor assays in Europ. Documentation of poor reliability and identifi cation of insuffi cient microwave antigen retrieval time as a major contributory element of unreliable assays // Am. J Clin Pathol. – 2001. – 115. – p. 44-58.
13.Rait VK, O’Leary TJ, Mason JT. Modeling formalin fi xation and antigen retrieval with bovine pancreatic ribonuclease A: I-Structural and functional alterations // Lab Invest. – 2004. – 84. – p. 292-299.
14.Rait VK, Xu L, O’Leary TJ, Mason JT. Modeling formalin fi xation and antigen retrieval with bovine pancreatic Rbase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity and heat treatment // Lab Invest. – 2004. – 84. – p. 300-306.
15.Wolff AC, H Wolff AC, Hammond EH, Schwartz JN et al. ASCO/CAP Guideline Recommendations for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 testing in Breast Cancer // Arch Pathol Lab Med. – 2007. – 131. – p. 18-43.
16.Goldstein NS, Hewitt SM, Taylor CR, Yaziji H, Hicks DG and Members of Ad-Hoc Committee on Immunohistochemistry Standardization. Recommendations for Improved Standardization of Immunohistochemistry // Appl Immunohistochem Mol Morphol. – 2007.
– 15. – p. 124-133.
17.Yaziji H, Taylor C, Goldstein N, Dabbs D, Hammond E, Hewlett B, Floyd A, Barry TS, Martin A, Badve S, Baehner F Cartun R, Eisen R, Swanson P, Hewitt S, Vyberg M, Hicks D. and Members of of Standardization Ad-Hoc Consensus Committee. Consensus Recommendations on Estrogen Receptor Testing in Breast Cancer By Immunohistochemistry // Appl Immunohistochem Mol Morphol. – 2008. – 16. – p. 513-520.
18.Yaziji H, Taylor CR. Begin at the beginning with the tissue! The key message underlying the ASCO/CAP Task-Force Guideline Recommendations for Her2 Testing // Appl Immunohistochem Mol Morphol. – 2007. – 15. – p. 239-241.
52 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 5 | Фиксация и проводка материала
A.J. Farmilo PhD, Ronald H. Stead PhD
перевод Н.В. Даниловой
Со времени первого издания этой книги в 1983 году [1] иммуногистохимия развивалась быстрыми темпами. Движущей силой развития была потребность в стандартизации. Если окрашивание ткани будет давать сравнимую, воспроизводимую диагностическую информацию, иммуногистохимия может превратиться из «формы искусства» в науку. Такая эволюция требует количественного анализа, воспроизводимости методики и сопоставимости результатов.
Одной из форм «иммуногистохимического искусства» являются процессы фиксации и проводки материала. Профессионалы лабораторного дела находятся немного ближе к унификации этой части процесса, однако признают, что стандартизация остается одной из наиболее трудных задач в диагностической работе.
Фиксация
Часть поставленной задачи – это итоговое количество антигена в каждом образце ткани и тот факт, что на многих этапах процесса IHC антигены разрушаются. Это особенно важно на критическом этапе фиксации ткани, так как это этап на котором мы умышленно пытаемся изменить структуру белков с целью предохранить их от вымывания, деградации или других изменений, которые могут происходить в нормальной нефиксированной ткани.
Кроме предотвращения деградации или вымывания антигена, фиксация также должна сохра-
нять распределение антигена (ядерное, цитоплазматическое или мембранное) и, насколько это возможно, его вторичную и третичную структуру, чтобы обеспечить сродство для антител, которые в дальнейшем будут использоваться для обнаружения антигена.
Существует множество примеров, в которых плохая или неадекватная фиксация приводит к
неверной интерпретации результатов окрашивания. Один из примеров – перемещение белка эстрогенного рецептора из ядра в цитоплазму. В такой ситуации антиген обнаруживается в цитоплазме клетки и окрашивание считается положительным. Однако локализация этого антигена должна быть ядерной и поэтому в диагностическом смысле такая окраска бессмысленна.
Для демонстрации важности фиксации, а также взаимодействия антиген-антитело, может быть использован тот же антиген. Фиксация ткани в нейтральном забуференном формалине может приводить к деструкции эпитопа, против которого работают некоторые моноклональные антитела. При использовании этих антител окрашивание отсутствует, в то время как использование антител против другого эпитопа, не разрушенного при фиксации, приводит к «положительной» реакции.
Каково решение этой сложной проблемы? Стандартизация растворов для фиксации и протоколов фиксации может быть идеальным началом. Многие реагенты для фиксации разрабатывались годами, однако в итоге в качестве возможных «стандартов» были предложены два варианта, но до сих пор ни один из реагентов не был признан идеальным для всех маркеров, антител и методик. Таким
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 53
Фиксация и проводка материала |
Глава 5 |
образом, стандартизация и проверка достоверности должна быть направлена на конкретные антитела и относящиеся к ним протоколы окраски.
Принятие общей процедуры фиксации также крайне важно и необходимо для получения воспроизводимых результатов. Это значит, что подготовка реагентов должна быть идентична всякий раз, при осуществлении конкретного протокола. Реагенты и протоколы нуждаются в валидации (проверка достоверности, обоснование, аттестация), которая включает в себя установление срока годности реагентов, оптимального времени фиксации и таких условий как температура и влажность. Многие реактивы для фиксации представляют собой смесь из реактивных (в смысле способных на химическую реакцию) и умеренно токсичных реагентов и нам практически ничего не известно о том, какие точно реакции происходят внутри. Например, приготовление формалина значительно варьирует, поэтому концентрация альдегидов, кислот и других производных может меняться со временем при хранении. Таким образом, от продукта к продукту будет разный состав.
Валидация – это первый этап по двум причинам: во-первых, необходимо убедиться, что конкретная стандартизованная процедура дает сопоставимые и диагностически ценные результаты. Во-вторых, определить пределы вариабельности процедуры, при которых по результатам данного протокола будут по-прежнему получаться такие результаты. Например, пользователи могут оценить качество фиксации используя разное время фиксации в 0, 4, 8, 12, 24 и 36 часов, а также 5, 15 и 30 дней. Для данной комбинации антигена и антитела можно обнаружить, что 0, 4 и 8 часов фиксации дают субоптимальные результаты, возможно из-за неполной фиксации антигена и его диффузии внутри клетки и ткани. Оптимальной оказывается фиксация от 12 часов до 5 дней. Результат фиксации в течение 15 и 30 дней также субоптимальный из-за гиперфиксации. Таким образом, для оптимальной фиксации ткани требуется минимум 12 часов и максимум 5 дней.
С практической точки зрения можно сказать, что требуется фиксация в течение ночи, что фиксация в течение выходных также будет нормальной однако более длительная фиксация не
полезна. С учетом данной информации, пользователь сможет оценить результаты полученные на тканях из внешних источников, основываясь на времени фиксации.
Для небольших лабораторий работа по проведению валидации может быть затруднительна, но есть две альтернативы. Пользователи могут выбрать систему с уже стандартизованным и валидизированным протоколом и валидизированную систему интерпретации. Такую возможность предоставляют коммерчески приобретаемые наборы (kit) и, если точно следовать инструкциям, приложенным к набору, можно получить диагностически полезные результаты. Второй путь – использовать одну из наиболее общепринятых «стандартных» схем с применением стандартных фиксирующих реагентов и известных антител, для которых опубликованные данные свидетельствуют о нормальной функциональности. Как пример, лаборатория может использовать 10% нейтральный забуференный формалин и стандартный протокол стрептавидин-биотиновой HRP системы, используя комбинацию моноклональных антител AE1/AE3. Это сочетание доказано работает при выявлении цитокератинов в образцах.
54 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 5 |
Фиксация и проводка материала |
Манипуляции с образцами
Компьютерная поговорка «мусор на входе – мусор на выходе» (принцип программирования, в соответствии с которым неверные входные данные не могут привести к правильному результату) может быть применима и к иммуногистохимии, так как первые манипуляции с тканью определяют качество получаемого результата, в большей степени, чем все последующие шаги. Поэтому необходимо понимать, что «первым шагом» в данном случае является момент, когда ткань становится образцом, то есть фиксация. Некротическая деградация начинается сразу же после того, как ткань отделяется от источника питания, таким образом время, от момента забора ткани до начала фиксации очень часто становится критичным. Для большинства иммуногистохимических методик важно, чтобы ткань не была засушена. Образец после хирургического удаления необходимо помещать во влажную фильтровальную бумагу или марлевую салфетку в закрытый контейнер, далее необходима как можно более скорая доставка в гистологическую лабораторию для дальнейшей фиксации и проводки.
Далее ткань должна быть вырезана для фиксации. Область интереса необходимо порезать на кусочки не более двух квадратных сантиметров и толщиной не более четырех миллиметров. Толщина очень важна. Фиксирующий раствор должен хорошо проникать в ткань, чтобы фиксация была эффективной. Желательно быстрое пропитывание фиксирующим раствором – чем тоньше ткань, тем быстрее она профиксируется.
Наиболее часто используемый для фиксации реагент – 10% раствор нейтрального забуферен-
ного формалина (табл. 5.1.). Он быстро проникает в ткань, а затем медленно ее фиксирует. Формалин особенно хорошо фиксирует маленькие молекулы, такие например как гормоны [2]. Очень важно соблюдать оптимальное время фиксации, которое может варьировать от одной комбинации антигенантитело к другой. В общей ситуации, приемлемо 6-12 часов, но иногда требуется более длительная фиксация. Чрезмерная фиксация будет создавать проблемы, так как из-за кросс-связывания формалин может маскировать эпитопы, необходимые для выявления. Наиболее часто используемый метод для устранения этих проблем – нагревание профиксированной ткани в дистиллированной воде до температуры 95°С в течение 15-20 минут. Это будет обсуждаться далее в этой главе, как часть общего процесса окрашивания.
Таблица 5.1.
10% НЕЙТРАЛЬНЫЙ ЗАБУФЕРЕННЫЙ ФОРМАЛИН, РН7 (10% NBF)
Формалин (40% формальдегид) |
100 мл |
|
|
Двухосновный натрия фосфат, безводный |
6,5 г |
|
|
Моноосновный натрия фосфат, моногидрат |
4,0 г |
|
|
Дистиллированная вода |
900 мл |
|
|
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 55
Фиксация и проводка материала |
|
|
Глава 5 |
|||
|
|
|
|
|
|
|
Существует множество |
|
|
|
|
Таблица 5.2. |
|
других реагентов для фиксации и |
|
|
ФИКСАТОР В5 |
|
|
|
значительный объем литературы, |
|
|
|
|
|
|
описывающей ситуации, при |
|
|
Хлорид ртути |
60 г |
||
которых один из этих реагентов |
Реагент А: |
|
|
|
|
|
|
Ацетат натрия |
12,5 г |
||||
лучше чем другой. Некоторые |
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Дистиллированная вода |
1000 мл |
|||
реагенты будут обсуждаться |
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
далее в этой главе. Существуют |
Реагент Б: |
|
10% нейтральный |
|
|
|
|
забуференный формалин |
|
|
|||
|
|
|
|
|||
методики, предпочитащие замо- |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
розку и нарезку образца, нежели |
Рабочий раствор состоит из 90 мл реагента А и 10 мл реагента Б |
|||||
чем фиксацию. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Формалин всегда должен |
|
|
|
|
|
|
быть свежим (известно о форми- |
|
|
|
|
Таблица 5.3. |
|
ровании муравьиной кислоты в |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
растворах формальдегида со |
|
|
ФИКСАТОР ZENKER |
|
|
|
временем) и забуференным, с |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
рН фиксированным в диапазоне |
|
|
|
|
|
|
7.0-7.6. Так как это медленно |
Дистиллированная вода |
|
900 мл |
|||
|
|
|
|
|
|
|
реагирующий фиксант, кислые |
|
|
|
|
|
|
Дихромат калия |
|
|
25 г |
|||
примеси могут индуцировать |
|
|
|
|
|
|
Хлорид ртути |
|
|
50 г |
|||
структурные и антигенные изме- |
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
Ледяная уксусная кислота |
|
50 г |
||||
нения в ткани, приводящие к |
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
некачественной морфологии и |
УКАЗАНИЕ: Время фиксации от 4 до 24 часов, с промывкой |
|
||||
низкому уровню обнаружения |
|
|||||
в течение ночи или удалением кристаллов хлорида ртути. |
|
|||||
антигена. |
Процесс завершается одной промывкой в 0,5% растворе |
|
||||
|
йода в 70% этаноле и второй промывкой в 5% водном |
|
||||
Существуют другие осно- |
растворе тиосульфата натрия |
|
|
|||
ванные на альдегидах реагенты |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
для фиксации, например исполь- |
|
|
|
|
|
|
зующие за основу глютаральдегид, однако они все действуют подобно 10% NBF и используются гораздо реже.
Другой класс фиксирующих веществ, широко использовавшихся в прошлом – реагенты на основе хлористой ртути (табл. 5.2., 5.3.). Они не образуют альдегидных связей, однако реагируют с большим количеством остатков аминокислот, такими как тиолы, аминогруппы, имидазольные, фосфатные и гидроксильные группы. Положительным свойством является более короткое время фиксации, порядка 5-8 часов. Недостатком – высокая токсичность хлорида ртути и особые требования к утилизации. По этим причинам, а также из-за наличия большого количества возможных альтернатив, данный реагент практически не используется в лабораториях сегодня.
56 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 5 |
Фиксация и проводка материала |
|
|
Фиксирующие реагенты на основе спирта
К данному классу относятся растворы Carnoy’s, Methacarn и другие. Изначально они использовались для иммуногистохимии в попытке предотвратить маскирование антигенов, вызванное формалиновой фиксацией или при использовании моноклональных антител, эпитопы которых полностью разрушались под воздействием формалина. Эти реагенты обычно находят применение при окрашивании лимфоидной ткани на CD-специфичные маркеры или на иммуноглобулины (IgA, IgM).
Тетраоксид осмия используется в первую очередь при электронной микроскопии, ацетон – для фиксации замороженных срезов. Другие фиксанты используются с исследовательскими целями на специальных тканях, органах или целых организмах, и не обсуждаются в данном руководстве.
Последний класс реагентов, который становится все более значимым это «комбинированные реагенты». В их состав часто входят спирт и формалин, кальций или тяжелые металлы, а также какой-либо буфер. Многие из них являются коммерческими и поэтому точный состав не раскрывается производителем. Большинство производителей имеют своей целью поиск универсального фиксирующего реагента, с помощью которого можно стандартизовать этот этап IHC. Чтобы называться универсальными, эти реагенты также должны воздействовать на РНК и ДНК для генетических исследований фиксированной ткани [3, 4, 5].
Однако, многие из реагентов, особенно коммерческие (например, Omnifi x II производства AnCon Genetics) не были приняты как стандартные реагенты для фиксации.
Специализированная подготовка ткани
Ни один разговор о реагентах для фиксации не может быть полным без упоминания нескольких популярных в прошлом специализированных способов подготовки ткани. Для некоторых видов исследований, например для исследования лимфатических узлов, были необходимы замороженные срезы. Их использование было продиктовано разрушением антигена под действием формалина или необхо-
димостью анализа толстых срезов (10 мкм) нервной ткани для изучения аксонов. Начало использования температурной демаскировки антигена в горячей воде значительно сократило сферу применения замороженных срезов.
Сейчас первой причиной, по которой в современной практике используются замороженные срезы, является необходимость быстрой постановки диагноза и поэтому сокращение времени, которое тратится на фиксацию, проводку и депарафинирование. Также замороженные срезы используются в случае прямой и непрямой иммунофлуоресценции, где формалиновая фиксация дает более слабые результаты. Замороженные срезы необходимо фиксировать в ацетоне (при комнатной температуре,
5 сек) перед хранением. Затем они переносятся в охлажденный ацетон (4°С, 10 мин) и затем регидратируются в буфере в течение 5 минут перед иммуногистохимических окрашиванием.
Мазки крови, отпечатки ткани, культуры клеток или очищенные клетки могут быть исследованы как в свежем состоянии, так и в фиксированном. Клетки можно отцентрифугировать с образованием
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 57
Фиксация и проводка материала |
Глава 5 |
плотного осадка, который затем фиксируется как обычная ткань. Или рыхлый осадок переносится на стекло и клетки также фиксируются ацетоном или 10% NBF в течение 10 минут.
Важно инкубировать стекло в растворе эндогенной пероксидазы перед окрашиванием, если в материале большое количество эритроцитов, так как содержащаяся в них эндогенная пероксидаза дает ложноположительное окрашивание.
Наконец, многие из новейших методов фикации предполагают обработку в микроволновой печи, как для собственно фиксации, так и для ее ускорения [6]. Прямая микроволновая фиксация происходит благодаря температуре и первичной коагуляции белков. В сопряжении с обычными реагентами для фиксации микроволновая обработка ускоряет процесс путем нагревания раствора. Возможно также, что тепло ускоряет пенетрацию раствора путем расслабления структуры ткани.
Проводка ткани и стекол
После фиксации последующие шаги оказывают небольшое влияние на обнаружение антигена. Различные вариации процедуры проводки в отношении применения ксилола, спиртовой регидратации, температуры парафина, времени, протокола, используемого оборудования дают удовлетворительные результаты в большинстве случаев. Сформулируем некоторые базовые принципы проводки:
•Ни на одном этапе температура ткани не должна превышать 60°С, так как это может вызвать значительную температурную деградацию антигенов, которая затем может быть необратима.
•Фиксирующая среда должна быть заменена парафином через серию растворов, которые включают в себя растворы спирта в возрастающей концентрации, затем ксилол, затем горячий парафин. Парафин необходим чтобы обеспечить стабильность и эластичность ткани.
•Толщина срезов должна составлять 3-4 мкм и не должна быть больше 5 мкм. Толстые срезы имеют множество слоев клеток, что затрудняет интерпретацию.
•После микротомии срезы помещаются в емкость с водой и далее перемещаются на стекла, покрытые адгезивным составом. Некоторые коммерчески продаваемые стекла имеют положительный заряд на поверхности, который притягивает отрицательно заряженные тканевые белки. Стекла также могут быть обработаны альбумином или лизином, каждый из которых будет создавать «липкую» поверхность для получения ровных, хорошо прикрепленных срезов на стекле. Неровные срезы или имеющие неадгезированные участки могут оторваться от стекла во время процедуры иммуногистохимического окрашивания.
•Со срезов необходимо полностью удалить парафин для того, чтобы антитела, находящиеся в водном растворе могли связываться с антигенами и проникать в ткань. Это достигается нагреванием стекол до 60°С для размягчения парафина и применение алгоритма обратного описанному в пункте 2. Стекла помещаются в ксилол, далее в 100% спирт, далее в растворы с постепенным снижением концентрации спирта до полностью водного раствора. Обратите внимание, что через 250 мл ксилола могут пройти не более 50 стекол, далее ксилол стано-
58 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/