2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ
.pdf
Глава 12 |
Фильтры для FISH |
|
|
|
|
Спектр поглощения Су 3 Спектр излучения Су 3 Спектр поглощения FITC Спектр излучения FITC
Возбуждающий фильтр XF 100-2 Запирающий фильтр XF 100-2
Длина волны, нм
Рис. 12.7. FITC и Су 3: стандартный широкополосный фильтр.
дартный набор будет работать прекрасно при 2-х, 3-х и 4-хцветном анализе, однако спектральное перекрытие может стать проблемой. Например, FITC частично визуализируется через Cy3 фильтр, а Cy3.5 может быть виден через Cy5 фильтр.
Рис. 12.6. отображает пять хромосомных пар, помеченных разным образом, перекрытие между каналами показано стрелками на верхнем среднем и нижнем левом рисунках. Правый нижний рисунок
– результат наложения картинок из разных серий.
Нормализованные интенсивности
Длина волны, нм
Рис. 12.8. FITC и Су 3: узкополосный mFISH фильтр для FISH.
Спектр поглощения Су 3 Спектр излучения Су 3 Спектр поглощения FITC Спектр излучения FITC Возбуждающий фильтр XF 100-2 Запирающий фильтр XF 100-2
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 119
Фильтры для FISH |
Глава 12 |
|
|
Нормализованные интенсивности
Длина волны, нм
Спектр поглощения Су 3 Спектр излучения Су 3 Спектр поглощения Су 5 Спектр излучения Су 5 Спектр поглощения Су 2 Спектр излучения Су 2 Возбуждающий фильтр Су 2 Запирающий фильтр Су 2 Возбуждающий фильтр Су 3 Запирающий фильтр Су 3 Возбуждающий фильтр Су 5 Запирающий фильтр Су 5
Рис. 12.9. Узкополосные с фильтры с крутым фронтом используемые для разделения трех
флюофоров в спектральном окне длиной менее 300 нм.
Чтобы снизить спектральное перекрытие близких флюофоров на мультицветных схемах, необходимы специализированные узкополосные наборы фильтров. Возбуждающие фильтры с шириной полосы 10-20 нм и запирательные фильтры 20-40 нм обеспечивают специфичность, необходимую для достижения уровня чувствительности и спектрального разрешения требуемых в mFISH. Рис. 12.7. демонстрирует профиль стандартного широкополосного FITC фильтра, наложенный на спектры поглощения и излучения FITC и Cy3. Несмотря на то, что фильтры создаются для пропускания области под кривыми поглощения и излучения, здесь наблюдается значительное перекрытие с кривыми как поглощения, так и излучения Су3, что приводит к загрязнению канала FITC сигналом от Су3.
Решение проблемы приведено на рис. 12.8, где полосы возбуждения и запирания были сужены для улучшения спектрального разрешения FITC от Су3, особенно полосы запирания. При помощи ограничения красного края запирательного фильтра достигается уменьшение области под кривой излучения Су3 примерно в 4 раза.
С помощью применения стратегии узкополосных фильтров с крутым фронтом в спектральное окно можно добавлять несколько флюоресцентных проб без риска получить перекрытие флюоресценции между флюофорами. Это показано на рис. 12.9, где три флюофора эффективно разделены внутри спектрального окна шириной менее 300 нм.
В данную схему может быть легко добавлен четвертый краситель, например Су3.5 в область 570-620 нм, однако этого не было сделано, чтобы не перегружать рисунок.
Необходимо иметь специализированный набор фильтров, соответствующих друг другу, чтобы обеспечить оптимальное использование доступной полосы для каждого mFISH флюофора.
В табл. 12.1. собраны наборы фильтров Omega Optical для наиболее распространенных флюофоров, используемых в mFISH, и согласованными полосами возбуждения и запирания. Обратите
120 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 12 |
Фильтры для FISH |
|
|
|
|
внимание, что все имеют индивидуальные наборы флюофоров, кроме XF231 и 232, в которых используются индивидуальные возбуждающие фильтры для каждого красителя и трехполосные дихроичные и запирающие фильтры. В этом наборе минимизируется регистрационный сдвиг и движение микросокпа, поскольку требуется только движение внешнего слайдера с фильтрами или колеса для возбуждения разных красителей, в то время как мульти полосные дихроичные и запирающие фильтры остаются неподвижными в турели микроскопа.
Таблица 12.1
НАБОРЫ ФИЛЬТРОВ ДЛЯ НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫХ ФЛЮОРОФОРОВ
Наименование набора |
Флюофоры |
Фильтры |
|
|
|
Возбуждающий: 365/50 |
|
|
|
||
XF06 |
DAPI, AMCA |
Дихроичный: 400DCLP |
|
|
|
Запирающий: 450/65 |
|
|
|
|
|
|
|
Возбуждающий: 436/8 |
|
XF201 |
DEAC |
Дихроичный: 455DRLP |
|
|
|
Запирающий: 480/30 |
|
|
|
|
|
|
|
Возбуждающий: 485/20 |
|
XF202 |
FITC, Cy2 |
Дихроичный: 505DRLP |
|
|
|
Запирающий: 530/30 |
|
|
|
|
|
|
|
Возбуждающий: 520/18 |
|
XF203 |
Alexa 532 |
Дихроичный: 545DRLP |
|
|
|
Запирающий: 565/20 |
|
|
|
|
|
|
Cy3, TRITC, |
Возбуждающий: 546/10 |
|
XF204 |
Дихроичный: 555DRLP |
||
Alexa 546 |
|||
|
Запирающий: 580/30 |
||
|
|
||
|
|
|
|
|
|
Возбуждающий: 572/15 |
|
XF206 |
Cy3.5 |
Дихроичный: 590DRLP |
|
|
|
Запирающий: 620/35 |
|
|
|
|
|
|
Texas Red, |
Возбуждающий: 580/20 |
|
XF207 |
Дихроичный: 600DRLP |
||
Alexa 594 |
|||
|
Запирающий: 630/30 |
||
|
|
||
|
|
|
|
|
Cy5, |
Возбуждающий: 640/20 |
|
XF208 |
Дихроичный: 650DRLP |
||
Alexa 647 |
|||
|
Запирающий: 682/22 |
||
|
|
||
|
|
|
|
|
|
Возбуждающий: 665/32 |
|
XF210 |
Cy5.5 |
Дихроичный: 692DRLP |
|
|
|
Запирающий: 710/40 |
|
|
|
|
|
XF231 |
DAPI/ FITC/ |
|
|
TRITC |
Индивидуальные возбуждающие фильтры для |
||
|
|||
|
|
каждого красителя могут находиться во внешнем |
|
|
|
||
XF232 |
DAPI/FITC/ |
кольце фильтров, а трехполосные дихроичные и |
|
Texas Red |
запирающие в держателе фильтров |
||
|
|
||
|
|
|
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 121
Фильтры для FISH |
Глава 12 |
|
|
В дополнение к использованию специализированных наборов фильтров для протоколов mFISH, есть и другие параметры, которые улучшают качество изображения, например широкополосное антиотражательное покрытие и шлифовка стеклянной основы фильтра.
Антиотражательное покрытие усиливает пропускание фильтра, снижая вторичное отражение с его стеклянной поверхности. Это приводит к увеличению пропускной способности фильтра почти на 7%. Такое покрытие на возбуждающих фильтрах и дихроичных зеркалах снижают эффект «призрачной картинки», иногда получающейся в оптическом канале с множеством отражающих поверхностей.
Шлифовка стеклянной основы также чрезвычайно важна для возбуждающих и дихроичных фильтров. Подвергая стеклянную основу, из которой изготавливается фильтр, двусторонней шлифовке, можно добиться высокой степени параллельности поверхностей (равной толщины). Эта обработка сокращает значительные отклонения луча, таким образом обеспечивая минимальный регистрационный сдвиг при быстром переключении между наборами фильтров.
Заключение
Методы FISH и mFISH, используемые вместе с флюоресцентными микроскопами высокой разрешающей способности, имеющие возможности автоматизированной цифровой визуализации, являются очень эффективными и могут использоваться во многих областях биологии, начиная от простых исследовательских работ и заканчивая пренатальной диагностикой заболеваний, исследованием опухолей и цитогенетикой.
При использовании флюоресцентного микроскопа необходим тщательный анализ образца и системных компонентов, чтобы подобрать правильные фильтры для обнаружения зонда. Использование мультиполосных дихроических и запирательных фильтров в стационарной турели с индивидуальными возбуждающими фильтрами, размещенными во внешнем слайдере или колесе,
обеспечивает высоко синхронизированную картину без регистрационного сдвига, однако при таком способе приходится мириться со снижением яркости, трудностями настройки цветового баланса и низкой разрешающей способностью полупроводниковой CCD камеры.
Если приоритетными целями являются чувствительность, высокое спектральное разрешение и минимальное выцветание под действием света, лучшим выбором будет использование индивидуальных узкополосных фильтров совместно с черно-белой CCD камерой. Регистрационный сдвиг изображения минимизируется с помощью полировки стеклянной основы фильтра, а также с помощью цифровой коррекции путем установки параметров «нулевого сдвига».
Количество и тип флюоресцентных зондов также играет большую роль в оптимизации настроек фильтров. Для небольшого количества зондов с адекватным спектральным разделением возможно использование стандартного набора широкополосных фильтров. В протоколе, в котором используются 5-6 зондов, необходимо использовать специфические для каждого флюофора узкополосные фильтры, для снижения спектральное перекрытие.
122 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 12 |
Фильтры для FISH |
|
|
Вместе с развитием методологии FISH и mFISH развивается и компьютерное программное обеспечение, используемое для анализа информации, заключенной в образце. Желательна правильная комбинация фильтров, красителей и программного обеспечения для достижения оптимального разрешения и контраста при тщательной фиксации и анализе образца.
Устранение ошибок
Если отсутствует картинка:
1.Проверьте включен ли флюоресцентный источник света и чиста ли лампа. Свет обычно можно видеть освещая образец, если только его длина волны не меньше 400 нм (возбуждение DAPI).
2.Проверьте, что изображение отправляется на правильный порт, камеру или окуляр.
3.Правильный блок фильтров установлен для желаемого флюофора.
4.Если желаемая длина волны возбуждения флюофора больше, чем 670 нм (Cy5), то она невидима большинством глаз. Если ее не видит камера, проверьте, чтобы на ней не было фильтра, блокирующего инфракрасное излучение.
Если изображение имеет значительное загрязнение от других флюофоров:
1.Убедитесь, что стоит правильный индивидуальный фильтр для красителя.
2.Возможно, не используется LP возбуждающий фильтр или широкополосный фильтр.
Литература:
1.Brenner M., Dunlay T., and Davidson M. (n.d.). Fluorescent in situ hybridization: Hardware and software implications in the research laboratory. Retrieved October 7, 2008, from Molecular Expressions Microscopy Primer Web Site: http://www.microscopyu.com/ articles/fl uorescence/insitu/brennerinsitu.html
2.Henegariu O., 2001. Multi-color FISH. Retrieved October 8, 2008, from Tavi’s Multicolor FISH Page: http:// info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/fi12.html
3.Johnson B. 2006. Anti-refl ection Coatings. Omega Optical Application Note.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 123
Глава 13 | FISH визуализация
George L. Kumar PhD и Robert M. Zucker PhD
перевод Н.В. Даниловой
FISH имеет широкие возможности для обнаружения хромосомных аномалий в опухолевых клетках и одним из наиболее часто использующихся методов при изучении структурной цитологии клеточного ядра. Этот метод дает надежные сведения для изучения генетического состава клетки, как во время митоза, так и в интерфазе. FISH имеет высокую чувствительность (обнаружение индивидуальных генов) и высокую множественность (то есть в одном препарате могут быть использованы несколько зондов) [1-3]. Наиболее распространенными методами FISH визуализации являются: системы проточной цитометрии и системы анализа тканевых образцов. В проточных системах, окрашенные с помощью FISH клетки входят в состав суспензии, которую пропускают через узкое отверстие мимо лазерного пучка, где фиксируется интенсивность их флюоресценции [4]. В системах анализа тканевых образцов окрашивание FISH осуществляется на гистологических срезах и оценивается как статичная картина. В зависимости от сложности обеих систем используется лазерный или нелазерный источник света. В этой главе будут обсуждены важные технические условия, касающиеся микроскопа и других инструментов, являющиеся ключевыми для получения качественных FISH изображений, приняв во внимание, что образец правильно обработан и используется высокоэффективный флюофор с высоким квантовым выходом. Для более подробного описания технических аспектов приводятся, там где это возможно, ссылки на первоисточники, позволяющие получить детальное объяснение, анимацию и другие полезные материалы.
Оптимальные характеристики микроскопа
Получение качественных FISH изображений зависит от многих факторов, таких как числовая апертура (numerical aperture, NA) объектива, настройка освещения по Köehler, полевая диафрагма, рефракционный индекс заливочной среды, толщина покровного стекла, стабильность источника
света, толщина среза, соотношение длин волн возбуждения и излучения. Эти факторы влияют на базовые параметры оптической системы, такие как функция рассеивания точки (point spread function, PSF), разрешение (см. приложение в конце главы), оптическое (или конфокальное – http:// www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/index.html) разделение, светосила оптики и величина хроматических аббераций. Кроме того важно иметь линзу для колокализации флюоресцентных пикселей. Как широкопольная, так и конфокальная системы зависят от качества линз и правильной центровки оптической системы микроскопа [5-11].
До появления методов цифровой регистрации изображений, настройка линз базировалась на субъективном восприятии исследователя, не позволяющем оценить качество линз с позиции аббераций (хроматических или сферических). С появлением сложных XYZ регулировок в микроскопах, цифровых камер и конфокальной микроскопии, стало проще оценивать качество линз при помощи измерения PSF, спектральной регистрации и колокализации (то есть степени перекрытия флюоресцентного сигнала от различных зондов, каждый из которых имеет отдельную длину волны излу-
чения, когда две цели локализуются в одной области на очень близком расстоянии друг от друга).
124 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 13 FISH визуализация
Последние три фактора являются необходимыми техническими условиями для раздельной оценки различных точек гибридизации (окрашенных с помощью FISH генов), принимая во внимание, что эти точки гибридизации имеют очень маленький размер и объем внутри ядра (например, с-myc – 103 нм, объем 5.7•10-4 мкм3; р53 – 119 нм, объем 8.9•10-4 мкм3; р58 – 123 нм, объем 9.7•10-4 мкм3) [12]. Далее мы коротко обсудим все упомянутые темы.
Числовая апертура объектива
Числовая апертура (NA) является интегральным выражением светособирающей способности (светосилы) объектива микроскопа. Чем выше NA, тем выше светосила объектива. В результате объектив, который имеет более высокое значение NA, будет собирать больше излученных волн, исходящих от FISH точек или образца. Объектив х60 Plan Apo со значением NA 1.4 будет давать лучшее качество изображения (в зависимости от детектора), чем объектив х40 с NA 0.95. Если обсуждать понятие разрешающей способности, то объектив х100 1.4 NA будет иметь ту же разрешающую способность, что и объектив х60 1.4 NA, однако изображение, полученное с помощью последнего, будет темнее, поскольку яркость флюоресценции α равна NA4/M2. Однако объектив х100 является более сложной оптической системой, обеспечивающей большее увеличение FISH точек (при использовании цифровой камеры), что может быть желательно при некоторых специализированных исследованиях (например, изучение динамики микротрубочек в клетках дрожжей или деления бактериальных клеток). Линза с более высоким значением NA будет также обеспечивать более высокое разрешение, по сравнению с линзой, имеющей меньшую NA, что может быть необходимо для того, чтобы различить FISH пиксели. Линза с более высокой NA имеет меньшую глубину резкости, поэтому объекты, лежащие в разных плоскостях, могут быть не в фокусе. Для раздельной регистрации таких объектов рекомендуется использовать конфокальную или эпифлюоресцентную микроскопию, позволяющую получать оптические срезы (http://www.microscopyu.com/tutorials/java/objectives/nuaperture/index.html).
Освещение по Köehler
Первым требованием в анализе FISH-объектов является настройка освещения по Köehler. Этот метод настройки обеспечивает оптимальное разрешение и контраст в световом микроскопе с помощью центрирования и фокусировки источника света, установки апертур микроскопа для наиболее полного совпадения с числовой апертурой фронтальной линзы объектива. Настройка освещения по Köehler обеспечивает ровное освещение объекта (FISH точек) даже тогда, когда имеются различия в яркости светоизлучающей поверхности. Неправильная настройка освещения делает невозможным использование всей разрешающей силы объектива и приводит к получению неадекватных изображений при FISH исследовании (рис. 13.1, 13.2). Для получения оптимального FISH изображения требуется гомогенное освещение, необходимое также для относительного анализа (сравнение интенсивности сигнала между одной областью интереса и другой областью) и абсолютного подсчета (подсчет точного количества представленных в образце целевых генов с помощью линейных детекторов, таких как охлаждаемая CCD камера и фотоэлектрический умножитель).
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 125
FISH визуализация |
Глава 13 |
|
|
Рис. 13.1. Флуоресцентное изображение 10 мкм тест-объекта (предоставлен Spherotech, Libertyville, IL, USA), объектив х100 Plan Apo (1.4 NA). Иллюстрация проблем, возникающих при использовании линзы с неправильным полевым освещением при проведении сравнительных измерений на образце. На рисунке спектр интенсивностей по типу «бычьего глаза», смещенный относительно центра с пятью полосами
вокруг, расположенными в разных частях поля, для иллюстрации изменений интенсивности при условии некорректной настройки линзы. Полосы вокруг центра генерируются областью интереса (ROI), находящейся внутри. Интенсивность в этих полосах падает по мере удаления от центра. Несмотря на то, что данная фотография была сделана при ультрафиолетовом освещении, такая картина может наблюдаться также и при возбуждении светом видимой части спектра. Такой результат настройки микроскопа не приемлем также и в том случае, если для анализа FISH используется конфокальный сканирующий микроскоп, так как максимум интенсивности должен располагаться в центре пучка, а не в углу.
Объектив х20 видимый свет |
Рис. 13.2. Полевое освещение при воз- |
||
|
буждении видимым светом (А) и уль- |
||
|
трафиолетовым |
светом (В), объектив |
|
|
х20, Plan Apo, NA 0.7. При возбуждении |
||
|
видимым светом наблюдается равно- |
||
|
мерное освещение с наиболее яркой |
||
|
интенсивностью, |
располагающейся в |
|
Объектив х20, ультрафиолет |
центре поля. Диагональная линия на |
||
|
рисунках А и В демонстрирует гисто- |
||
|
грамму изменения интенсивности поле- |
||
|
вого освещения, графически представ- |
||
|
ленную на рисунках С и D. Вариации |
||
|
интенсивности от левой к правой сто- |
||
|
роне поля составляют менее 10% для |
||
Пиксели |
видимой части спектра и более 150% |
||
|
при возбуждении |
ультрафиолетом. |
|
|
Приемлемо полевое |
освещение имю- |
|
щее наибольшую яркость в центре поля, снижаясь к периферии менее, чем на 25% через все поле. Данные диаграммы интенсивности были подготовлены с помощью Image Pro Plus путем разделения серой шкалы на 10 равных участков, для дополнительной обработки использовали медианный фильтр. Тестовые объекты, использовавшиеся в этом исследовании, были предоставлены Applied Precision Inc. (Issaquah, WA, USA) и включали три флюоресцентных метки с пиками длин волн возбуждения 408 нм (синий), 488 нм (оранжевый) и 590 нм (красный) и пиками длин волн излучения 440 нм, 519 нм и 650 нм, соответственно. Голубые тестобъекты (408 нм) использовались для центрирования при освещении ультрафиолетом, а оранжевые – (488/568 нм) для центрирования при освещении видимым светом (для получения дополнительной информации см: http://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/kohler.html).
126 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 13 |
FISH визуализация |
|
|
С помощью иммерсионной системы в объектив собирается больше света, чем с помощью сухой (рис. 13.3).
Иммерсионные объективы обычно имеют большую числовую апертуру, более резкий диск Airy (дифракционный кружок – http://www.microscopyu.com/tutorials/java/imageformation/airyna/ и приложение) и большее разрешение по сравнению с сухой системой. Другими словами, чем меньше оптических изменений претерпевает луч, тем сильнее пучок света. Иммерсионные объективы увеличивают силу светового пучка, поскольку меньше света теряется при рассеивании. Например, коэффициент преломления (η) фронтальной линзы объектива микроскопа и покровного стекла, закрывающего образец, приблизительно равен 1,5. Если η иммерсионного масла между объективом и покровным стеклом также будет равно 1,5, тогда не возникает несовпадения коэффициентов преломления. В этом случае в объектив собирается большая часть светового пучка. С другой стороны, если используется масло с другим коэффициентом преломления (η=1,36) или между объективом и покровным стеклом находится воздух, который имеет коэффициент преломления η≈1.00, тогда возникает несовпадение коэффициентов преломления. Это может приводить к потере излучаемого света, возникновению сферических аббераций и снижению разрешения FISH точки. Дополнительно необходимо убедиться, что в иммерсионном масле нет пузырьков воздуха, которые могут играть роль линз (http:// www.microscopyu.com/tutorials/java/objectives/immersion/index/html). Таким образом, наилучшие FISH изображения получаются, если несовпадение коэффициентов преломления между объективом, покровным стеклом и образцом минимально или отсутствует.
|
|
|
|
|
Линза объектива |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Воздух |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Масло |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
Покровное стекло |
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Предметное |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
стекло |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Сухая система |
|
|
|
|
|
|
|
Иммерсионная система |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Рис. 13.3. Траектория светового луча, проходящего через воздушную и иммерсионную среды. Красный кружок в начале световых лучей – образец. Коэффициент преломления иммерсионного масла (1.52) совпадает с таковым у покровного стекла и фронтальной линзы объектива, поэтому создается оптически гомогенный пучок света и предотвращается рассеивание. [Bruce Alberts et al. // In: Molecular Biology of the Cell. – Garland Publishers, 2008 с изменениями].
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 127
FISH визуализация |
Глава 13 |
|
|
Покровное стекло
Это наиболее дешевый, но очень важный оптический компонент и должен чрезвычайно тщательно выбираться. Многие объективы производятся и маркируются для использования с покровным стеклом определенной толщины, обычно не более 0.17 мм (или ≈ 170±5 мкм), что соответствует коэффициенту преломления 1,5. Для получения наилучших FISH изображений, рекомендуется использовать иммерсионную систему, требующую использования покровного стекла с коэффициентом преломления равным 1,5. Любое отклонение от этого значения приведет к появлению сферических аббераций, потере разрешения и размытию FISH-сигналов.
Стабильность источника света
Обычно в качестве источника света используется дуговая ртутная лампа или иной патентованный предварительно центрированный источник, такие как Exfo (http://www.exfo-xcite.com/), ксеноновые дуговые лампы и лазеры.
Ртутная/ксеноновая дуговая лампа: если дуга не сфокусирована на задней апертуре, образец
будет освещаться неравномерно. Колебания интенсивности источника света также приведут к вариабельности интенсивности освещения поля зрения. Для предотвращения этих оптических дефектов и снижения флюктуаций источника света необходимо произвести юстировку с целью обеспечения соосности ртутно-ксеноновой лампы и оптоволоконного модуля (рис. 13.4).
Ртутная дуговая лампа
|
Стандартный пучок света |
|||
|
|
|
в микроскопе |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Фильтр нейтральной |
|
Оптико-волоконный |
|
|
плотности |
|
|
||
|
модуль |
|
||
и возбуждающий |
|
|
||
|
|
|
||
|
|
|||
фильтр |
|
|
|
|
Оптико-волоконный кабель
DeltaVision RT пучок света с фильтрами усиления изображения и оптико-волоконным модулем
Рис. 13.4. Интегрированный фоточувствительный элемент измеряет интенсивность света на каждой картинке. Все изображения нормализованы и сбалансированы. [изображение предоставлено: DeltaVision® High Resolution Imaging System of Applied Precision, Inc. Issaquah, WA, USA].
128 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/