2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ
.pdf
Глава 2 | Основы иммунохимии
Thomas Boenisch MS
перевод Н.М. Гайфуллина
Виммуногистохимии (IHC) титр и разведения антител, а также время и температура инкубации
взначительной степени взаимосвязано влияют на качество окраски. Для достижения лучших результатов эти факторы могут быть изменены независимо друг от друга или, что чаще всего имеет место, сопряженно. Как правило, при внесении изменений самой главной задачей должно быть достижение оптимальной специфической окраски в сочетании с минимальной фоновой окраской. В этой главе освещаются данные факторы.
Титр антител
Оптимальный титр антител может быть определен как самое большое разведение антисыворотки (или раствора моноклональных антител), при котором наблюдается максимальное специфическое окрашивание с наименьшей фоновой окраской при определенных условиях исследования. Это самое большое разведение определяется в первую очередь абсолютным количеством представленных специфических антител.
В поликлональной антисыворотке титры антител традиционно обозначались как микрограммы преципитированных антител на миллилитр антисыворотки. Несмотря на то, что эта информация представляет интерес, она не является необходимой для иммуногистохимика. Повышение титров антител в поликлональной антисыворотке путем выделения и увеличения количества фракций иммуноглобулинов дает небольшое преимущество при иммуногистохимическом анализе, поскольку также увеличивается количество неспецифических антител и растворимых агрегатов (частый источник неспецифической окраски) (см. главу 16, «Фоновая окраска»). Абсолютная концентрация специфических антител в препаратах моноклональных антител может быть легко определена, и на это значение часто опираются при приготовлении требуемых разведений.
Оптимальное разведение антитела также определяется истинной аффинностью антитела. Если поддерживать постоянное значение титра антител, то вероятнее ожидать, что антитела, обладающие высокой аффинностью, прореагируют с тканевым антигеном быстрее и дадут более интенсивное окрашивание за тот же самый инкубационный период, чем антитела с низкой аффинностью.
На практике, титры поликлональной антисыворотки могут варьировать от 1:100 до 1:2000, моноклональных антител – от 1:10 до 1:1000 в супернатантах культуры клеток и до 1:1 000 000 в асцитической жидкости. Эти разведения, вероятно, могут быть в будущем увеличены в связи со все возрастающей чувствительностью новейших методов детекции, включая использование соответствующего
метода демаскировки антигенов.
Разведение антител
Правильное разведение будет способствовать улучшению качества окраски, если оно приготов-
лено надлежащим образом и в соответствии с указаниями. Часто производитель предлагает готовые
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 29
Основы иммунохимии |
Глава 2 |
|
|
к использованию (RTU) реактивы, или рекомендует использование диапазона разведений, совместимых с другими переменными, такими как метод, время и температура инкубации. Если такая информация не предоставляется, оптимальные рабочие разведения иммунохимических реагентов должны быть определены с помощью титрования. Правильные разведения наилучшим образом определяются с использованием следующего алгоритма действий: сначала выбирается постоянное время инкубации, затем проводятся серии экспериментальных разведений небольших объемов. В зависимости от размера ткани обычно достаточно использовать раствор объемом от 0,1 до 0,4 мл на срез. Необходимо отметить, что, по крайней мере, на парафиновых срезах оптимальные разведения первичных антител определяются не только пиком интенсивности окраски, но также минимальным фоновым окрашиванием (максимальные соотношения сигнала и шума). После того, как было выявлено оптимальное рабочее разведение, могут быть приготовлены большие объемы в соответствии с потребностями и стабильностью реагента.
На степень, до которой моноклональные антитела могут быть разведены, влияют дополнительные факторы. Из-за ограниченной конформационной свободы молекул и четко определенного pH, моноклональные антитела более чувствительны к значению рН и содержанию ионов в буферерастворителе [1]. Действительно, было продемонстрировано, что за исключением относительно редкого изотипа IgG3, все моноклональные антитела могут быть разведены в большей степени и давать более интенсивное окрашивание при значении рН 6,0, особенно после использования демаскировки антигена нагреванием (HIAR) [1]. С антителами изотипа IgG3 предпочтительнее использовать более щелочное значение рН как до, так и после HIAR. Практически все моноклональные антитела окрашивали ткань более интенсивно в отсутствии NaCl. Было обнаружено, что из нескольких растворителей, использованных в этом исследовании, фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), который все еще широко применяется в качестве разбавителя первичных антител, подавлял реактивность всех исследованных антител [1]. Вероятным объяснением этих результатов, связанных с изменениями значений рН и содержания ионов, являются различия результирующих отрицательных
электростатических зарядов антигена-мишени [1, 3].
Разведения обычно определяются как соотношение более концентрированного базового раствора к общему объему желаемого раствора. Например, разведение 1:10 получается при смешивании одной части базового раствора с девятью частями разбавителя. Двукратные серийные разведения проводятся путем последующих разведений предыдущего раствора в соотношении 1:2. Для получения очень маленького объема высоко разведенного раствора может потребоваться два этапа. Например, чтобы приготовить 1,0 мл разведения 1:1000 сначала делают 100 мкл разведения 1:10 (10 мкл + 90 мкл) и затем 1000 мкл разведения 1:100 с использованием 10 мкл промежуточного раствора (10 мкл + 990 мкл).
Использование регулируемых пипеток для приготовления разведений позволяет переналаживать пипетку для переноса разных объемов раствора и повышает точность переноса. Чтобы измерить объемы свыше 10 мл могут быть использованы серологические или волюметрические пипетки. В табл. 2.1. приводятся объемы базовых реактивов и растворителей, необходимых для получения разве-
дений в диапазоне от 1:50 до 1:200. Для одновременного определения оптимального разведения более
30 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 2 |
Основы иммунохимии |
|
|
|
|
чем одного реактива используется титрование методом «шахматной доски». В следующем примере титрования методом «шахматной доски» определяются оптимальные разведения первичного антитела и реагента стрептавидин-HRP, в то время как разведение биотинилированного вторичного антитела сохраняется постоянным. Для исследования трех разведений требуется девять срезов ткани.
Таблица 2.1.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНОГО РАЗВЕДЕНИЯ
ПЕРВИЧНОГО АНТИТЕЛА И РЕАГЕНТА СТРЕПТАВИДИН – HRP
Стрептавидин-пероксидаза |
|
Разведения первичного антитела |
|||
1:50 |
|
|
1:100 |
|
1:200 |
1:50 |
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
1:100 |
1:50 |
|
1:100 |
|
1:200 |
|
|
|
|
|
|
1:200 |
1:50 |
|
1:100 |
|
1:200 |
|
|
|
|
|
|
Если результаты, достигнутые при использовании нескольких различных разведений, являются идентичными или сходными, дополнительным фактором при выборе оптимальных разведений может стать цена реагентов.
Для некоторых методов, точное определение оптимального соотношения сигнала и шума как функции разведения первичного антитела, вероятно, является критическим параметром. Например, было обнаружено, что немеченые комплексы фермент-антифермент (PAP, APAAP) используются реже, чем методы, со стрептавидин-биотином [2]. Это, вероятно, связано с тем, что при использовании метода с авидин-биотином, в отличие от метода РАР, получаются одинаковые результаты при высоких и низких концентрациях тканевых антигенов [4]. Дополнительная информация по методам иммуногистохимической окраски приводится в главе 10, «Методы иммуногистохимической окраски».
Инкубация антител
Как упоминалось выше, время инкубации, температура и титры антител взаимосвязаны. Изменение одного фактора может повлиять на другие.
Время инкубации
Имеется обратная зависимость между временем инкубации и титром антител: чем выше титр антител, тем требуется короче время инкубации для достижения оптимальных результатов. В практике, тем не менее, до определения оптимального разведения антитела целесообразно сначала установить подходящее время инкубации.
Время инкубации первичного антитела может достигать и 24 часов, однако, продолжительность 10-30 минут, используется наиболее широко. Для достаточно сильной реакции антитела со связанным антигеном за короткий период времени, антитело должно обладать высокой аффинностью и должна быть высокая концентрация антител, а также необходимы оптимальная среда для
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 31
Основы иммунохимии |
Глава 2 |
|
|
реакции (рН и ионы разбавителя). Влияние факторов, которые, как полагают, способствуют повышению неспецифической фоновой окраски, должно быть минимизировано (см. главу 16, «Фоновая окраска»). Инкубация первичных антител длительностью 24 часа является более экономичной, поскольку могут быть использованы более высокие разведения. Антитела с низкой аффинностью и/или реагенты с низкими титрами антител для достижения состояния равновесия* должны инкубироваться в течение более длительных периодов времени. Однако продление инкубации первичного антитела свыше периода времени, при котором тканевой антиген насыщается антителом, не приводит к улучшению качества окраски.
Во время инкубации первичного антитела продолжительностью менее 20 минут равновесие обычно не достигается. Поэтому важно сохранять длительность этого этапа постоянной. Различие времен инкубации может привести к изменениям общего качества и интенсивности окраски и, в конечном счете, к неправильной интерпретации результатов. Эти критерии имеет особое значение при попытке оценить степень дифференцировки опухоли.
Температура инкубации
Поскольку реакции антиген-антитело достигают равновесия при температуре 37°C быстрее, чем при комнатной температуре, некоторые специалисты предпочитают проводить инкубацию при более высокой температуре. Тем не менее, в то время как повышение температуры инкубации позволяет использовать большее разведение антитела и/или укоротить время инкубации, значение сохранения постоянного времени инкубации становится даже более существенным. Не известно, активирует ли повышение температуры не столько различные реакции, усиливающие фоновую окраску, сколько избирательно реакцию антиген-антитело.
При исследовании часто используется температура 4°C в сочетании с инкубацией на протяжении всей ночи или длиннее. Срезы, инкубированные в течение длительных периодов времени или
при температуре 37°C, должны быть помещены в камеру влажности для предотвращения испарения и высыхания препаратов ткани. Сходным образом инкубация ткани при комнатной температуре в очень сухой или продуваемой среде потребует использования камеры влажности.
Литература: |
|
|
1. |
Boenisch T // Appl Immunohistochem & Mol Morph. – |
4. Sternberger LA and Sternberger NH // J Histochem |
|
1999. – 7(4). – p. 300-306. |
Cytochem. – 1986. – 34. – p. 599-605. |
2. |
Boenisch T. Personal observations. |
|
3. |
Boenisch T // Appl Immunohistochem & Mol Morph. – |
|
|
2002. – 10(4). – p. 363-367. |
|
*Термин «равновесие» в данном случае означает насыщение антигена антителом.
32 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 3 | Основы энзимологии
Thomas Boenisch MS
перевод Н.М. Гайфуллина
В иммуноферментных методах окраски для превращения бесцветных хромогенов в окрашенные конечные продукты используются реакции фермента с субстратом. Из всех ферментов, используемых для данной цели, подробно будут рассмотрены только пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза кишечника теленка. Из-за своей высокой чувствительности глюкозоксидаза (Aspergillus niger)
используется в настоящее время очень редко.
В этой главе наряду с предлагаемыми процедурами приготовления некоторых растворов субстрата также будут обсуждаться различные хромогены и субстраты, которые могут быть использованы совместно с пероксидазой и фосфатазой.
Ферменты
Ферменты являются белковыми катализаторами, присущими живой материи. Сотни ферментов были получены в очищенной и кристаллической форме. Каталитическая активность ферментов чрезвычайно высока – один моль чистого фермента может катализировать трансформацию от 10 000 до 1 000 000 молей субстрата в минуту. В то время как некоторые ферменты являются высоко специфичными только для одного субстрата, другие могут воздействовать на многие сходные субстраты. Обширная классификация ферментов включает гидролитические ферменты (эстеразы, протеазы), фосфорилазы, окислительно-восстановительные ферменты (дегидрогеназы, оксидазы, пероксидазы), трансферазы, декарбоксилазы и другие.
Ферментативная активность зависит от нескольких факторов, таких как концентрация фермента и субстрата, значение рН, концентрация солей в среде буфера, температура и свет. Множество ферментов также содержат небелковые химические компоненты, называемые простетическими
группами. Типичными простетическими группами являются протопорфирин железа пероксидазы и биотин карбокситрансфераз. Кроме того, активация множества ферментов требует присутствия ионов металлов, таких как Mg++, Mn++ и Zn++, которые действуют в качестве электрофильных (притягивающих электроны) агентов.
Общая формула, описывающая реакции фермента (Е) с его субстратом (S), может быть представлена следующим образом:
1.E + S = ES
2.ES → E + P
Таким образом, до образования продукта (Р) на «активном центре» (простетической группе) фермента формируется кратковременный комплекс фермент-субстрат.
Вещества, нарушающие специфическое связывание субстрата с простетической группой, являются «специфическими ингибиторами» и значительно отличаются от веществ, которые вызывают
неспецифическое денатурирование фермента (или любого белка). Известно два основных типа инги-
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 33
Основы энзимологии |
Глава 3 |
|
|
бирования: конкурентное ингибирование и неконкурентное ингибирование. Конкурентное ингибирование возникает в результате обратимого образования комплекса ингибитора (I) с ферментом (EI):
E + I + S = El + S
Комплекс EI может диссоциировать при изменении концентрации или субстрата, или ингибитора, за исключением тех случаев, когда аффинность I к Е больше, чем аффинность S к Е. Типичным примером конкурентного ингибирования является действие оксида углерода или азидов на тяжелые металлы дыхательных ферментов.
Неконкурентное ингибирование зависит исключительно от концентрации ингибитора и в основном является необратимым. Неконкурентный ингибитор может как затрагивать простетическую группу фермента, так и оставлять ее интактной. Само по себе оно проявляется замедлением скорости реакции фермента с субстратом или ее остановкой:
E + l + S → ElS
Выбор фермента, наиболее подходящего для конкретной иммуногистохимической реакции, зависит от соблюдения ряда критериев:
1.Фермент должен быть доступен в высокоочищенной форме и быть относительно недорогим.
2.Конъюгация (ковалентное связывание с антителом или авидином, например) или нековалентное связывание не должны полностью подавлять активность фермента, хотя они могут ослабить ее.
3.Связанный фермент должен быть стабильным в растворе.
4.Эндогенная активность фермента должна мешать оценке специфического окрашивания, связанного с антигеном, только в минимальной степени.
5.Продукты ферментативных реакций должны легко обнаруживаться и быть стабильными.
Пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза кишечника теленка удовлетворяют большинству из этих критериев. Свойства этих ферментов далее рассмотрены более подробно.
Пероксидаза хрена (HRP)
Этот фермент (молекулярная масса 40 кДа) выделяется из корня хрена (растение Cochlearia armoracia). Активный центр HRP представляет собой железосодержащую группу гема (гематин). HRP окрашивается в растворе в коричневый цвет. Гематин HRP сначала образует комплекс с перекисью водорода (Н2О2), затем вызывает ее распад, приводя к образованию воды и атома кислорода. HRP окисляет некоторые вещества, два типа из которых относятся к полифенолам и нитратам. Необходимо отметить, что активность HRP и некоторых HRP-подобных веществ, как и активность многих других ферментов, может быть ингибирована добавлением избыточного количества субстрата. Комплекс,
образованный между HRP и избыточным количеством перекиси водорода, является каталитически
34 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 3 |
Основы энзимологии |
|
|
инертным и в отсутствие донора электрона (например, хромогенного вещества) обратимо ингибируется. Именно чрезмерное количество перекиси водорода и отсутствие донора электрона вызывает подавление активности эндогенной пероксидазы. Двумя другими сильными (обратимыми) ингибиторами пероксидазы являются цианид и азид.
HRP может быть присоединена к другим белкам посредством как ковалентной, так и нековалентной связи. Ковалентное связывание HRP с другими белками может быть выполнено с помощью одноэтапных или двухэтапных процедур и глютаральдегида. Реже для этой цели используется хими-
ческое вещество 4,4’-дифтор-3,3’-динитрофенилсульфон (FNPS). Во всех случаях в эту реакцию вовлекаются Е-аминогруппы лизина и N-концевые аминогруппы обоих белков. Предпочтительнее использовать двухэтапную процедуру конъюгации, поскольку молекула HRP имеет малое количество реактивных групп по сравнению с молекулой антитела. Как следствие, добавление глютаральдегида в раствор, содержащий примесь HRP и антитела, приведет к конъюгации молекул антител в большей степени друг с другом, чем с ферментом. В двухэтапной процедуре на первом этапе HRP реагирует с бифункциональными реагентами. На втором этапе с антителом смешиваются только активированные HRP. Это приводит к значительно более эффективному мечению и отсутствию полимеризации. Молекулярная масса получающихся конъюгатов составляет преимущественно 200 000 – 240 000 кДа.
HRP также конъюгируется со стрептавидином с использованием двухэтапной процедуры и глютаральдегида и применяется в этой форме, например, в процедуре мечения стрептавидинбиотином (LSAB). Конъюгация с биотином также включает два этапа, поскольку до того, как биотин сможет прореагировать с Е-аминогруппами фермента, необходимо получить производное биотина – N-гидроксисукцинимидный эфир биотина или биотин-гидразид.
Нековалентное связывание HRP с антителом, также известное как немеченое связывание антитела, описывается очень подробно Sternberger [1]. Для образования растворимых семициклических
иммунных комплексов, состоящих из двух молекул антитела и трех молекул фермента, вместо бифункциональных реактивов используются антитела к HRP класса IgG. Молекулярная масса пероксидазыантипероксидазы, (комплекс «РАР»), составляет 400–430 кДа.
Щелочная фосфатаза (AP) кишечника теленка
Щелочная фосфатаза кишечника теленка (молекулярная масса 100 кДа) отщепляет (путем гидролиза) и переносит фосфатные группы из органических эфиров путем разрушения связи Р=0; кратковременно формируется промежуточная связь фермент-субстрат. Основными металлами, которые активируют АР, являются Mg++, Mn++ и Са++.
До открытия немеченой щелочной фосфатазы – антищелочной фосфатазы (АРААР) АР широко не применялась в иммуногистохимии [2, 3]. Растворимые иммунные комплексы, использованные в этой процедуре, имеют молекулярную массу около 560 кДа. Основным преимуществом процедуры APAAP по сравнению с более ранними методиками с использованием пероксидазы было отсутствие влияния на специфическую окраску, связанного с активностью эндогенной пероксидазы. Поскольку активность
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 35
Основы энзимологии |
Глава 3 |
|
|
эндогенной пероксидазы может мешать оценке специфической окраски, при исследовании мазков крови и костного мозга особенно рекомендуется применять методики с щелочной фосфатазой. Активность эндогенной щелочной фосфатазы, при исследовании костного мозга, ткани почки, печени и мазков крови, может быть ингибирована путем добавления к раствору субстрата раствора 1 мМ левамизола [4], хотя наиболее эффективным, как было обнаружено, является добавление 5 мМ [5]. Левамизол в достаточной степени не ингибирует щелочную фосфатазу кишечника.
Субстраты и хромогены
Пероксидаза
Как описано выше, активность HRP в присутствие донора электронов сначала приводит к образованию комплекса фермента с субстратом и затем к окислению донора электронов. Донор электронов обеспечивает движущую силу для продолжения катализа Н2О2, в то время как его отсутствие эффективно останавливает реакцию.
Имеется несколько доноров электронов, которые окрашиваются при окислении и поэтому называются хромогенами. Это свойство в сочетании с тем, что они становятся нерастворимыми при окислении, делает эти вещества полезным для иммуногистохимии.
3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлорид (DAB)
Он образует коричневый конечный продукт, который нерастворим в спирте и других органических растворителях. Окисление DAB также вызывает его полимеризацию, что приводит к возмож-
ности реагировать с тетроксидом осмия и, таким образом, усиливает интенсивность его окраски и плотность электронов. Из нескольких металлов и методов, использованных для усиления оптической плотности полимеризованного DAB, наиболее успешным, вероятно, является хлорид золота в комбинации с сульфидом серебра [6]. DAB относится к потенциальным канцерогенам, поэтому обра-
щаться с ним и утилизировать его следует с особой осторожностью.
3-амино-9-этилкарбазол (AEC)
При окислении AEC образуется розово-красный конечный продукт, который растворяется в спирте. Поэтому ткани, обработанные AEC, не должны погружаться в спирт или спиртосодержащие растворы (например, гематоксилин Harris). Вместо спиртосодержащих растворов должны использоваться водная контрастирующая окраска и среда для заключения. К сожалению, АЕС чувствителен к дополнительному окислению и при чрезмерном воздействии света будет уменьшаться интенсивность окраски. Поэтому хранить его рекомендуется в темноте.
4-хлоро-11-нафтол (CN)
CN преципитирует в виде конечного продукта голубого цвета. Поскольку он растворим в спирте и других органических растворителях, ткани не должны обезвоживаться, подвергаться воздействию спиртосодержащих контрастирующих окрасок или покрываться покровными стеклами с использова-
36 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Глава 3 |
Основы энзимологии |
|
|
|
|
нием гистологической среды, содержащей органические растворители. В отличие от DAB, CN имеет тенденцию к распространению от места преципитации.
p-фенилендиамин-дигидрохлориделпирокатехол (реактив Hanker-Yates)
Он образует голубо-черный продукт реакции, который нерастворим в спирте и других органических растворителях. Как и полимеризованный DAB, этот продукт реакции может образовать соединение с осмием. В иммунопероксидазных методиках при использовании реактива Hanker-Yates были
получены различные результаты.
Щелочная фосфатаза
В методе окраски щелочной фосфатазой, фермент гидролизует эфиры нафтол фосфата (субстрат) до фенольных соединений и фосфатов.
Фенолы соединяются с бесцветными солями диазония (хромоген) с образованием нерастворимых окрашенных азокрасителей. Было успешно использовано несколько различных комбинаций субстратов и хромогенов.
Нафтол AS-MX фосфат
Он может быть использован как есть, в кислотной форме, или в виде натриевой соли. Хромогены прочный красный TR и прочный голубой ВВ образуют, соответственно, ярко красный или ярко голубой конечный продукт. Оба растворимы в спирте и других органических растворителях, так что должна быть использована водная среда для заключения препаратов. При окраске мазков клеток предпочтительнее использовать прочный красный TR.
Новый фуксин
Он также дает красный конечный продукт. В отличие от прочного красного TR и прочного голубого ВВ, цвет, образованный новым фуксином, не исчезает в спирте и других органических растворителях, что позволяет провести обезвоживание ткани до наложения покровного стекла. Интенсивность окраски, полученной при использовании нового фуксина, выше, чем при использовании прочного красного TR или прочного голубого ВВ.
Вкачестве субстратов могут быть использованы нафтол AS-BI фосфат, нафтол AS-TR фосфат
и5-бромо-4-хлоро-3-индоксилфосфат (BCIP). Другими возможными хромогенами являются прочный красный LB, прочный гранатовый GBC, нитросиний тетразолий (МВТ) и лодонитротетразолий фиолетовый (INT).
Влитературе имеются подробные описания и информация о приготовлении большинства часто используемых смесей субстрат-хромоген для HRP [7] и AP [8], а также об их соответствующем приме-
нении, преимуществах или недостатках.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 37
Основы энзимологии |
Глава 3 |
|
|
Рекомендуемые процедуры для реактивов субстрат-хромоген
Пероксидаза
Раствор субстрата AEC (рекомендуется для цитологических мазков)
1. Растворить 4 мг AEC в 1 мл N,N диметил- |
4. |
Добавлить раствор к ткани и инкубиро- |
|
|
формамида. |
|
вать в течение 5-15 минут при комнатной |
2. |
Добавить 14 мл 0,1 M ацетатного буфера |
|
температуре. |
|
|
||
|
(pH 5,2) и 0,15 мл 3% перекиси водорода. |
5. |
Промыть в дистиллированной воде. |
3. |
Смешать и фильтровать в случае образо- |
6. |
Выполнить контрастное окрашивание и |
|
вания преципитата. |
|
заключить срез под покровное стекло с |
|
|
|
использованием водной среды. |
Раствор субстрата DAB |
|
|
|
1. |
Растворить 6 мг DAB в 10 мл 005 M Трис- |
4. |
Промыть в дистиллированной воде. |
|
буфера, pH 7,6 |
5. |
Выполнить контрастное окрашивание и |
|
|
||
2. |
Добавить 0,1 мл 3% перекиси водорода. |
|
заключить срез под покровное стекло |
|
Смешать и фильтровать в случае образо- |
|
с использованием органической или |
|
вания преципитата. |
|
водной среды. |
3. |
Добавить раствор к ткани и инкубиро- |
|
|
|
вать в течение 3-10 минут при комнатной |
|
|
|
температуре. |
|
|
Щелочная фосфатаза
Раствор субстрата прочного красного (рекомендуется для цитологических мазков)
1. В стеклянной пробирке растворить 2 |
4. |
Непосредственно до окраски растворить |
мг нафтол AS-MX фосфата, свободной |
|
10 мг соли прочного красного TR (Sigma F |
кислоты (Sigma N4875) в 0,2 мл |
|
1500) в вышеуказанном растворе и филь- |
N,N-диметилформамида. |
|
тровать на срезы. |
2. Добавить 9,8 мл 0,1 М Трис-буфера, pH 8,2. |
5. |
Инкубировать в течение 10-20 минут при |
3. Добавить 0,01 мл 1 М левамисоля (Sigma |
|
комнатной температуре. |
|
|
|
L 9756), чтобы заблокировать эндогенную |
6. |
Промыть в дистиллированной воде. |
щелочную фосфатазу. (Раствор можно |
7. |
Выполнить контрастное окрашивание и |
|
хранить при температуре 4°С в течение
заключить срез под покровное стекло с
нескольких недель или дольше при темпе-
использованием водной среды.
ратуре -20°C).
38 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/