2 курс / Гистология / Митрошина_Е_В_Антигипоксическое_и_нейропротекторное_действие_N_

81

Рисунок 16. Параметры спонтанной кальциевой активности клеток гиппокампа на 7 день после гипоксии: А - длительность кальциевых суперосцилляций Б - частота возникновения Са2+ осцилляций в культурах клеток гиппокампа. * - статистически достоверные (p<0,05) отличия от контрольной группы культур, не подвергавшихся гипоксии, парный критерий Стьюдента, # - статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии и не получавших аппликацию эндоканнабиноида, парный критерий Стьюдента

Аппликация N-ADA при гипоксии и в первые сутки после нее оказывает дозозависимый нейропротекторный эффект на кальциевую активность нейронных сетей. N-ADA в концентрации 2,5 мкМ не влияет на длительность суперосцилляций, а в концентрациях 6 и 10 мкМ достоверно уменьшает ее (41,37±2,03 с и 48,66±5,74 с, соответственно).

82

Рисунок 17. Характерные профили кальциевой активности нейронов на 7 день после моделирования гипоксии в культурах клеток гиппокампа. По оси абсцисс – время, с, по оси ординат – интенсивность флуоресценции, усл.

ед.: 1 – интактные; 2 – контроль (10 мин гипоксия/реоксигенация без аппликации каннабиноида); 3 – N-ADA 2,5 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 2,5 мкМ; 4 – N-ADA 6 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 6 мкМ/л); 5 - N-ADA 10 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 10 мкМ/л)

83

О нормализации профиля кальциевой активности можно судить по приведенным ниже характерным растровым диаграммам (рис. 18), на котором штрихами отмечены моменты возникновения кальциевых осцилляций в клетках.

Рис Рисунок 18. Растровая диаграмма Са2+ осцилляций в культуре клеток гиппокампа: А - до гипоксии, 21 DIV; Б - через 2 часа после гипоксии, 21 DIV; В - через 7 суток после гипоксии, 28 DIV с аппликацией 6 мкМ N-АДА; Г - через 7 суток после гипоксии, 28 DIV с аппликацией 10 мкМ N-АДА. По оси ординат указан номер рассматриваемой клетки, по оси абсцисс - время. Моменты возникновения кальциевых осцилляций отмечены штрихами.

Таким образом, применение N-ADA в концентрациях 6 мкМ и 10 мкМ позволяет нормализовать кальциевую активность культивируемых клеток гиппокампа в отдаленном постгипоксическом периоде. Можно

84

предположить, что в основе этого эффекта лежит реализация механизма DSE, описанного в обзоре литературы. Активация пресинаптических CBR тормозит пресинаптические кальциевые токи через потенциал-зависимые Са2+-каналы N- и P/Q-типов и в результате подавляется экзоцитоз глутамата, снижается вход кальция через постсинаптические NMDA рецепторы, что приводит к нормализации концентрации кальция в постсинаптическом окончании, зарегистрированной в наших экспериментах (Twitchell et al., 1997; Kano et al., 2009).

3.1.3 Влияние N-арахидоноилдофамина на выживаемость культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии

Оценка соотношения живых и погибших клеток в культурах гиппокампа проводилась через 1, 3, 7 и 10 суток после гипоксического воздействия. Число живых клеток в интактных культурах на протяжении всего периода наблюдения практически не изменялось. Гипоксическое воздействие вызывало морфологические изменения и гибель культивируемых клеток. Уже через сутки после гипоксии число живых клеток в культурах, подвергнутых гипоксии, было достоверно ниже по сравнению с интактной группой (73,19±3,95% и 89,37±1,33%, соответственно). В течение последующих дней доля живых клеток в культурах, подвергавшихся гипоксическому воздействию, неуклонно снижалась и на 10 сутки составила 20,84±4,78% (рис. 19). Стоит отметить, что наиболее резкое снижение жизнеспособности клеток в культурах отмечалось между 7 и 10 днями после гипоксии/реоксигенации.

Аппликация N-ADA (10 мкМ) во время гипоксии и в первые сутки после реоксигенации существенно повышала выживаемость клеток. На первые сутки после гипоксии/реоксигенации в присутствии N-ADA происходило незначительное снижение жизнеспособности, сопоставимое с контрольными культурами, однако в дальнейшем она не снижалась и на 10

85

сутки после гипоксии/реоксигенации статистически значимых отличий между опытными и интактными культурами не обнаруживалось.

Рисунок 19. Количество живых клеток в культуре клеток гиппокампа после гипоксии, *- статистически достоверные различия в сравнении с контрольной группой, p<0.05, **- различия в сравнении с контрольной группой # - статистически достоверные различия с группой, подвергавшейся гипоксии (p<0,05, критерий Стьюдента).

Число жизнеспособных клеток в культурах, подвергавшихся 10минутной гипоксии с аппликацией N-ADA, на 10 сутки после воздействия было более чем в 3 раза выше, чем в контрольных культурах (75,24±9,37% и 20,84±4,78%, соответственно). Таким образом, введение N-ADA во время гипоксии и в первые сутки после нее сохраняют жизнеспособность клеток как минимум в течение 10 суток после гипоксического воздействия.

Для выявления возможных механизмов антигипоксического действия исследуемого вещества в культуры добавлялся N-ADA в сочетании с блокаторами различных рецепторов, связывающих каннабиноид. В отсутствие гипоксии антагонисты CBR-1, CBR-2 и TRPV1 не влияли на выживаемость клеток. Блокада CBR-1 селективным антагонистом

86

SR141716A на первые сутки после гипоксии/реоксигенации в культурах, подвергнутых гипоксии в присутствии N-ADA, вызывала, по сравнению с интактными культурами, достоверное снижение жизнеспособности клеток, которая на 3 сутки оставалась на прежнем уровне, но на 7 сутки продолжала снижаться. К 10 суткам постгипоксического периода число жизнеспособных клеток снижалось наиболее интенсивно (до 24,95±3,21%) и статистически не отличалось от контрольной группы, подвергутой гипоксии в отсутствие каннабиноида. Таким образом, блокада CBR-1 устраняла нейропротекторное действие N-ADA.

Исследование роли активации CBR-2 в реализации нейропротекторного эффекта N-ADA показало, что под воздействием селективного антагониста CBR-2, SR144528, в течение первых 7 суток происходит постепенное достоверное снижение жизнеспособности клеток, сходное с ее изменениями в контрольной группе. Однако к 10 суткам, в отличие от контрольной группы, резкого снижения числа живых клеток не происходило. Их количество в присутствии N-ADA и SR144528 на 10 сутки после гипоксии было достоверно выше, чем в контрольной группе культур (62,0±2,43%). Эти данные свидетельствуют о том, что активация CBR-2 не оказывает существенного влияния на реализацию нейропротекторного эффекта N-ADA.

Применение при гипоксии N-ADA (10 мкМ) в сочетании с антагонистом TRPV1 капсазепином (1 мкМ) не оказывало нейропротекторного эффекта. Количество жизнеспособных клеток снижалось уже на 1 сутки после гипоксического воздействия, а к 10 суткам постгипоксического периода их число в группе культур, инкубированных с N-ADA и капсазепином, составило всего 32,08±12,41, что не отличалось от контроля. Следовательно, активация TRPV1, так же, как и CBR-1, имеет важное значение в реализации нейропротекторного эффекта N-ADA при гипоксии.

87

Таким образом, аппликация N-ADA (10 мкМ) во время гипоксии снижает гибель культивируемых клеток гиппокампа в постгипоксическом периоде, при этом защитный эффект эндоканнабиноида опосредуется прежде всего метаболическими каскадами, запускаемые при активации CBR-1 и TRPV1.

3.1.4 Влияние N-арахидоноилдофамина на распределение каннабиноидных рецепторов первого и второго типов в диссоциированных культурах гиппокампа при моделировании гипоксии

Для оценки распределения CBR в диссоциированных культурах гиппокампа проводили иммуногистохимическое маркирование глиальных клеток, нейронов, а также CBR-1 и CBR-2. Для визуализации астроцитов маркировали глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), для визуализации нейронов - нейрон-специфичный белок МАР2, который в значительных количествах содержится в цитоскелете сомы и дендритах нейронов.

Иммуноцитохимические исследования показали, что CBR-1 присутствуют в культурах на 28-й DIV, локализуясь на отростках нейронов (Рис. 20). Поскольку данные отростки не маркировались МAP2, мы предполагаем, что они являются аксонами нейронов.

Рисунок 20. Иммуноцитохимическое маркирование CBR-1 в культуре клеток гиппокампа на 28-й DIV: А - интактная культура, Б - на 7 сутки после гипоксии, В - на 7 сутки после гипоксии при аппликации N-ADA 10 мкМ. Масштаб 20 мкм

Полученные данные хорошо согласуются с существующими исследованиями, свидетельствующими о преимущественной локализации CBR-1 на аксонах (Katona et al., 1999), как синаптически, так и внесинаптически, хотя согласно литературным данным максимальная плотность экспрессии CBR-1 наблюдается на пресинаптической терминали, особенно в пресинаптической активной зоне (Kofalvi et al., 2007).

89

Для оценки воздействия острой гипоксии на распределение CBR-1 были охарактеризованы такие параметры, как количество кластеров этих рецепторов в расчете на 100 мкм длины отростка нейрона и средняя площадь кластера.

Анализ полученных изображений проводился с помощью программы ImageJ. Распределение CBR оценивалось на 7 сутки постгипоксического периода. Нами было показано, что гипоксическое воздействие не вызывает изменения количества кластеров CBR-1 на отростках нейронов, но приводит к статистически значимому уменьшению среднего размера кластеров (с 0,72±0,07 мкм2 до 0,51±0,07 мкм2, рис.21).

Рисунок 21. Распределение CBR-1 рецепторов в культурах клеток гиппокампа на 7 сутки после гипоксии. А - число кластеров СВ1 рецепторов на 100 мкм отростка нейрона, Б - средняя площадь кластера; * - статистически достоверные различия с показателями «до гипоксии» (р<0,05, критерий Стьюдента)

В группе культур, в которые при гипоксии в культуральную среду добавляли N-ADA, размер кластеров CBR-1 не отличался от их размеров в контрольной группе, не подвергавшейся гипоксии, а их количество достоверно увеличивалось.

Иммуноцитохимическое маркирование CBR-2 показало их присутствие в культурах на 28-й DIV. Для характеристики их распределения оценивалось

90

количество кластеров CBR-2 на 100 мкм2 и средняя площадь кластера. CBR-2 преимущественно локализовались на глиальных клетках, что согласуется с данными литературы (Rodriguez et al., 2001), хотя встречались и на некоторых нейронах, что также показано другими авторами (Gong et al., 2006; Morgan et al., 2009; Brusco et al., 2008). В отдаленном постгипоксическом периоде количество кластеров CBR-2 существенно снижалось (рис. 22) на фоне достоверного уменьшения их среднего размера.

Рисунок 22. Распределение CBR-2 рецепторов в культурах клеток гиппокампа на 7 сутки после гипоксии. А - число кластеров СВR-2 рецепторов на 100 мкм2, Б - средняя площадь кластера; * - статистически достоверные различия различия с показателями «до гипоксии» (р<0,05, критерий Стьюдента)

При введении N-ADA (10 мкМ) во время гипоксии и в первые сутки после нее в отдаленном постгипоксическом периоде количество и размер кластеров CBR-2 не отличались от аналогичных показателей в контрольной группе культур на фоне нормоксии.

Таким образом, наше исследование показало, что аппликация N- арахидоноилдофамина во время гипоксии вызывало повышение количества кластеров CBR-2, сохраняя их нормальный размер, а также предотвращало индуцированное гипоксией снижение их количества и размеров.