2 курс / Гистология / Митрошина_Е_В_Антигипоксическое_и_нейропротекторное_действие_N_

61

воздействия составляло 10 минут. Затем культуру извлекали из камеры и заменяли гипоксическую среду на нормоксическую (Ведунова с соавт., 2012, 2013).

Исследуемые вещества добавляли в гипоксическую среду при гипоксии и в течение первых суток после нее. Параметры спонтанной биоэлектрической активности, характеризующие реакцию нейронов на гипоксию, регистрировали сразу после реоксигенации, через 2 часа и каждые 24 часа в течение 7 дней после гипоксии.

2.8 Моделирование острой гипобарической гипоксии in vivo

Для моделирования острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) in vivo использовалась вакуумная проточная барокамера при внешней температуре 20-22оС. Мыши помещались в условия, соответствующие подъему на высоту 10000—10500 м со скоростью 183 м/с (Мет. рекомендации...... под ред. Лукьяновой, 1990).

Регистрируемыми параметрами являлись:

1.Время жизни (Тж, мин) на «смертельной площадке», отсчитывается от момента подъема на площадку до наступления летального исхода, либо появления второго агонального вдоха;

2.Время потери позы (Тпп, мин), период от начала подъема в барокамере до момента, когда животное принимает боковое положение и утрачивает способность поддерживать позу;

3.Время восстановления позы (Твп, мин), период времени от остановки дыхания до момента, когда животное при немедленном «спуске» на землю снова приобретает способность стоять на конечностях;

4.Коэффициент защиты (Кз), рассчитываемый по выживаемости животных, оценивается по количеству животных, которые выдержали пребывание на «смертельной площадке» в течение 10 мин

62

Кз = (а/б+1)/(в/д+1),

где а и б — число выживших животных в опытной и контрольной группах, в и д — общее число животных в опытной и контрольной группах соответственно (Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств, 1990).

При моделировании ОГБГ в популяции животных встречались особи, низкоустойчивые к гипоксии (НУ) с Тж менее 3 мин, среднеустойчивые с Тж от 3 до 9 мин и высокоустойчивые, которые выживал на «высоте» более 10 мин без видимых проявлений гипоксического повреждения. Эффективность антигипоксически свойств оценивали по изменению времени жизни опытных животных на «смертельной площадке» относительно времени жизни контрольных животных.

2.9. Методы оценки антигипоксического и нейропротекторного действия исследуемого соединения при моделировании острой гипобарической гипоксии in vivo

2.9.1 Тест «открытое поле»

Установка для теста «открытое поле» представляет собой круглую камеру диаметром 90 см с пластиковыми стенками высотой 28 см. Пол изготовлен из белого пластика, на нем черной краской нанесена решетка, делящая его на 25 равных квадратов со стороной 15 см. Лампы накаливания (4 лампы по 75 Вт) располагаются по кругу диаметром 60 см на высоте 80 см от поверхности поля. Освещенность площадки во время опыта 200 Лк.

63

Животное помещалось в центральный квадрат и за ним велось наблюдение. Визуально подсчитывалось количество отдельных поведенческих актов (Буреш с соавт., 1991).

С целью определения ориентировочно-исследовательской активности животных в «открытом поле» регистрировались следующие показатели поведенческой активности мышей: горизонтальная двигательная активность (ГДА) – число пересеченных квадратов в «открытом поле»; вертикальная двигательная активность (ВДА) – число стоек–подъемов на задние лапы. Также отмечались реакции принюхивания, замирания, верчения, пячения, акты груминга и дефекации.

2.9.2 Тест «Водный лабиринт Морриса»

Для оценки способностей животных к формированию и сохранению пространственной долговременной памяти применялось тестирование в водном лабиринте Морриса. Лабиринт представляет собой циркулярный бассейн (диаметром 90 см), заполненный непрозрачной водой, в которую погружена небольшая платформа (диаметром 10 см), не видимая животному. Протокол теста состоял из пяти сеансов обучения, по пять попыток в каждом. Сеансы проводились в одно и то же время суток через 48 часов. Помещение животных с края бассейна в течение всего эксперимента производилось в одном и том же секторе лабиринта, выбранного случайным образом. Максимальная длительность первого сеанса составляла 90с. В том случае, если животное не могло самостоятельно найти платформу, экспериментатор помогал ему. После обнаружения платформы животное находилось на ней 30с. Последующие 4 сеанса по продолжительности составляли 60с. В случае не обнаружения платформы животное вынималось из бассейна и находилась за границами лабиринта в течение 30 с. Расположение платформы за все время проведения теста не менялось и находилось в противоположном от запуска животного секторе на границе зоны тигмотаксиса (Morris, 1982;

64

Morris, 1984; Dalm et al. 2000). Установка для видеорегистрации движения животного представляет собой видеокамеру, расположенную над бассейном. Камера фиксирует треки животного. Эта информация подается на персональный компьютер и сохраняется в виде avi-файлов. Проводится видеорегистрация траектории движения и компьютерный анализ данных.

Через 24 часа после окончания обучения животные подвергались острой гипобарической гипоксии, через сутки после которой проводили тестирование на сохранение долговременной памяти. Тест состоял из одной пробы длительностью 60 с. При этом платформа в лабиринте отсутствовала. Определяли отсроченный коэффициент сохранения долговременной памяти (оКс), представляющий собой долю времени пребывания мыши в квадранте, где находилась платформа, по отношению в общему времени пребывания в водном лабиринте Морриса. При этом считается нормой, если животное провело в квадранте, где находилась платформа, около 25% общего времени пребывания в лабиринте (D’Hooge R. & De Deyn P.P, 2001).

Анализ данных выполнялся с помощью разработанного в программной среде Matlab оригинального пакета алгоритмов MouseTrack и Traceman. При оценке результатов значимыми считались следующие показатели: время достижения платформы, траектория свободного плавания при поиске платформы.

2.10 Статистическая обработка результатов

Полученные результаты in vivo и in vitro обрабатывались статистически с помощью пакета прикладных программ Microsoft Exel, и SigmaPlot 11.0. Данные представлены в форме "среднее значение ± стандартная ошибка среднего". Проверка гипотезы о нормальном распределении проводилась с применением критерия Пирсона, который не зависит ни от вида распределения случайной величины, ни от ее размерности. Достоверность статистических различий выборок, имеющих нормальное распределение,

65

проверялась с помощью t-теста Стьюдента. Различия между выборками, имеющими распределение, отличающееся от нормального, оценивались с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни в программе SigmaPlot 11.0. Различия между выборками считались статистически значимыми при p < 0,05.

66

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1Исследование антигипоксического и нейропротекторного действия N-арахидоноилдофамина при моделировании гипоксии in vitro

3.1.1Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную биоэлектрическую активность культивируемых клеток гиппокампа при

моделировании гипоксии

На 21–й DIV в культурах наблюдалась стабильная спонтанная сетевая биоэлектическая активность. В течение 10-минутной гипоксии происходило значительное (более чем в 6 раз) снижение спонтанной активности, тогда как реоксигенация вызывала ее усиление. Во время острой 10 минутной нормобарической гипоксии происходило снижение числа пачек с 25,03±6,12 за 10 минут до 4,28±1,52 (р<0,05). В период реоксигенации спонтанная биоэлектрическая активность значительно усиливалась, число малых сетевых пачек составило 68,5±19,87, что достоверно выше исходных значений (рис. 7).

В дальнейшем в постгипоксическом периоде происходило необратимое достоверное снижение пачечной активности вплоть до ее практически полного прекращения к 7-м суткам, что свидетельствует о нарушении синаптических связей в сети, формирующей индивидуальный характер функционирования каждой культуры. Через 1 сутки после гипоксического воздействия количество малых сетевых пачек импульсов за 10 минут снижалось с 25,03±6,12 до 3,89±2,1, а через 7 суток – до 1,52±0,75.

Главной причиной угнетения спонтанной биоэлектрической активности нейронной сети во время гипоксии является недостаточность энергетических субстратов, необходимых для поддержания активного метаболизма клеток. Резкое падение парциального давления кислорода приводит к разобщению процессов окислительного фосфорилирования в

67

митохондриях, и, как следствие, происходит снижение синтеза АТФ (Проблемы гипоксии, 2004). Гликолиз не может удовлетворить энергетические потребности нейрона.

Рисунок 7. Динамика спонтанной электрической активности нейронов первичной культуре клеток гиппокампа после гипоксии (количество малых

пачек импульсов за 10 минут), 21-28 DIV: 1 – до гипоксии, 21 DIV; 2 – гипоксия, 21 DIV; 3 -10 мин реоксигенации, 21 DIV; 4 – 2 часа после гипоксии, 21 DIV; 5 – 1 сутки после гипоксии, 22 DIV; 6 – 7 сутки после гипоксии, 28 DIV. * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни

Повышенная сетевая активность нейронов после реоксигенации может быть связана с усиленным высвобождением возбуждающего нейротрансмиттера глутамата из пресинаптических терминалей пирамидных нейронов в составе сети, либо со снижением активности тормозных ГАМКергических нейронов. Усиление высвобождения глутамата, вероятно, обусловлено стимуляцией экзоцитоза повышенной в пресинаптических терминалях в результате его выброса из внутриклеточных депо, в частности, из деполяризованных при гипоксии митохондрий

68

(Stelmashook, 2010). Известно, что усиление выброса глутамата является критическим фактором развития эксайтотоксичности, опосредуемой повышением [Cа2+]i в постсинаптической клетке и запуском каскада патологических метаболических реакций, приводящих к гибели нейронов (Iwabuchi et al., 2013). Кроме того, недостаток кислорода стимулирует процессы свободно-радикального окисления в клетке, что может стать основной или дополнительной причиной гибели клетки при реоксигенации. Следует отметить, что структура малых сетевых пачек достоверно изменялась только в отдаленном постгипоксичеком периоде. Количество спайков в малой сетевой пачке импульсов в период гипоксии, при реоксигенации и через 2 часа после гипоксического воздействия изменялось незначительно, хотя наблюдалась тенденция к его увеличению (рис. 8). Через сутки после гипоксического воздействия число спайков в малой сетевой пачке достоверно снижалось (в 4-6 раз), в дальнейшем постгипоксическом периоде снижение количества спайков продолжалось и к 7 суткам постгипоксического периода число спайков в малых сетевых пачках импульсов снижалось в 10-20 раз относительно исходного уровня.

Длительность пачек также практически не изменялась во время острой гипоксии и в период реоксигенации, существенных изменений не наблюдалось вплоть до 7 суток постгипоксического периода (рис. 9), когда происходило ее достоверное снижение (исходная длительность малой сетевой пачки импульсов составляла 0,18±0,61 с, а через 7 суток после гипоксии – 0,05±0,03 с).

Аппликация N-ADA в концентрации 10 мкМ предотвращала нарушение биоэлектрической активности. Во время гипоксии количество сетевых пачек в присутствии N-ADA также достоверно снижалось относительно исходного уровня (9,58±2,1 пачки/10 мин), однако в период реоксигенации их число не отличалось от аналогичного показателя в культурах, не подвергавшихся гипоксии (рис.7).

69

Рисунок 8. Динамика спонтанной электрической активности нейронов первичной культуре клеток гиппокампа после гипоксии (количество спайков в пачке), 21-28 DIV: 1 – до гипоксии, 21 DIV; 2 – гипоксия, 21 DIV; 3 – 10

мин реоксигенации, 21 DIV; 4 – 2 часа после гипоксии, 21 DIV; 5 – 1 сутки после гипоксии, 22 DIV; 6 – 7 суток после гипоксии, 28 DIV. * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни

Вероятно, аппликация N-ADA предотвращала гиперактивацию нейронных сетей во время реоксигенации, поскольку механизм DSE ингибировал чрезмерный выброс возбуждающих нейромелиаторов, что позволяло клеткам сохранять свои энергетические ресурсы.

В постгипоксическом периоде N-ADA поддерживал спонтанную биоэлектрическую активность нейронов, так что она по своим параметрам статистически не отличалась от исходного уровня (20,1±5,67 пачек/10 мин), в то время как в контрольных культурах уже на 1 сутки число пачек имульсов было достоверно ниже, чем до гипоксии.

На 7 сутки постгипоксического периода количество малых сетевых пачек в группе опытных культур, которым апплицировался N-ADA 10 мкМ, достоверно снижалось по сравнению с исходными значениями, однако оставалось существенно выше, чем в отсутствие N-ADA (8,66±2,01 и

70

1,5±0,27, соответственно). Кроме того, N-ADA предотвращал изменение длительности сетевой пачки и среднего числа спайков в пачке (рис. 8 и 9), как минимум, в течение 7 суток после гипоксического воздействия.

Рисунок 9. Динамика спонтанной электрической активности нейронов первичной культуре клеток гиппокампа после гипоксии (длительность пачек импульсов), 21-28 день in vitro: 1 – до гипоксии, 21 DIV; 2 – гипоксия, 21 DIV; 3 – 10 мин реоксигенации, 21 DIV; 4 – 2 часа после гипоксии, 21 DIV; 5

– 1 сутки после гипоксии, 22 DIV; 6 – 7 сутки после гипоксии, 28 DIV. * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05)

критерий Манна-Уитни

Построение графиков спайковой активности и растровых диаграмм, отражающих моменты возникновения спайков на электродах матрицы, позволило установить, что количество спайков в пачке за 50 мс в контрольных культурах через 24 часа после гипоксии в среднем статистически достоверно снижается относительно исходного уровня в 3,8 раза (р<0,05, критерий Манна-Уитни), с тенденцией к уменьшению длительности сетевой пачки импульсов (рис. 10).