2 курс / Гистология / Митрошина_Е_В_Антигипоксическое_и_нейропротекторное_действие_N_

51

Таблица 2. Распределение групп животных и методик оценки антигипоксического

действия N-ADA in vivo

2.3 Культивирование первичных диссоциированных клеток гиппокампа

Диссоциированные клетки гиппокампа культивировали в течение 21-28 дней in vitro (DIV). Для исследования спонтанной биоэлектрической активности культуры выращивали на мультиэлектродных матрицах систем MEА60 (Multichannel Systems, Германия) и MED64 (AlfaMed Science, Япония). Для

52

исследования кальциевой активности и проведения иммуноцитохимических исследований клетки культивировали на покровных стеклах размером 18х18 мм, для оценки жизнеспособности культур – на 48-луночных планшетах

(Сostar).

Перед извлечением гиппокампа беременную мышь (Е18) эвтаназировали дислокацией шейных позвонков, извлекали матку с эмбрионами, из каждого эмбриона выделяли головной мозг, который помещали в стерильный раствор Хенкса. После извлечения гиппокампов их механически измельчали, измельченную ткань подвергали ферментативной обработке, помещая ее в 0,025% растворе трипсина на 20 мин в СО2-инкубатор при 35,5оС, затем тщательно промывали в фосфатном буфере, суспендировали пастеровской пипеткой в питательной среде: 92,5% нейробазальной среды NBM (Neurobasal medium, Invitrogen, США), 5% эмбриональной телячьей сыворотки FCS (ПанЭко, Россия), 2% биоактивной добавки B27 (Invitrogen, США) и 0,5% L-глутамина (Invitrogen, США), центрифугировали 1 мин при 1500 об/мин, удаляли супернатант, осажденную ткань промывали питательной средой и ресуспендировали. Полученную суспензию клеток использовали для культивирования на квадратных покровных стеклах (18х18 мм), помещенных в чашки Петри диаметром 30 мм, в 48-луночных планшетах или на мультиэлектродных матрицах, предварительно обработанных адгезивным субстратом (полиэтиленимином) в концентрации 0,5 мг/мл. В центр каждого стекла, лунки или матрицы наносили по 40 мкл суспензии и через 2 часа, после прикрепления клеток к субстату, к ним добавляли по 1 мл питательной среды. Культуры помещали в СО2-инкубатор (5% СО2 и 95% атмосферного воздуха) при температуре 35,5оС. Через день после посадки половину среды во всех культурах заменяли на среду с низким содержанием сыворотки (94,5% NBM, 4% B27, 1% L-glutamin, 0,5% FCS).

Каждые 3 дня в культурах на стеклах, в планшетах и на матрицах объем питательной среды по мере необходимости доводили до исходного (Мухина с соавт., 2009).

53

2.4Методы оценки сетевой активности нейронов in vitro

2.4.1Спонтанная биоэлектрическая активность

2.4.1.1Мультиэлектродные матрицы MED64 и MEA60

Мультиэлектродная система MED64, основанная на технологии плоских микроэлектродов, позволяет непрерывно и неинвазивно регистрировать от различных участков препарата спонтанную и вызванную биоэлектрическую активность нейронов в виде внеклеточных потенциалов. Благодаря низкому импедансу микроэлектродов, регистрация активности осуществляется с низким уровнем шума. Мультиэлектродная система состоит из четырех компонентов: усилитель, зонд, коннектор, и набор программного обеспечения Conductor™ для получения данных. Стеклянное основание зонда (50x50x0,7мм) содержит цилиндрическую камеру диаметром 22 мм и высотой 5 мм, в центре которой на площади 1 мм2 расположена 64-электродная матрица для регистрации спонтанной активности и электрической стимуляции нейронов. Квадратные микроэлектроды состоят из прозрачного оксида индия и олова (Indium Tin Oxide, ITO), покрытого черной платиной (рис. 6). Размер электродов – 50х50 мкм, межэлектродное расстояние – 100 мкм. Изолирующее покрытие – полиакриламид.

В возбужденном состоянии нейроны создают потоки ионов через мембраны, изменяя напряжение внутри и снаружи клетки. При регистрации активности нейронов электроды на MEA преобразовывают изменение напряжения окружающей среды (ионные потоки) в потоки, переносимые электронами (электрический ток).

54

Рисунок 6. Общий вид подложки с электродами, расположение электродов на мультиэлектродной матрице MED64 (Alfa Med Science, Япония) и их структура (пояснения в тексте)

При регистрации электрической активности амплитуда потенциала на электроде находится в обратной зависимости от расстояния от этого электрода до клетки, продуцирующей потенциал. Таким образом, клетки по возможности должны находиться к электроду как можно ближе, что в случае диссоциированных культур достигается применением опорного субстрата, усиливающего адгезию клеток, например, полиэтиленимина.

Второй использованной мультиэлектродной системой являлась MEA60 (Multichannel Systems, Германия) – аналог системы MED64, состоящий из 60 планарных круглых электродов, каждый диаметром 30 мкм, с межэлектродным расстоянием 200 мкм. Электроды сделаны из нитрида титана и изолированы нитридом кремния, что позволяет MEA60 подвергать стерилизации при высоких температурах перед посадкой культур и использовать их длительное время.

2.4.1.2 Регистрация и анализ спонтанной сетевой биоэлектрической активности нейронов

Спонтанную биоэлектрическую активность нейронов регистрировали с использованием мультиэлектродной системы MED64 и MEA60 при

55

стандартных условиях окружающей среды: температура, содержание углекислого газа и кислорода, влажность. Для получения данных использовали набор программного обеспечения Conductor™ (Alpha Med Science, Япония) и MC RackTM (Multichannel Systems, Германия).

Анализ спонтанной активности нейронов производили с использованием программы MATLAB и оригинального пакета алгоритмов MEAMAN. Детектирование спайков (внеклеточных потенциалов действия) шло по следующему алгоритму: выбиралась граница равная 8σ, где σ – среднеквадратичное число. Если амплитуда спонтанной активности превышало это число, то считалось, что данное событие – спайк, если не превышало, активность распознавалась как шум и не учитывалась при анализе данных. Далее по определенным алгоритмам программа детектировала количество пачек спайков в записи, высчитывала средний межпачечных интервал, среднее количество спайков в пачке, среднюю длительность пачки. Для разделения различных этапов записи программа снабжена функцией удаления спайков за определенный промежуток времени.

2.4.2 Функциональный кальциевый имиджинг

Для имиджинговых исследований функциональной активности по параметру изменений [Ca2+]i, отражающих функциональное состояние кальциевого гомеостаза клеток, использовался лазерный сканирующий микроскоп LSM 510 (Zeiss, Германия). Методика позволяла визуализировать функциональную архитектуру нейрональной сети культуры на клеточном уровне. В качестве флуоресцентных зондов были выбраны специфический кальциевый краситель Oregon Green 488 BAPTA-1 АМ (OGB1) (Invitrogen) с

константой диссоциации Кd=170 нМ, возбуждаемый линией излучения аргонового лазера 488 нм, и Са2+-нечувствительный краситель

Sulforhodamine 101 (SR101) (Sigma), возбуждаемый излучением гелий-

неонового лазера 543 нм, селективно маркирующий глиальные клетки

56

(Nimmerjahn et al., 2004; Paredes et al., 2008). Эти длины волн близки к максимумам спектров поглощения соответствующих красителей. Излучение флуоресценции разделялось по каналам регистрации с помощью дихроичных зеркал и светофильтров с полосой пропускания 650-710 нм для выделения флуоресценции SR101 и 500-530 нм для выделения флуоресценции OGB1 (Митрошина с соавт., 2011).

Регистрировались временные серии изображений поля флуоресценции красителей Sulfophodamine 101 (SR101) как глиального маркера, и OGB1 как индикатора свободного кальция. Первичная обработка полученных изображений заключалась в разделении спектров этих красителей в разные каналы регистрации для идентификации нейрональных и глиальных клеток и записи функции F(t) средней интенсивности флуоресценции OGB1 выделенной области поля (совпадающей, как правило, с телом или частью отростка клетки) от времени. Интенсивность флуоресценции (усл. ед.) показывала зависимость [Ca2+]i от времени, свидетельствующую о метаболической активности клеток, связанных в сети определенной архитектуры. Выделение кальциевых осцилляций, полученных при помощи флуоресцентной конфокальной микроскопии, проводили с использованием оригинального программного пакета «Astroscanner». Анализировались записи функции F(t) средней интенсивности флуоресценции OGB1 выделенной области поля (совпадающей, как правило, с телом или частью отростка клетки) от времени. Для определения времени начала (Tstart) и конца (Tend) осцилляции был взят порог отклонения от среднего значения в размере стандартной квадратичной ошибки F(t). Отмечалось также время достижения максимальной интенсивности флуоресценции (Tmax) для каждой осцилляции. Учитывались следующие параметры: длительность достижения максимума (длительность «фронта» осцилляции), общая длительности осцилляции и интервалы между максимумами (Митрошина с соавт., 2011; Захаров с соавт., 2012; Zakharov et al., 2013).

57

Исследование влияния N-ADA на спонтанную кальциевую активность проводилось на 21-й DIV после 10-минутного гипоксического воздействия. Опытным группам при замене среды на гипоксическую, при реоксигенации и на следующие сутки проводилась аппликация N-ADA в разных концентрациях, а также аппликация N-ADA в сочетании с антагонистами CBR. К контрольной группе культур исследуемые вещества не добавлялись. В интактной группе осуществлялась полная смена нормоксической среды. Функциональный кальциевый имиджинг проводился во время моделирования гипоксии и на 7 сутки постгипоксического периода (табл. 1).

2.5 Иммуноцитохимические методы

Для характеристики состояния ЭКС при гипоксии в культуре клеток гиппокампа было проведено иммуноцитохимическое маркирование CBR-1 и CBR-2. Для маркирования CBR-1 использовались первичные кроличьи антитела (Аbcam) и вторичные козьи антитела, конъюгированные с Alexa 555 (Invitrogen), для маркирования CBR-2 – первичные козьи антитела (Sigma) и вторичные куриные антитела, конъюгированные с Alexa 555 (Invitrogen). Для идентификации глиальных клеток использовали первичные куриные антитела к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) (Аbcam) и вторичные ослиные антитела, конъюгированные с Alexa 430 (Invitrogen). Нейроны маркировались мышиными антителами к белку цитоскелета MAP2 (Millipore) и вторичными ослиными антителами, когъюгированными с Alexa 647 (Invitrogen).

После 15-минутной фиксации в 4% параформальдегиде культуры трижды отмывали фосфатным буферным раствором (PBS) (Sigma), затем в течение 30 минут проводили демаскирование антигенов 0,03% раствором тритона Х100. После демаскировки культуры гиппокампа в течение 2 часов инкбировали во влажной камере с раствором первичных антител с 1% бычьим сывороточным альбумином при комнатной температуре. Затем после

58

трехкратной промывки PBS культуры в течение 2 часов инкубировали с раствором вторичных антител с 5% бычьим сывороточным альбумином во влажной камере. После отмывки вторичных антител проводили визуализация полученных результатов.

Для визуализации использовали конфокальный микроскоп LSM 510 (Zeiss, Германия). Максимальное значение коэффициента поглощения флуоресцентного маркера Alexa 647, с помощью которого визуализовались нейроны, регистрировалось при длине волны 647 нм, излучения – 668 нм. Флуоресценция маркера возбуждалась излучением аргонового лазера 633 нм выделялась полосовым светофильтром 650 - 710 нм и отображалась на экране монитора красным цветом. Для Alexa 430 максимальное значение коэффициента поглощения регистрируется при длине волны 434 нм, излучения – 539 нм. Флуоресценция маркера возбуждалась излучением гелий-неонового лазера 543 нм, выделялась полосовым светофильтром 500530 нм и выводилась на экран синим цветом. Для Alexa 555 максимальное значение коэффициента поглощения регистрируется при длине волны 555 нм, излучения – 565 нм. Флуоресценция возбуждалась излучением аргонового лазера 488 нм, выделялась полосовым светофильтром 500-550 нм и выводилась на экран зеленым цветом.

Для исследования влияния N-ADA на экспрессию CBR при гипоксии, кульуры на покровных стеклах на 21-й DIV подвергали 10-минутному гипоксическому воздействию. В культуры опытных групп при замене среды на гипоксическую, при реоксигенации и на следующие сутки вводили N- ADA 10 мкМ. К культуры контрольной группы исследуемые вещества не добавлялись. В интактной группе осуществляли полную смену нормоксической среды. Иммунногистохимическое окрашивание проводили на 7 сутки постгипоксического периода (табл. 1). Для анализа полученных иммуноцитохимических результатов использовали программу ImageJ, для статистической обработки данных SigmaPlot 11.0.

59

2.6 Оценка жизнеспособности культивируемых клеток в диссоциированной культуре

Оценка жизнеспособности клеток, культивируемых в 48-луночных планшетах, проводилась в период нормоксии (21 DIV) и через 1, 3, 7 и 10 суток после гипоксического воздействия. В культуры опытных группа при замене среды на гипоксическую, при реоксигенации и на следующие сутки добавляли N-ADA в разных концентрациях, а также N-ADA в сочетании с антагонистами CBR. В культуры контрольной группы исследуемые вещества не добавлялись.

Для оценки жизнеспособности культур их окрашивали пропидий иодидом (Sigma) и бис-бензимидом (Sigma) с целью идентификации ядер погибших клеток и общего количества клеток в культуре, соответственно. С помощью флуоресцентного инвертированного микроскопа DMIL HC (Leica, Германия) осуществлялся подсчет числа клеточных ядер, окрашенных пропидий иодидом и бис-бензимидом. Максимальный коэффициент поглощения у пропидий иодида регистрировался при 488 нм, флуоресцирует данный краситель в красной области спектра, максимум эмиссии составляет 562-588 нм. Максимальный коэффициент поглощения бис-бензимида регистрировался при 350 нм, флуоресценция регистрировалась в диапазоне

510-540 нм.

Количество живых клеток рассчитывалось как разница между числом бис-бензимид-позитивных и пропидий иодид-позитивных клеток (Ведунова с соавт., 2012, 2013).

2.7 Моделирование нормобарической гипоксии in vitro

Гипоксию in vitro моделировали на 21-й DIV путем замены на 10 минут нормоксической культуральной среды на среду без кислорода. Для вытеснения кислорода из среды ее насыщали инертным газом аргоном,

60

способным вытеснять кислород из жидкостей за счет большей растворимости по сравнению с кислородом. Химическая инертность аргона обеспечивает адекватные условия для проведения эксперимента. Аргон подавали из баллона по газоотводной трубке с иглой на конце, под давлением 1-1,5 МПа, течение 10 мин в среду, помещенную в герметичный сосуд. Для того, чтобы в сосуде не накапливалось избыточное давление, выше уровня жидкости находился конец второй иглы, соединенной с выводящей газоотводной трубкой.

Концентрация растворенного кислорода в среде определяли методом йодометрического титрования (метод Винклера) (Лурье, 1973). Данный метод основан на способности гидроксида марганца (II) окисляться в щелочной среде до гидроксида марганца (IV), количественно связывая при этом кислород. В кислой среде гидроксид марганца (IV) снова переходит в двухвалентное состояние, окисляя при этом эквивалентное связанному кислороду количество йода. Выделившийся йод оттитровывают раствором тиосульфата натрия в присутствии крахмала в качестве индикатора. При насыщении среды инертным газом содержание кислорода снижалось с 3,26 мл/л (нормоксия) до 0,37 мл/л (гипоксия). Для предотвращения насыщения среды кислородом воздуха, культуры помещали в гипоксическую камеру, представляющей собой пластиковую чашку Петри (Corning) диаметром 100мм с двумя вмонтированными пластиковыми штуцерами для подключения газовых шлангов. Для герметизации нижняя часть чашки Петри проклеена уплотнительной резиной. К первому штуцеру присоединен шланг, который через редуктор соединен с газовым баллоном. Ко второму штуцеру присоединен газоотводный шланг. После замены нормоксической среды на гипоксическую культуру помещали в камеру, после чего в течение 1 мин через камеру пропускали аргон при открытом газоотводном шланге. Затем перекрывали сначала газоотводный шланг, а потом шланг, по которому поступал аргон. В таком положении камера с помещенной в нее клеточной культурой оставалась еще на 9 минут. Суммарное время гипоксичекого