2 курс / Гистология / Митрошина_Е_В_Антигипоксическое_и_нейропротекторное_действие_N_

11

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на Международном симпозиуме «Topical Problems of Biophotonics — 2009» (Нижний Новгород, 2009), XIV Нижегородской сессии молодых ученых «Естественные науки науки» (Нижний Новгород, 2009), XV Международной конференции по нейрокибернетике (Нижний Новгород, 2009), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), Всероссийской конференции с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология»» (Пущино, 2009), VI международном конгрессе «Оптика – XXI век» (Санкт – Петербург, 2010), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), 7-м Международном Европейском форуме нейронаук (7th FENS forum of European Neuroscience, Amsterdam, 2010), Международной конференции «Speckle2010:speckle fields forever” (Brazil, Florianopolis, 2010), Международном симпозиуме «Topical Problems of Biophotonics — 2011» (St. Peterburg – Nizhny Novgorod, 2011), X научной сессии молодых ученых и студентов «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2011), IV Всероссийском Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012),

Международном конгрессе «International Brain Injury Association's Ninth World Congress on Brain Injury» (Edinburgh, Scotland, 2012); Международном симпозиуме «Topical Problems of Biophotonics-2013» (Нижний Новгород, 2013); ХХII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013); X международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2014); Международном симпозиуме «International Scientific School «Frontiers in modern neuroscience» (Nizhny Novgorod, 2014); Международном симпозиуме «8th International Symposium on Neuroprotection and Neurorepair» (Magdeburg, Germany, 2014); 9-м Международном Европейском форуме нейронаук «9th FENS Forum of Neuroscience» (Milan, Italy, 2014).

12

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Эндогенная каннабиноидная система

Азиатское растение cannabis, или конопля (Cannabis sativa/indica)

применяется различными народами мира в медицинских целях более 5000 лет. Оно относится к семейству Cannabacea и порядку Urticales. Препараты из листьев и цветов этого растения обладают психотропным эффектом и используются для производства марихуаны и гашиша. Первым изолированным растительным каннабиноидом был каннабинол, полученный из экстракта конопли еще в конце XIX века. Химический синтез каннабинола впервые осуществлен в 1940 г. в лабораториях Р. Адамса в США и Тодда в Англии (Pertwee, 2006). Научный интерес к Cannabis sativa значительно возрос в середине 60-х годов XX века, после того, как группой исследователей под руководством Gaoni было показано, что основным действующим началом экстрактов конопли является 9- тетрагидроканнабинол (ТГК) (Gaoni et al., 1964). После определения химической структуры растительных каннабиноидов и дальнейшего синтеза их высокоэффективных аналогов были выявлены и клонированы каннабиноидные рецепторы первого и второго типов, CBR-1 и CBR-2 (Mechoulam et al., 1995; Sugiura et al., 1995). Это позволило предположить существование эндогенных лигандов CBR – эндоканнабиноидов (ЭК), первым из которых был обнаружен амид арахидоновой кислоты с этаноламином, получивший название анандамид (Devane et al., 1992). По современным представлениям, CBR и их эндогенные лиганды входят в состав эндогенной каннабиноидной системы (ЭКС), которая включает в себя также белки биосинтеза, деградации и, возможно, транспорта ЭК (Хаспеков, Бобров, 2006; Zhang et al., 2009). На сегодняшний день известно, что ЭКС играет важную роль в регуляции процессов метаболизма, боли, воспаления, а также обучения, памяти, пищевого и оборонительного поведения (Riedel, Davies, 2005; Pertwee, 2006). Важно отметить, что активация CBR-1

ответственна за поведенческие реакции у животных, представляющие собой

13

классическую каннабиноидную тетраду (гипотермия, каталепсия, анальгезия, сниженная двигательная активность) (Adams, Martin, 1996). Установлено, что ЭК участвуют в регуляции синаптической передачи, активируя CBR на пресинаптических терминалях различных типов нейронов, что приводит к торможению выброса нейромедиаторов (Kano et al., 2009; Szabo, Schlicker, 2005). При этом ЭКС вносит ощутимый вклад в процессы кратковременной пластичности, а ее активация может вызывать длительную депрессию по пока недостаточно изученному механизму (Hashimotodani et al., 2007).

1.1.1. Лиганды каннабиноидных рецепторов. N-арахидоноилдофамин

Все агонисты CBR принято подразделять на растительные (фитоканнабиноиды), эндогенные и синтетические. Среди фитоканнабиноидов (рис. 1), в состав которых входит более 60 соединений, полученных из растения C. sativa, впервые выделенным и наиболее хорошо изученным является 9-тетрагидроканнабинол (ТГК), который отвечает за психоактивные эффекты экстрактов конопли и является агонистом обоих типов CBR. Другой фитоканнабиноид, каннабидиол, не является лигандом CBR, однако он оказывает значительное каннабимиметическое действие, проявляя антиоксидантные свойства, ингибируя деградацию анандамида и, возможно, взаимодействуя с другими, пока не изученными, CBR.

Наиболее известными эндогенными лигандами CBR (рис. 2) в настоящее время являются анандамид (АNА) и 2-арахидоноилглицерин (2- AG). Среди других ЭК выделяют ноладиновый эфир (2- арахидоноилглицерил эфир), виродамин и N-арахидоноилдофамин (N-ADA), однако их биологическая роль и биохимические характеристики в значительной степени остаются неизученными (Pertwee, 2006).

14

Рисунок 1. Химическая структура фитоканнабиноидов (Szabo, 2008)

Наиболее известными эндогенными лигандами CBR (рис. 2) в настоящее время являются анандамид (АNА) и 2-арахидоноилглицерин (2- AG). Среди других ЭК выделяют ноладиновый эфир (2- арахидоноилглицерил эфир,), виродамин и N-арахидоноилдофамин (N-ADA), однако их биологическая роль и биохимические характеристики в значительной степени остаются неизученными (Pertwee, 2006). Различные канабиноиды проявляют различную аффинность к разным типам CBR: некоторые являются агонистами преимущественно CBR-1 (N-ADA, АNА, ноладиновый эфир), другие представляют собой неселективные агонисты обоих типов CBR (2-AG, виродамин и др.) (Bisogno et al., 2000; Howlett et al., 2004; Massi et al, 2008; Szabo, 2008).

Синтетические лиганды CBR характеризуются большим разнообразием химического состава. Обычно их подразделяют на следующие категории: классические каннабиноиды, сохраняющие трициклическую дитерпеновую структуру ТГК (HU-210, HU-234, каннабидиол и т.д.), неклассические каннабиноиды (CP55940, CP47497, CP55244), аминоалкилиндолы (WIN 55.212- 2 и селективные агонисты CBR-1) и эйкозаноиды, которые метаболически более устойчивы и обладают большей селективностью, чем

15

классические каннабиноиды (O-1861, O-585, и O-689) (Szabo, 2008; Palazuelos et al., 2006).

Рисунок 2. Химическая структура эндогенных лигандов каннабиноидных рецепторов (Szabo, 2008)

N-ADA относится к группе N-ацилдофаминов (амидов длинноцепочечных жирных кислот) и представляет собой амид арахидоновой кислоты с дофамином (Bobrov et al., 2008). Изначально N-ADA был синтезирован для изучения эндованилоидной системы из-за его сходства с капсаицином (агонистом TRPV1), в котором молекула дофамина также сопряжена с арахидоновой кислотой. Затем его определили, как эндогенное соединение, которое синтезируется в основном в стриатуме, черной субстанции, гиппокампе, мозжечке и является агонистом СВR (Huang et al., 2002). Было показано, что он в 40 раз селективнее связывается с CBR-1, чем с CBR-2, и практически не связывается с дофаминовыми рецепторами (Bisogno et al., 2000). Поскольку N-ADA также активирует и TRPV1 (Caterina, Julius, 2001; van der Stelt, Di Marco, 2004; Bradshow, Walker, 2005), его

16

характеризуют как CBR-1/TRPV1 гибридный лиганд. Было показано, что связывание N-ADA с TRPV1 и CBR-1 приводит к деполяризации мембраны и повышению концентрации внутриклеточного кальция ([Ca2+]i) в дорсальных ганглиях (Huang et al., 2002; Sagar et al., 2004). Однако рядом других исследователей кальциевый ответ на действие N-ADA или капсаицина в культурах нейронов гиппокампа не обнаружен (Crawford et al., 2009). Показано, что в гиппокампе N-ADA усиливает тормозные процессы за счет стимуляции ГАМК-ергической передачи (Huang et al., 2002).

N-ADA при связывании с CBR-1 в присутствии антагониста TRPV1, IRTX, в концентрации 10 мкМ тормозит выброс глутамата из пресинаптических терминалей дофаминергических нейронов черной субстанции, и, напротив, усиливает выброс глутамата при связывании с

TRPV1 в присутствии антагониста CBR-1 АМ 281 (Marinelli et al., 2007).

Авторами было показано, что для эффективного связывания с TRPV1 необходимо участие мембранного транспортера эндоканнабиноидов (EMT), что объясняется расположением связывающего сайта. Следует отметить, что в отсутствие антагонистов CBR-1 или TRPV1, высвобождение глутамата нейронами черной субстанции существенно не изменялось, что, очевидно, связано с одновременной стимуляцией рецепторов обоих типов.

Кроме регуляции синаптической передачи, N-ADA индуцирует термальную гипералгезию, стимулирует спонтанную и термически вызванную активность в спинальных ноцицептивных нейронах и оказывает действие на сократительную активность гладких мышц за счет активации TRPV1, а также проявляет сосудорасширяющее действие, активируя как

CBR-1, так и TRPV1 мелких сосудов брыжейки (Price et al, 2004; O'Sullivan et al, 2004; Huang and Walker, 2006)

При парентеральном введении животным N-ADA в концентрациях 1-10 мг/кг вызывает классическую каннабиноидную тетраду (гипотермия, анальгезия, снижение локомоторной активности и каталепсия), действуя, так же, как и классический агонист CBR-1. Этот эффект блокируется

17

антагонистом CBR-1, но не блокируется антагонистами дофаминовых рецепторов (Bisogno et al., 2000).

Таким образом, N-ADA может действовать как про-, так и эндоканнабиноид, в зависимости от того, взаимодействует ли он с TRPV1 или CBR-1, соответственно.

1.1.2. Биосинтез и деградация эндоканнабиноидов

Каннабиноиды синтезируются и реализуются локально on demand (по требованию). Таким образом, уровень их генерации не является постоянным, а кинетика их деградации является основным фактором их активности. В естественных условиях, как полагают, синтез анандамида происходит путем ферментативного гидролиза фосфолипазой D мембранного предшественника

- N-арахидоноил фосфотидилэтаноламина (Schmid et al., 1983; Deutsch, Chin, 1993). N–арахидоноил фосфотидилэтаноламин формируется путем ферментативного переноса арахидоновой кислоты из sn-1 положения мембранного фосфотидилхолина на аминогруппу фосфотидилэтаноламина

(Cadas et al., 1997; Sugiura et al., 2002). Никаких конкретных трансацилаз,

катализирующих данный процесс, на сегодняшний день не идентифицировано, однако некоторым исследователям удалось клонировать специфичную для N–арахидоноил фосфотидилэтаноламина фосфолипазу D (Okamoto et al., 2004). Возможны и другие варианты синтеза анандамида. Так, например, в желудке секреторная фосфолипаза А2 может катализировать конверсию N-ацил фосфотидилэтаноламина в N-ацил лизофосфотидилэтаноламид. Далее под действием лизофосфолипазы D образуются соответствующие N-ацилэтаноламиды, в том числе, анандамид (Sun et al., 2005). Другой альтернативный путь был описан в RAW246.7- макрофагах, где происходит гидролиз N-арахидоноил фосфотидилэтаноламина до фосфоанандамида с участием фосфолипазы С и дальнейшим действием фосфатазы (Liu et al., 2006).

18

Для N-ADA предполагались два возможных пути биосинтеза. Первый возможный путь – это прямое сопряжение арахидоновой кислоты и дофамина, а другой – через метаболизм предполагаемого N- арахидоноилтирозина (NA-тирозин) (рис. 3).

Рисунок 3. Два предполагаемых метаболических пути биосинтеза N- ADA (Hu et al., 2009)

Показано, что NA-тирозин не является промежуточным продуктом в ходе биосинтеза N-ADA, который синтезируется в первую путем ферментативного сопряжения арахидоновой кислоты с дофамином (Hu et al., 2009). Хотя это сопряжение, вероятно, включает в себя комплекс ферментов, показано прямое участие гидролазы амидов жирных кислот в биосинтезе N- ADA.

Эндоканнабиноиды не хранятся в синаптических везикулах, как другие нейротрансмиттеры. Напротив, они, благодаря своей липидной

19

природе, через постсинаптическую мембрану попадают в синаптическую щель, где связываются с соответствующими рецепторами, часто расположенными пресинаптически.

Таким образом, ЭК могут выступать в качестве сигнальных молекул. Дальнейшие сигнальные пути, опосредуемые CBR, приводят к ингибированию реализации нейромедиаторов, главным образом ГАМК или глутамата, таким образом, ретроградно модулируя синаптическую передачу

(Gómez-Ruiz et al., 2007).

Чтобы прекратить влияние ЭКС, эндогенные лиганды СВR, как и другие нейротрансмиттеры, должны быть инактивированны. Эта инактивация происходит в 2 этапа: ЭК должны быть транспортированы в клетку, возможно, специальной транспортной системой, а затем гидролизованы под действием специальных ферментов (Bari et al., 2006). Анандамид гидролизуется до двух компонентов (арахидоновой кислоты и этаноламина) под действием гидролазы амидов жирных кислот (ГАЖК, FAAH), а 2-арахидоноилглицерол – до арахидоновой кислоты и глицерина под действием моноацилглицероллипазы (МАГЛ, MAGL) (Dinh et al., 2002).

В 1994 г. было обнаружено, что захват анандамида обратно в клетку происходит путем облегченной диффузии (Di Marzo et al., 1994), и что этот процесс зависит от ряда факторов (температуры, чувствительности к субстрату, насыщаемости). Также была показана его независимость от ионных градиентов и гидролиза АТФ, однако возможно влияние оксида азота (Maccarrone et al., 2000). Хотя в последние годы было предпринято немало попыток идентификации специфического транспортера ЭК, его природа до сих пор остается не известной, что порождает все новые споры о его существовании (Glaser et al., 2003). На сегодняшний день, как правило, принято считать, что движение анандамида через клеточную мембрану – процесс насыщаемый, а также предложены различные механизмы поглощения анандамида, в том числе облегченная диффузия (Fegley et al., 2004), простая диффузия с ГАЖК-опосредованным расщеплением

20

анандамида, простая диффузия с внутриклеточной секвестрацией анандамида, или эндоцитоз (McFarland et al., 2004). В отличие от анандамида, об обратном захвате 2-AG практически ничего не известно. Некоторые авторы предполагают, что он попадает в клетку опосредованно специальным транспортером, другие – что использует транспортер анандамида (Bisogno et al., 2000), либо это происходит путем простой диффузии (Beltramo, Piomelli, 2000).

В дополнение к основным ферментам, в процессе утилизации анандамида и 2-AG могут участвовать различные оксигеназы, например, липоксигеназа, цитохром Р450, циклооксигеназа, превращая ЭК в соответствующие соединения простагландина (van der Stelt et al., 2002). Физиологическая роль данных реакций пока не ясна.

1.1.3. Каннабиноидные рецепторы и их локализация в головном мозге

Доказательства существования CBR в мозге были получены в середине 80-х годов (Howlett, Fleming, 1984). На сегодняшний день наиболее полно изучено молекулярное строение и фармакологические свойства двух типов CBR, CBR-1 и CBR-2, принадлежащих к суперсемейству А рецепторов, сопряженных с G-белком. Оба рецептора имеют 7 трансмембранных доменов (альфа-спирали), расположенный внутриклеточно С-конец и внеклеточный гликозилированный N-конец. Филогенетически CBR близки к рецепторам простагландинов (Howlett et al., 2002; Szabo 2008).

Аминокислотная последовательность CBR разных видов животных практически идентична (97-99% гомологии). В состав CBR-1 человека входят 472 аминокислоты, а в CBR-1 мышей и крыс насчитывают 473 аминокислотных остатка. CBR-2 состоит из 360 аминокислот, состав и последовательность которых значительно отличаются от таковых для CBR-1. Сравнение аминокислотной последовательности у мыши и человека выявило