2 курс / Гистология / Митрошина_Е_В_Антигипоксическое_и_нейропротекторное_действие_N_

71

Рисунок 10. Количество спайков за 50 мс (сверху) и растровые диаграммы спонтанной биоэлектрической активности нейронов в культуре клеток гиппокампа (снизу). А - контрольная культура; Б – культура с аппликацией

N-ADA, 10 мкМ

При гипоксии в присутствии N-ADA наблюдалось лишь незначительное (менее, чем на 30%) снижение количества спайков за 50 мс относительно исходной активности нейронов через сутки после гипоксии, тогда как длительность пачки оставалась неизменной.

Таким образом, аппликация 10 мкМ N-ADA предотвращает вызванные гипоксией изменения структуры сетевой пачки импульсов и, следовательно, способствует сохранению паттерна функциональной активности нейронной сети.

При аппликации N-ADA в концентрациях как 10, так и 2,5 мкМ во время гипоксии и в первые сутки после нее негативное влияние гипоксии и реоксигенации на спонтанную биоэлектрическую активность снижалось (рис. 11).

72

Рисунок 11. Показатели спонтанной биоэлектрической активности нейронов в культуре клеток гиппокампа относительно исходного уровня, принятого за 100% (количество пачек импульсов за 10 минут), 21-28 день развития in vitro: 1 – интактные; 2 – контроль; 3 – N-ADA 2,5 мкМ; 4 – N-ADA 10 мкМ; 5 – N- ADA+SR1; 6 — N-ADA+SR2; 7 - N-ADA+ Сpz; * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни

Данный эффект проявлялся в сохранении пачечной активности сети как в первые сутки постгипоксического периода, так и в последующий отдаленный период. Через сутки после гипоксии число пачек снижалось всего на 40% и 41% при использовании обеих концентраций N-ADA (в контрольных культурах число пачек снизилось в 5 раз). На 7 сутки при применении N-ADA в концентрации 10 мкМ число пачек уменьшалось в 4 раза и составило 25,74±9,89% относительно исходного уровня, а при концентрации 2,5 мкМ – в 10,41±2,76% (в контрольных культурах уровень сетевой биоэлектрической активности на 7 сутки постгипоксического периода составил 6,01±1,2% от исходного). Гипоксия/реоксигениция вызывала достоверное уменьшение среднего числа спайков в пачке в первые сутки после гипоксии более чем на 75% (рис. 12).

73

Рисунок 12. Показатели спонтанной биоэлектрической активности нейронов в культуре клеток гиппокампа относительно исходного уровня, принятого за 100% (среднее количество спайков в пачке), 21-28 день развития in vitro: 1 –

интактные; 2 – контроль; 3 – N-ADA 2,5 мкМ; 4 – N-ADA 10 мкМ; 5 – N- ADA+SR1; 6 — N-ADA+SR2; 7 - N-ADA+ Сpz; * - различия в сравнении с показателями «до гипоксии» достоверны (р<0,05) критерий Манна-Уитни

При концентрациях N-ADA 2,5 и 10 мкМ уменьшение среднего числа спайков в пачке на 1 сутки после гипоксии составляло 39,28% и 42,87%, соответственно. К седьмым суткам при 10 мкМ N-ADA отмечалось некоторое увеличение количества спайков в пачке, в то время как при 2,5 мкМ N-ADA продолжалось неуклонное снижение числа спайков (их число составило 26,25% от исходного уровня).

N-ADA может взаимодействовать с тремя типами рецепторов: CBR-1, CBR-2 и TRPV1. Вклад каждого типа рецепторов в реализацию антигипоксического эффекта N-ADA (10 мкМ) исследовался с использованием их селективных антагонистов: SR141716A (для CBR-1), SR14452 (для CBR-2) и капсазепина (для TRPV1). Спонтанная

74

биоэлектрическая активность в данной серии экспериментов регистрировалась на 1 и 7 сутки после гипоксии.

Антагонисты CBR-1, CBR-2 и TRPV1 в интактной культуре клеток гиппокампа не оказывали влияния на активность сети. При гипоксии блокада CBR-1 антагонистом SR141716A (1мкМ) устраняла защитный эффект N- ADA, что выражалось в уменьшении количества малых сетевых пачек импульсов в 10 минут на 1 сутки после гипоксии более чем вдвое и составило 34,3±6,7% от исходного уровня, а на 7 сутки активность полностью отсутствовала (рис. 11). Капсазепин частично снижал антигипоксический эффект N-ADA. Через сутки после гипоксии с аппликацией N-ADA и капсазепина число пачек сетевых импульсов существенно (в 10 раз) снижалось и составляло 6,68±2,5% исходного уровня активности, однако дальнейшего торможения активности не происходило и далее ее уровень сохранялся неизменным вплоть до 7 суток постгипоксического периода. При блокаде CBR-2 антигипоксический эффект N-ADA сохранялся, уровень пачечной активности составил 70,1±14,5% от исходного на 1 сутки и 31,4±8,2 % на 7 сутки постгипоксического периода, что статичтисечки не отличается от группы N-ADA 10 мкМ.

Интересно отметить, что блокада CBR-1 приводила при реоксигенации к резкой активации нейронной сети, что выражалось в виде увеличения количества и частоты спайков в пачке при снижении количества пачек, а в дальнейшем к полному исчезновению биоэлектрической активности (рис. 12).

Мы предполагаем, что защитное действие N-ADA связано с предотвращением чрезмерного выброса возбуждающего нейромедиатора глутамата при гипоксии. При блокаде CBR-1 не происходит ретроградного ингибирования выброса глутамата из пресинаптических терминалей, нейронная сеть гиперактивируется. Чрезмерная стимуляция нейронов, очевидно, приводит к истощению энергетических ресурсов клетки и запуску каскада метаболических реакций, вызывающих гибель клетки.

75

Блокада CBR-2 при гипоксии достоверно снижала спонтанную биоэлектрическую активность (уменьшение количества спайков в малой сетевой пачке более, чем в 10 раз), однако активность сохранялась в течение всего срока наблюдения (7 суток после гипоксии) (рис. 11 и 12). Таким образом, устранение эффекта N-ADA было лишь частичным. Блокада TRPV1, также как и CBR-2, приводило к достоверному снижению активности нейронов и изменению ее паттерна (рис. 12), но в меньшей степени, чем при блокаде CBR-1. Количество спайков в пачке и их частота уменьшалось на 45,83% и 40,76% на первые сутки и на 52,13% и 36,76% на седьмые сутки, соответственно.

Поскольку реализация антигипоксических и нейропротекторных свойств N-ADA полностью ингибируется при блокаде CBR-1, можно предположить, что ключевым молекулярным механизмом в реализации данного эффекта является ретроградное ингибирование выброса глутамата из пресинаптических терминалей по механизму DSE (Kreitzer, Regehr, 2001; Szabo, 2008; Castillo et al., 2012). Активация CBR-1 играет решающую роль в предотвращении нейротоксичности, вызванной активацией глутаматных рецепторов к N-метил-D-аспартату (NMDA-Rs). Данный тип нейротоксичности является одним из важных молекулярных путей запуска ее механизмов при гипоксическом повреждении нервной системы (Won et al., 2012; Mehta et al., 2013). Предотвращая активацию NMDA-Rs путем ингибировая выброса глутамата из пресинаптических терминалей, активация CBR-1 контролирует кальциевые токи, не допуская повышения концетрации кальция до цитотоксического уровня. Следовательно, каннабиноиды, и в том числе N-ADA, могут контролировать уровень активации NMDA-Rs. Одним из аспектов физиологической роли каннабиноидной системы является поддержание NMDA-Rs-активности в безопасных пределах, тем самым осуществляется защита нервных клетки от эксайтотоксичности (SánchezBlázquez et al., 2014).

76

Таким образом, проведенные нами исследования возможных механизмов действия N-ADA на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей в культуре клеток гиппокампа при острой нормобарической гипоксии показало, что все три типа рецепторов участвуют в реализации антигипоксического эффекта, однако ключевую роль играет активация CBR- 1, блокада которых на фоне введения N-ADA приводит к полному устранению антигипоксического эффекта каннабиноида.

3.1.2 Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность культивируемых клеток гиппокампа при моделировании гипоксии

На 21-й день in vitro в клетках гиппокампа наблюдалась синхронизованная спонтанная кальциевая активность. Частота возникновения кальциевых осцилляций в нейронной сети составляла 6,83±1,78 осцилляций в 1 мин. Активность проявляло 83,9±5,57% клеток. При замене нормоксической культуральной среды на гипоксическую (0,37 мл/л О2) происходило снижение спонтанной кальциевой активности клеток гиппокампа вплоть до практически полного ее исчезновения к 3-й минуте наблюдения. Активность сохраняли всего 5,01±1,84 % клеток, частота осцилляций составила 0,14±0,03 осцилляции в минуту. После реоксигенации активность возобновлялась, однако процент активных клеток был существенно ниже, чем до гипоксического воздействия (22,1±7,2%) (рис.13).

77

Рисунок 13. Растровая диаграмма Са2+ осцилляций в культуре клеток гиппокампа при моделировании гипоксии: А - контроль (10 мин гипоксия/реоксигенация без аппликации каннабиноида) Б - N-ADA 10 мкМ (10 мин гипоксия/реоксигенация с аппликацией N-ADA, 10 мкМ)

Антигипоксический эффект N-ADA проявлялся в частичном сохранении спонтанной кальциевой активности во время гипоксии и нормализации кальциевой активности в постгипоксическом периоде. Во время гипоксического воздествия активность сохраняло 24,5±6,91% клеток, изначально проявляющих активность.

Частота кальциевых осцилляций во время гипоксического воздействия снизилась в пять раз (с 6,83±1,78 до 1,3±0,23 осцилляций в минуту). В период реоксигенации уровень кальциевой активности в группе культур, получавших аппликацию N-ADA 10 мкМоль во время гипоксии не отличался от контрольной группы.

78

Оценка гипоксического воздействия на кальциевую активность в отдаленном постгипоксическом периоде проводилась на 7 сутки после гипоксии. Доля клеток в поле зрения, в которых регистрировались спонтанные кальциевые осцилляции, через 7 суток после острой гипобарической гипоксии снижалось с 69,3±5,57 % до 19,06±7,0%. клеток

(рис. 14).

Рисунок 14. Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную кальциевую активность клеток гиппокампа через 7 суток после острой нормобарической гипоксии. * - статистически достоверные (p<0,05) отличия от контрольной группы культур, не подвергавшихся гипоксии, критерий Манна-Уитни # - статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии и не получавших аппликацию эндоканнабиноида, критерий Манна-Уитни.

Применение N-ADA 10 мкМ во время гипоксии и в первые сутки после него предотвращало потерю функциональной кальциевой активности клетками культур гиппокампа. В группе опытных культур, получавших аппликацию N-ADA, доля клеток, проявляющих кальциевую активность составила 56,37±8,69%, что достоверно больше, чем в контрольной группе культур, подвергшихся гипоксическому воздействию. Можно предположить, что существенное снижение уровня спонтанной кальциевой активности

79

связано с гибелью части нейронов в постгипоксическом периоде (см. раздел 3.1.3.), редукцией синаптических контактов и разрушением нейронных сетей. У 60% культур длительность и частота генерации кальциевых осцилляций клетками, сохранившими активность, после гипоксии существенно не изменялась, еще у 40% происходила существенная модификация формы кальциевых осцилляций. 10-минутная гипоксия в таких культурах вызывала достоверное увеличение длительности и уменьшение частоты кальциевых осцилляций в отдаленном постгипоксическом периоде, по сравнению с культурами, не подвергавшимися гипоксическому воздействию (рис. 15-16).

Следует отметить, что увеличение длительности осцилляций после гипоксического воздействия происходит за счет появления в профиле активности клеток «суперосцилляций», длительность которых составляет до

100 с (рис. 17).

В группе культур, подвергавшихся гипоксическому воздействию, длительность суперосцилляций составила 89,19±8,04 секунды. Обнаруженные нами изменения спонтанной кальциевой активности подтверждают гипотезу о том, что изменение активности нейронной сети после гипоксического воздействия связано с действием высоких концентраций возбуждающего нейромедиатора глутамата.

80

Рисунок 15. Длительность кальциевых суперосцилляций в культуре клеток гиппокампа на 7 день после гипоксии. # - статистически достоверное (p<0,05) отличие от группы культур, подвергавшихся гипоксии в отсутствие N-ADA, парный критерий Стьюдента

Повышенная стимуляция глутаматных рецепторов приводит к накоплению в нейронах Са2+ в результате его усиленного поступления через ионные каналы и, соответственно, к стойкому повышению [Ca2+]i, что проявляется в развитии суперосцилляций. Соответственно увеличению длительностей осцилляций, также отмечается уменьшение их частоты.

Такие суперосцилляции могут быть разными по продолжительности, их характеризует временное повышение базовой [Ca2+]i, на фоне которого происходит несколько спонтанных осцилляций. Подобные суперосцилляции наблюдаются в ходе дифференцировки культур, однако их длительность не превышает 45-50 секунд (Митрошина с соавт., 2011, Широкова с соавт., 2013).