2 курс / Гистология / Митрошина_Е_В_Антигипоксическое_и_нейропротекторное_действие_N_

91

3.2Исследование антигипоксического и нейропротекторного действия N-арахидоноилдофамина при моделировании гипоксии in vivo

3.2.1 Влияние N-арахидоноилдофамина на выживаемость животных при моделировании острой гипобарической гипоксии

При моделировании острой гипобарической гипоксии ключевыми показателями, характеризующими устойчивость животных к гипоксии, являются время жизни на высоте (Тж, мин), коэффициент защиты, характеризующий выживаемость животных). Опытным группам животных за 45 минут до подъема на высоту внутрибрюшинно вводили N-ADA в концентрациях 2,5 мг/кг, 6 мг/кг и 10 мг/кг. Первой контрольной группе внутрибрюшинно вводили физиологический раствор, второй – инъекционный раствор, использующийся для растворения N-ADA, группе сравнения – реамберин как эталонный препарат.

Время жизни "на высоте" – это параметр, отражающий непосредственно устойчивость организма к дефициту кислорода. Данный параметр измерялся от момента подъема на «смертельную площадку» высотой 10000-10500 метров до появления второго агонального вдоха. Этот критерий отражает непосредственно устойчивость организма к дефициту кислорода.

Превентивное введение N-ADA при моделировании ОГБГ дозозависимо увеличивало время жизни мышей на «высоте» (рис. 23). В дозе 2,5 мг/кг N-ADA увеличивал его до 8,2±0,67 мин, тогда как у контрольных животных оно составляло 5,82±1,06 мин. Время жизни контрольной группы, получавшей растворитель N-ADA, достоверно не отличалось от контрольной группы с физраствором (7,08±0,79 мин). Максимальный эффект отмечен при использовании дозы 10 мг/кг, когда время жизни «на высоте» возрастало в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой и составляло в среднем

92

8,95±0,55 мин, что даже несколько превосходило эффект реамберина

(8,45±0,65 мин).

Рисунок 23. Оценка времени жизни на высоте мышей линии C57BL/6 при моделировании острой гипобарической гипоксии. * - статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой, p < 0,05 (Критерий Манна-Уитни)

По степени устойчивости к гипоксии всех животных можно было разделить на три группы: низко-, средне- и высокоустойчивые. Время жизни «на высоте» низкоустойчивых животных составляло менее 3 мин, среднеустойчивых – от 3 до 9 мин, высокоустойчивых – более 10 минут. Таким образом, различия между крайними группами были не менее чем трехкратными. Этот параметр, отражающий собственно устойчивость организма к дефициту кислорода, может быть использован в качестве одного из ключевых для оценки резистентности к повреждающему воздействию гипоксии. В контрольных группах, получавшей физиологический раствор и инъекционный раствор, встречались животные всех степеней устойчивости к гипоксии, при этом наиболее велика была численность среднеустойчивых животных (рис. 24). Распределение низко-, средне- и высокоустойчивых

93

животных составило 20, 50 и 30% в первой контрольной группе и 8,3, 58,3 и 33,3% во второй контрольной группе, соответственно.

Рисунок 24. Распределение степени устойчивости в группах мышей линии С57BL/6 при моделировании острой гипобарической гипоксии (% от общего числа особей в группе).

При превентивном применении N-ADA доля животных, средне- и высокорезистентных к гипоксии, возрастала, низкоустойчивых в этих группах не отмечено. Аналогичный эффект оказывал и препарат сравнения. Следует отметить, что эффект N-ADA на степень устойчивости животных к гипоксии дозозависим, наиболее велика доля высокоустойчивых животных в группе, получавшей N-ADA в дозе 10 мг/кг. При применении N-ADA в дозе 2,5 мг/кг 60% составили среднеустойчивые животные и 40% –

94

высокоустойчивые, 6 мг/кг – по 50%, 10 мг/кг – 37,5% и 62,5 % соответственно.

Еще одним ключевым показателем, позволяющим оценить антигипоксическое действие вещества, является выживаемость животных на «смертельной площадке». Для оценки выживаемости рассчитывался коэффициент защиты исследуемого вещества (табл. 3).

Таблица 3. Коэффициент защиты мышей линии C57BL/6 при моделировании

острой гипобарической гипоксии

Растворитель, примененный для изготовления инъекционного раствора N-ADA, не проявлял антигипоксического действия. Коэффициент защиты реамберина (150 мг/кг) составил 1,5, тогда как N-ADA в дозах 2,5, 6 и 10 мг/кг – 1,16, 1,33 и 1,58, соответственно.

Таким образом, превентивное внутрибрюшинное введение N-ADA при острой гипобарической гипоксии дозозависимо повышает время жизни животных «на высоте», долю высокорезистентных к гипоксии животных и их выживаемость на «смертельной площадке», при максимальном защитном эффекте N-ADA в дозе 10 мг/кг, сопоставимом с эффектом Реамберина. Увеличение выживаемости животных может быть связанно с действием N- ADA на поведение крыс в течение стрессорного воздействия, поскольку активация каннабиноидных рецепторов N-арахидоноилдофамином вызывает классическую каннабиноидную тетраду, включающую в себя снижение двигательной активности (Adams, Martin, 1996; Bobrov et al., 2008), что

95

позволяет животным экономить энергетические ресурсы во время пребывания на "смертельной площадке", а также с действием N-ADA на метаболизм зрелых нервных клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что N-ADA обладает выраженным антигипоксическим эффектом, сопоставимым с действием антигипоксического препарата Реамберина.

3.2.2 Влияние N-арахидоноилдофамина на показатели двигательной и ориентировочно-исследовательской активности мышей в тесте «Открытое поле»

Эффект, оказываемый N-ADA на восстановление рефлекторной деятельности в постгипоксическом периоде оценивалась по уровню поведенческой активности животных в тесте «открытое поле». Поскольку мыши являбтся ночными норными животными, при попадании на открытое пространство с условиями усиленной освещенности, у них наблюдаются стрессовые поведенческие реакции - ориентировочно-исследовательские и защитно-оборонительные. Ориентировочно-исследовательская реакция животного оценивается по уровню горизонтальной и вертикальной двигательной активности (число пересеченных квадратов открытого поля и количество вертикальных стоек), количеству реакций принюхивания. Эмоциональный статус животного оценивают по времени замирания, количеству реакций дефекации, мочеиспускания, груминга, верчения и пячения (Буреш, 1991; Худякова, Баженова, 2012). Действие различных стресас-факторов приводит к изменениям структуры поведения животных, изменяя метаболические процессы в организме.

Исходный уровень горизонтальной двигательной активности (ГДА) статистически не отличался во всех группах животных. При исследовании воздействия N-ADA вне гипоксии на двигательную активность животных выявлено, что на 1 и 7 сутки после введения препарата изменений лвигательной активности не происходило. На 14 сутки отмечено снижение

96

горизонтальной двигательной активности, Число пересеченных квадратов составило 73,3% от исходного уровня ГДА (рис. 25)

Рисунок 25. Влияние N-арахидоноилдофамина (6 мг/кг) на изменение горизонтальной двигательной активности мышей относительно исходного уровня, принятого за единицу; * - статистически значимые различия по сравнению с интактной группой, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни)

Данные по воздействию N-ADA при моделировани ОГБГ на уровень ориентировочно-исследовательской и защитно-оборонительной активности животных после моделирования ОГБГ представлены на рисунках 26-32.

На первые сутки после гипоксического воздействия двигательная активность животных, получавших физиологический раствор (1 контрольная группа), достоверно снижалась по сравнению с интактными. Число пересеченных квадратов составило 27% от исходного количества. Через 14 дней двигательная активность мышей нормализовалась (86,5%) и достоверно не отличалась от исходного уровня (рис. 26).

97

Рисунок 26. Влияние N-арахидоноилдофамина на изменение горизонтальной двигательной активности мышей после моделирования ОГБГ. Полученные данные нормализованы относительно исходного уровня; * - статистически значимые различия по сравнению с интактной группой, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни), ** - статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой, получавшей физ.раствор, p < 0,05 (критерий МаннаУитни)

Во 2 контрольной группе, получавшей инъекционный раствор, также отмечалось снижение двигательной активности, однако к 14 дню она не нормализовадась и на 14 сутки была достоверно ниже, чем у интактной группы (60% от исходного уровня).

При превентивном введении N-ADA горизонтальная двигательная активность в первые сутки после гипоксического повреждения также снижалась, однако не так значительно, как в контроле. Статистически достоверных отличий двигательной активности мышей, получавших N-ADA перед моделированием ОГБГ, от интактных животных не обнаружено. Двигательная активность при введении N-ADA в дозах 2,5 и 6 мг/кг на первые сутки после гипоксии была достоверно выше по сравнению с 1

98

контрольной группой (59,5% и 77,1% от исходного уровня ГДА сообветственно). Аналогичная картина наблюдалась и у животных при введении реамберина. К 14 суткам постгипоксического периода отмечалась тенденция к дальнейшей нормализации двигательной активности животных, получавших как N-ADA, так и реамберин.

Ни в одной из опытных груп достовеного отличия количества пересеченных квадратов от интактных животных не обнаружено. Такой же эффект поддержания уровня двигательной активности выявлен в группе животных, получавших антигипоксический препарат Реамберин.

Для оценки уровня ориентировочно-исследовательской активности животных проводилаось исследование изменения уровня вертикальной двигательной активности (ВДА, количество вертикальных стоек) и числа реакций принюхивания. Нами установлено, что ОГБГ не оказывает достоверного влияния на вертикальую двигательную активность животных (рис. 27). Количество вертикальных стоек животных контрольных групп статистически не отличалось от тех же показателей у интактных животных. При применении N-ADA перед моделированием гипоксии достоверных отличий ориентировочноисследовательской активности от интактных животных также не отмечено. Уровень вертикальной двигательной активности сохраняется на одном уровне в течение всего времени наблюдения за животными. Оценка непосредственного влияния N-ADA на ориентировочно-двигательную активность интактных животных показало, что число вертикальных стоек после введения препарата достоверно не изменяется (рис. 28).

Также не обнаружено изменения количества актов принюхивания в контрольных группах животных после моделирования ОГБГ. В группах, получавших превентивные инъекции N-ADA в дозах 2,5 6 и 10 мг/кг не обнаружено достоверных отличий от исходного уровня. Однако нами было выявлено воздействие N-ADA вне гипоксии на число актов принюхивания

(рис. 29, 30).

99

Рисунок 27. Влияние N-арахидоноилдофамина на изменение вертикальной двигательной активности мышей после моделирования ОГБГ. Полученные данные нормированы относительно исходного уровня, принятого за единицу; * - статистически значимые различия по сравнению с интактной группой, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни)

Рисунок 28. Влияние N-арахидоноилдофамина 6 мг/кг на изменение вертикальной двигательной активности мышей. Полученные данные нормированы относительно исходного уровня, принятого за единицу

100

Рисунок 29. Влияние N-арахидоноилдофамина на изменение количества актов принюхивания после моделирования ОГБГ. Полученные данные нормированы относительно исходного уровня; * - статистически значимые различия по сравнению с исходным уровнем, p < 0,05 (критерий МаннаУитни)

Рисунок 30. Влияние N-арахидоноилдофамина 6 мг/кг на изменение количества актов принюхивания мышей в тесте «открытое поле». Полученные данные нормированы относительно исходного уровня, принятого за единицу; * - статистически значимые отличия по сравннию с исходным уровнем, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни)