2 курс / Гистология / Митрошина_Е_В_Антигипоксическое_и_нейропротекторное_действие_N_

41

аминотрансфераза (Рубанова с соавт., 1991, Захарова, 1991). В совокупности все дегенеративные процессы приводят к избирательной гибели нейронов. Гипоксия может сопровождаться исчезновением целого слоя пирамидных нейронов гиппокампа (Проблемы гипоксии… под ред. Лукьяновой, Ушакова, 2004). Избирательно повреждается неокортекс, особенно сенсомоторный, а

также гиппокамп (Netto et al., 1993; Hodges et al., 1996; Virley et al., 1999). В

подкорковых структурах, в частности, в базальных ганглиях, также отмечаются значимые повреждения. Суммарно все эти изменения приводят к мнестическим и когнитивным патологиям (Netto et al., 1993; Yamamoto et al., 1993; Karasava et al., 1994; Tanaka et al., 1998; Nagakura, 2002).

В зависимости от причин и механизма развития различают следующие основные типы гипоксии:

1.Экзогенная гипоксия, которая возникает при действии на систему обеспечения кислородом внешних факторов, и, в свою очередь, подразделяется на несколько типов:

а) гипоксический тип (гипо- и нормобарический); б) гипероксический тип (гипер- и нормобарический).

2.Респираторная (дыхательная) гипоксия.

3.Циркуляторная (сердечнососудистая) гипоксия/ишемия.

4.Гемическая гипоксия, возникающая при анемии и вследствие инактивации гемоглобина.

5.Цитологическая гипоксия, возникающая при нарушении способности тканей поглощать кислород или при разобщении окисления и фосфорилирования (гипоксия разобщения).

6.Субстратная гипоксия (развивается на фоне дефицита энергетических субстратов).

7.Перегрузочная гипоксия ("гипоксия нагрузки"), возникающая при увеличении нагрузки на систему обеспечения кислородом;

8.Смешанная гипоксия (возникает при сочетании нескольких форм гипоксии).

42

Независимо от этиологии гипоксических состояний, в развитии и исходе основного патологического процесса решающую роль играет насыщение тканей кислородом и его участие в метаболических процессах (Проблемы гипоксии..., 2004; Лукьянова с соавт., 2007).

Поиск способов коррекции повреждающего действия гипоксии является весьма актуальной задачей медицины и нейробиологии. В большинстве экспериментальных моделей гипоксии in vivo используют модель циркуляторной гипоксии (локальной ишемии) либо острой или хронической гипобарической гипоксии. Наиболее подходящим условием для изучения молекулярных и клеточных нейропротекторных механизмов служит моделирование гипоксической гипоксии in vitro. Как правило, для осуществления методики in vitro используются специальные инкубаторы, в которых можно вытеснять кислород при помощи вакуумного насоса.

В экспериментах по моделированию циркуляторной гипоксии in vivo было показано, что ЭК, в том числе и N-ADA, способствуют защите нейронов от повреждений. Так, было обнаружено нейропротекторное действие синтетического каннабиноида WIN55212-2 при ишемическом повреждении мозга, причем снижение объема очага инфаркта блокировалось антагонистом CBR-1 римонабантом (Nagayama et al., 1999). Также одними из наиболее убедительных свидетельств нейропротекторного действия каннабиноидов, реализующегося через СВR-1, являются исследования, показавшие, что у мышей, нокаутных по гену CB1-/-, больше площадь очага инфаркта, ниже кровоток в области пенумбры и более выражен неврологический дефицит при окклюзии средней мозговой артерии, чем у гетерозигот CB1-/+ и у мышей дикого типа (Parmentier-Batteur et al, 2002).

Кроме того, нокаутные животные были более чувствительны к эксайтотоксичности, вызванной глутаматом, инъецировынным непосредственно в кору головного мозга, и к оксидативной травме при интрацеребральном введении FeCl2 (Parmentier-Batteur et al, 2002; Kim et al., 2005). При фокальном ишемическом повреждении, индуцированном

43

фототромбозом кровеносных сосудов коры головного мозга крысы, N-ADA препятствовал увеличению объёма очага инфаркта (Бобров с соавт., 2011; Генрихс, 2012). Такое же нейропротекторное действие оказывали и N- ацилэтаноламины, в частности, пальмитоилэтаноламин. Интересным представляется тот факт, что блокада СВR-1 и TRPV1 не препятствовала способности пальмитоилэтаноламина снижать объем очага инфаркта и неврологический дефицит у животных, подвергшихся воздействию ишемии/реперфузии. Применение пальмитоилэтаноламина существенно уменьшало развитие апоптоза и предотвращало вызванное ишемией увеличение экспрессии ряда белков, в том числе индуцибельной NО синтазы и фактора транскрипции NFkB (Garq et al., 2010).

Исследования in vitro, проведенные Grabiec с коллегами, выявили, что аппликация N-ADA при моделировании NMDA-эксайтотоксичности на органотипических срезах гиппокампа предотвращает дегенерацию и гибель клеток-зерен зубчатой извилины и снижает количество клеток микроглии. Применение антагониста CBR-1 АМ630 полностью блокировало нейропротекторный эффект, оказываемый малыми дозами N-ADA, но эффект высоких доз сохранялся. Антагонисты CBR-2 и TRPV1 не оказывали влияния на нейропротекторный эффект N-ADA. У CBR-1-нокаутных мышей N-ADA протективного действия не оказывал (Grabiec et al., 2012). При индукции апоптоза и цитотоксическом действии глутамата в культуре клеток мозжечка и новой коры N-ацилдофамины оказывали дозозависимый нейропротекторный эффект, опосредуемый CBR-2 (Генрихс с соавт., 2010). Однако оценка воздействия N-ADA на сохранение когнитивных, мнестических и поведенческих функций при ишемических и гипоксических поражениях ЦНС на сегодняшний день не проводилась.

Показано, что активация CBR-2-cелективными агонистами уменьшает воспалительные реакции, сопровождающие различные повреждения ЦНС. Продемонстрирован нейропротекторный эффект синтетического селективного агониста CBR-2 О-1966 при экспериментальном аутоиммунном

44

энцефаломиелите и при моделировании церебральной ишемии/реперфузии у мышей. Было обнаружено снижение адгезии лейкоцитов к капиллярам мозга, уменьшение инвазии иммунных клеток в паренхиму мозга и улучшение неврологических функций после инсульта. Применение агонистов CBR-2 препятствовало увеличению объема очага инфаркта через 24 часа после реперфузии (Zhang et al., 2009), а в присутствии антагониста CBR-2 SR144528 очаг инфаркта увеличивался. Антагонист CBR-1 SR141716А также оказывал нейропротекторный эффект, снижая объем очага инфаркта. Совместное применение селективного агониста CBR-2 и антагониста CBR-1 вызвало усиление мозгового кровотока во время периода окклюзии сосудов (Zhang et al., 2008). Аналогичные данные, свидетельствующие о нейропротекторном действии антагонистов CBR-1 при ишемии головного мозга, приводят и другие авторы (Berger et al., 2004; Muthian et al, 2004).

Существует несколько объяснений подобного расхождения результатов. Один из возможных вариантов может быть связан с температурным режимом. Существует большое число работ, в которых активация CBR-1 не оказывала защитного эффекта при поддержании нормальной температуры тела у животных. Предполагается, что протекторный эффект связан с гипотермией, вызываемой активацией CBR-1 (Leker et al., 2003; Hayakawa et al., 2004). У CBR-1-нокаутных животных возможны нарушения при развитии ЦНС, которые усиливают чувствительность к ишемии. При этом нейропротекторный эффект антагониста CBR-1 SR141716A связан со свойствами самой молекулы антагониста, а не с блокированием рецепторов.

В целом экспериментальные данные свидетельствуют о том, что каннабиноиды, и, в частности, N-ADA, могут обладать потенциальным терапевтическим потенциалом, предотвращая патологические изменения клеток, инициирующие нейродегенеративные процессы, и таким образом способствуя восстановлению нормальных функций мозга (Campbell et al., 2008). Однако в связи с неоднозначностью экспериментальных данных требуются дальнейшие исследования нейропротекторных и

45

антигипоксических свойств эндоканнабиноидов, и, в том числе, N-ADA in vitro и in vivo для раскрытия механизмов их действия, что может явиться основой разработки новых лекарственных средств для коррекции ишемических и гипоксических повреждений нервной системы. Одним из адеватных методов оценки изменений функционального состояния нейронов при действии патогенетических факторов гипоксии/ишемии и фармакологической коррекции этих изменений является исследование биоэлектрической активности нейронных сетей, культивируемых на мультиэлектродной матрице.

1.5. Изучение сетевой активности нейронов

Нейронная сеть мозга является структурно-функциональной единицей, отвечающей за процессы обработки, хранения и воспроизведения информации. Одним из маркеров функционирования нейронной сети является ее спонтанная биоэлектрическая активность, имеющая свои закономерности развития в онтогенезе и под воздействием факторов окружающей среды. В настоящее время наиболее оптимальной методикой изучения нейрональной активности на сетевом уровне является мультиэлектродная система регистрации внеклеточных потенциалов действия (multielectrode arrays) (Мухина с соавт., 2009).

Нейроны гиппокампа после нескольких дней культивирования на мультиэлектродной матрице образуют между собой синаптические связи, о чем свидетельствует генерирование клетками случайных спайков (внеклеточных потенциалов действия) и типичных паттернов электрической активности в виде спайков (Gross and Kowalski, 1999). Спонтанная биоэлектрическая активность нейронов в культурах с высокой плотностью клеток отличается склонностью к синхронизации. В зависимости от возраста культуры, условий культивирования, фармакологических воздействий

46

происходит изменение рисунка пачки (Boehler et al., 2007; Xiang et al., 2007; Ham et al., 2008).

Сетевая пачечная активность – это моментальная пространственновременная последовательность внеклеточных потенциалов действия (спайков) одного или нескольких нейронов, детектируемая на внеклеточных электродах, с короткими межспайковыми интервалами (Li et al., 2007; Madhavan et. al., 2007).

Пачка (Burst) внеклеточно регистрируемых спайков характеризуется следующими признаками:

1.Количество спайков в пачке не менее 4.

2.Межспайковый интервал не более 100 мс (частота более 10 Гц).

3.Наличие пространственной и временной синхронизация пачечной активности в нейронной сети (Madhavan et. al., 2006; Pimashkin et al., 2011).

В отличие от традиционных электрофизиологических методов, применение данной методики имеет ряд преимуществ:

1.Клеточная неинвазивность, отсутствие необходимости помещать электроды вручную.

2.Возможность одновременной регистрации сигналов и стимуляции

клеток.

3.Возможность проведения хронических экспериментов (месяцы).

4.Изучение нейрофизиологии сетей.

5.Возможность фармакологических манипуляций, в том числе, лекарственный скрининг.

Использование мультиэлектродных матриц дает уникальную возможность совмещения электрофизиологических методов с методами прижизненной визуализации (в частности, конфокальной лазерной микроскопии, КФЛМ) с использованием трансгенных флуоресцентных белков, ионных индикаторов. Совмещение культуры клеток с мультиэлектродной системой регистрации и стимуляции активности нейронов позволяет моделировать в динамике различные стадии развития

47

нейронных сетей, а также может быть использовано для изучения на клеточном и сетевом уровне таких свойств нервной системы, как научение и память (Мухина с соавт., 2009).

48

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования

Объектом исследований in vitro служили первичные диссоциированные культуры клеток гиппокампа, полученные от 18-дневных мышиных эмбрионов линии CBA (вид Mus musculus). Всего в экспериментах была использована 361 культура.

В опытах in vivo использовано 116 4-х недельных самцов мышей линии C57BL/6. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, указанным в Приказе Минздрава России № 708н от 23.08.10 «Об утверждении Правил лабораторной практики» и были согласованы с этическим комитетом при ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России.

2.2.Схема экспериментов

2.2.1.Схема экспериментов in vitro

Распределение экспериментальных групп представлено в табл.1. Культуры подвергали гипоксии на 21-й день in vitro (DIV). В интактной группе культур осуществлялась смена нормоксической культуральной среды. В культурах контрольной группы нормоксическую среду на 10 минут заменяли на гипоксическую, затем клетки возвращали нормоксическую среду, т.е. подвергали реоксигенации. В культуры других групп во время гипоксии, при реоксигенации и в течение суток после нее добавляли N-ADA 2,5 и 10 мкМ (синтезирован в лаборатории оксилипинов ИБХ РАН) и N-ADA в комбинации с антагонистом CBR-1, SR141716A (Sanofi), 1 мкМ, антагонистом CBR-2, SR144528 (Sanofi), 1 мкМ и антагонистом TRPV1, капсазепином (Tocris), 1 мкМ.

49

50

Параметры, характеризующие спонтанную биоэлектрическую активность нейронной сети, регистрировали непосредственно до гипоксии, во время нее, после реоксигенации, через 2 часа и через каждые 24 часа в течение 7 дней после гипоксии.

Спонтанную кальциевую активность регистрировали при гипоксии и на 7 сутки постгипоксического периода. Оценка жизнеспособности культур осуществляли до гипоксии, на 1, 3, 7 и 10 сутки постгипоксического периода. Иммуноцитохимические исследования проводили на 7 сутки после гипоксии.

2.2.2 Схема экспериментов in vivo

Предварительно проводилась оценка двигательных и ориентировочноисследовательских показателей у животных. На следующий день после теста начинались сеансы навигационного научения в "водном лабиринте" Морриса, с перерывом в 48 часов. Через 24 часа после окончания пятого сеанса обучения животных подвергали острой гипобарической гипоксии (ОГБГ). Предварительно за 45 мин до подъема на высоту внутрибрюшинно вводили N-ADA в различных дозах (2,5 мг/кг, 6 мг/кг и 10 мг/кг), а также в комбинациях с блокаторами CBR-1 (SR141716A 1 мг/кг), CBR-2 (SR144528 1

мг/кг) и TRPV1 (капсазепин 1мг/кг). Животным контрольных групп внутрибрюшинно вводили физиологический раствор и растворитель N-ADA без препарата, группе сравнения – внутрибрюшинно Реамберин (150 мг/кг) как антигипоксический препарат. Через 24 часа после ОГБГ у выживших животных определяли отсроченный коэффициент сохранения долговременной памяти, а также оценивали двигательные и ориентировочноисследовательские показатели с повтором на 7 и 14 сутки после ОГБГ. Интактной группе проводили тестирование только двигательной активности по методике «открытое поле». Для контроля собственно действия N-ADA была протестирована группа животных, получивших внутрибрюшинную инъекцию N-ADA (6 мг/кг), но не подвергавшихся действию ОГБГ (табл. 2).