6 курс / Гастроэнтерология / Российский_журнал_гастроэнтерологии,_гепатологии,_колопроктологии (61)

4, 2010

Оригинальные исследования

отмечается при экспрессии цитокина в высоких

группы. Гомозиготный m1/m1 вариант (АА 681

концентрациях.

гена CYP2C19) распространен на очень низком

Отмечено, что у пациентов – представителей

уровне. Доля генотипа m1/m1 в группе контроля

коренного и пришлого населения Республики

составила 5,8%, тогда как среди больных ЯБ носи-

Хакасия регистрируются различные показатели

телей m1/m1 обнаружено не было. Установлено,

кислотности в теле желудка. В частности, у мон-

что относительный риск развития ЯБ у индивидов

голоидов происходит не только более значитель-

с генотипом wt/wt достигал величины OR=4,17,

ное выделение кислоты, но и эффективное ощела-

(95% CI 1,04–19,39).

чивание кислого желудочного содержимого [2].

Метаболизм

различных

субстратов,

воздей­

Выводы

ствие конвенционных факторов риска ЯБ (куре-

ние, прием лекарственных средств), метаболизм

У хакасов выявлены популяционно-зависимые

интермедиаторов

воспаления,

ассоциированных

генетические детерминанты (СС +3954 ИЛ1β,

с ульцерогенезом, сопряжены с определенной

R4/R4 ИЛ1Ra), которые могут определять более

активностью ферментов биотрансформации ксено-

высокий уровень защиты от H. pylori-ассоцииро-

биотиков (цитохрома Р450) [9].

ванной патологии, чем у европеоидов. Факторами

Исследование

генетического

полиморфизма

повышенного риска развития язвенной болезни

гена CYP2C19 681G→A (m1 – наиболее встреча-

у

хакасов является носительство CagA-штам-

ющейся по частоте мутации) показало, что пре-

ма H. pylori, АА –251 гена ИЛ8, GG +681

обладающим генотипом у хакасов был дикий тип

CYP2C19.

wt/wt (GG 681 гена CYP2C19). У больных ЯБ

частота встречаемости wt/wt составила 89,3%,

Работа выполнена в рамках проекта ФЦП

что было достоверно выше по сравнению с конт-

«Научные и научно-педагогические кадры

ролем (66,7%, р<0,05). Гетерозиготы wt/m1 (GA

инновационной России на 2009–2013 гг.» (ГК

681 гена CYP2C19) были выявлены у 10,7% боль-

№ 02.740 11.03.11), гранта РФФИ (0№ 9-04-

ных ЯБ и у 27,5% обследованных контрольной

98011 р.сибирьRU_а).

Список литературы

8.

Keates S., Keates A.C., Warny M. et al. Differential

activation of mitogen-activated protein kinases in AGS

VESTI

1. Кононов А.В. Воспаление как основа Helicobacter pylo-

gastric epithelial cells by cag+ and cag– Helicobacter

ri-ассоциированных болезней // Арх. патол

– 2006.

pylori // J. Immunol. – 1999. – Vol. 163. – P. 5552–

– Т. 68, вып. 5. – С. 3–10.

.M

5559.

2. Штыгашева О.В., Цуканов В.В. Ассоциация саg A и

9.

Lanas A., Hirschowitz B.I. Influence of smoking on basal

vac A штаммов Helicobacter pylori и язвенной болезни

and on vagally and maximally stimulated gastric acid

в организованной популяции г. Абакана // Рос. журн.

and pepsin secretion // Scand. J. Gastroenterol. – 1992.

гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. – 2004. – Т. 14,

– Vol. 27, N 3. – P. 208–212.

№ 2. – С. 84–87.

10.

Miwa H.H., Go M.F., Sato N. Pylori and gastric can-

3. Bamford K.B. Gastric T cell

and

H. pylori: regulation

cer: the Asian enigma // Am. J. Gastroenterol. – 2002.

of pathogenesis

and prevention //

The immunobiol-

– Vol. 97, N 5. – P. 1106–1112.

ogy of H. pylori:

WWW

from pathogenesis

to prevention /

11.

Moran A.P. The role of lipopolysacchande in Helicobacter

Eds. P.B. Ernst,

P. Michetti,

P.D. Smith. – New

pylori pathogenesis // Aliment. Pharmacol. Ther. – 1996.

York–Philadelphia: Lippincott-Raven

Publishers,

1997.

– Vol. 10. – P. 57–64.

– P. 227–236.

12.

Peek R.M., Moss S.F., Tham K.T. et al. Helicobacter

4. Blaser M. Ecology of Helicobacter pylori in human stom-

pylori cagA+ strains and dissociation of gastric epithelial

ach // J. Clin. Invest. – 1997. – Vol. 100. – P. 759–

cell proliferation from apoptosis // J. Natl. Cancer Inst.

762.

– 1997. – Vol. 89, N 12. – P. 863–868.

5. Campbell D.I., Warren B.F., Thomas J.E. The African

13.

Perez-Perez G.I., Olivares A.Z., Foo F.Y. et al.

enigma: low prevalence of gastric atrophy, high

preva-

Seroprevalence of Helicobacter pylori in New York City

lence of

chronic

inflammation in

West African

adults

populations originating in East Asia // J. Urban Health.

and children // Helicobacter. – 2001. – Vol. 6, N 4.

– 2005. – Vol. 82. – P. 510–515.

– P. 263–267.

14.

Rieder G., Einsiedl W., Hatz R.A. et al. Comparison

6. Everhart J.E. Recent developments in the epidemiology

of CXC chemokines ENA-78 and interleukin-8 expres-

of Helicobacter pylori // Gastroenterol. Clin. North Am.

sion in Helicobacter pylori-associated gastritis // Infect.

– 2000. – Vol. 29, N 23. – P. 559–578.

Immun. – 2001. – Vol. 69. – P. 81–88.

7. Goodwin

C.D. Duodenal ulcer,

Campylobacter

pylori

15.

Sato Y., Sugamura K., Mochizuki T. et al. Regional

and the

«leaking

roof» concept

//

Lancet. –

1988.

differences on production of chemokines in gastric mucosa

– Vol. 2, N 8626/8627. – P. 1467–1469.

between

Helicobacter pylori-positive duodenal ulcer

РЖГГК он-лайн – www.gastro-j.ru

21

Оригинальные исследования

4, 2010

RU

Gene therapy by hepatocyte growth factor results in regression

of experimental liver fibrosis

.

N.A. Dzhoyashvili, N.I. Kalinina, I.B. Beloglazova, Z.I. Tsokolayeva, P. Makarevich,

Yu.L. Perov

, Ye.V. Parfenova, V.A. Tkachuk

Цель исследования. Изучение эффективности

Aim of investigation. Studying of efficacy of genet-

генной терапии фиброза печени у мышей фактором

ic therapy of liver fibrosis at mice by human hepatocyte

роста гепатоцитов (HGF) человека и оценка возмож

VESTIgrowth factor (HGF) and evaluation of potentials of

.M

hydroporation method for delivery of genetic complexes

ностей метода гидропорации для доставки генети-

ческих конструкций в печень.

WWW

to the liver.

Материал и методы. В ходе эксперимента

Material and methods. During experiment male

мыши-самцы линии Balbc получали интраперито-

mice of Balbc line received intraperitoneal injections of

неальные инъекции 30% масляного раствора четы-

30% perchloromethane (CCl4) diluted in oil in a dose

реххлористого углерода (CCl4) из расчета 1 мкл/1 г

of 1 ml/kg once per week. Animals (n=4–6) dropped

массы тела 1 раз в неделю. Животных (n=4–6) выво-

from the experiment at the 1, 2, 4 and 6-th week from

дили из эксперимента на 1, 2, 4 и 6-й неделе от его

its onset. After obtaining liver tissue samples, histologi-

начала. После получения печеночной ткани про-

cal study was carried out, and by real time polymerase

водили гистологическое исследование, а с помо-

chain reaction (RT-PCR) contents of mPNA of liver

щью полимеразной цепной реакции в реальном

fibrosis-associated genes were analyzed: transform-

времени (ПЦР-РВ) выполняли анализ содержания

ing growth factor β1 (TGF-β1), collagen 1α1 (Coll1α1),

мРНК генов, ассоциированных с развитием фибро-

matrix metalloproteinase-13 (ММР-13), tissue inhibitor

за печени: трансформирующего ростового фактора

of matrix metalloproteinase (TIMP-1) and smooth-mus-

β1 (TGF-β1), коллагена 1α1 (Coll1α1), матриксной

cle actin α (α-SMA). A blood was extracted for assess-

металлопротеиназы-13 (ММР-13), тканевого инги-

ment of liver enzymes activity (AST and ALT). Human

битора матриксной металлопротеиназы (TIMP-1) и

HGF was injected into liver tissue by hydroporation

гладкомышечного α-актина (α-SMA). Кровь забира-

method. Contents of human HGF in mice liver tissue was

ли для измерения активности печеночных фермен-

detected by PCR. For evaluation of stage of liver fibrosis

тов (АсАТ и АлАТ). HGF человека вводили в ткань

Knodell index and morphometrical analysis was used.

печени методом гидропорации. Содержание в пече-

Results. According to Knodell index development

ночной ткани мышей человеческого HGF определяли

of CCl4-induced liver fibrosis at the 4-th week of experi-

22

РЖГГК он-лайн – www.gastro-j.ru

с помощью ПЦР. Для оценки степени развития фиб-

ment was found. Liver cirrhosis developed at the 6-th

роза печени использовали индекс Кноделя и морфо-

week of experiment. These data correlated well to the

метрический анализ.

RT-PCR results and evaluation of liver enzymes activity.

Результаты. На сновании расчета индекса

Morphometrical analysis demonstrated, that after HGF

Кноделя установлено формирование CCl4-индуци-

therapy in the main group of animals the degree of fibro-

рованного фиброза печени к 4-й неделе экспери-

sis (%) was lower in comparison to that in the control

мента. Цирроз печени формировался к 6-й неде-

group. Efficacy of transfection of complementary HGF

ле эксперимента. Эти данные согласовывались с

DNA at application of hydroporation method was higher,

результатами ПЦР-РВ и оценки активности печеноч-

than at direct method of injection into parenchyma of

ных ферментов. Морфометрический анализ пока-

the organ.

зал, что после терапии HGF в исследуемой груп-

Conclusions. Obtained results allow to consider

пе животных степень выраженности фиброза (%)

gene therapy by hepatocyte growth factor in composi-

была ниже по сравнению с контрольной группой.

tion of non-viral vectors as one of perspective methods

Эффективность трансфекции комплементарной

of treatment of chronic liver diseases.

ДНК HGF при использовании метода гидропорации

Key words: liver fibrosis, liver cirrhosis, genetic

была выше, чем при прямом способе введения в

therapy, transfection, hepatocyte growth factor, hydro-

паренхиму органа.

poration.

Выводы. Полученные результаты позволяют

рассматривать генную терапию фактором роста

гепатоцитов в составе невирусных векторов как

один из перспективных методов лечения хроничес-

ких заболеваний печени.

Ключевые слова: фиброз печени, цирроз пече-

ни, генная терапия, трансфекция, фактор роста

гепатоцитов, гидропорация.

.

ронические заболевания печени (ХЗП)

RU

цитов человека, во-вторых, оценка возможностей

представляют серьезную проблему в сов-

метода гидродинамического введения плазмидных

Хременной медицине, так как длительно

конструкций в печень. В последнем случае в хвос-

протекают бессимптомно и в отсутствие лечения

товую вену животного вводили большой объем

приводят к развитию цирроза печени (ЦП) [1, 5].

раствора за 4–7 с в зависимости от массы мыши.

-VESTI

В настоящее время только трансплантация пече-

Точный расчет вводимого объема выполнялся по

ни считается методом выбора терапии конечной

формуле: V(мл) = 0,057143 × mср + 0,5143, где

.M

mср – средняя масса животного [10].

стадии ЦП. Однако в связи с нехваткой донор-

ских органов цирроз и часто развивающийся на

его основе рак оказываются причиной 90–95%

Материал и методы исследования

летальных исходов ХЗП. В последние годы все

чаще появляются экспериментальные работы, пос-

Для отработки модели фиброза печени исполь-

вященные эффективности геннойWWWтерапии фиброза

зовали мышей-самцов линии Balbс массой 18–

и цирроза печени. Большой интерес представляет

22 г (n=25). Все животные были разбиты на

фактор роста гепатоцитов (HGF). Он оказы-

5 групп: первая (контрольная) – здоровые особи,

вает антифибротическое действие за счет ингиби-

вторая – мыши, у которых печень и кровь заби-

рования фрагментации ДНК и апоптоза клеток

рали через неделю после начала эксперимента,

печени, подавления активности трансформирую-

третья – через 2 нед, четвертая – через 4 нед

щего фактора роста β1 (TGF-β1) и ослабления

и пятая – через 6 нед. 30% масляный раствор

экспрессии генов коллагена 1α1 (Coll1α1), фибро-

четыреххлористого углерода (CCl4) вводили из

нектина, ингибитора активатора плазминогена

расчета 1 мкл/1 г массы тела 1 раз в неделю.

1-го типа, тканевого ингибитора матриксных

Перед инъекцией каждое животное взвешивали.

металлопротеиназ 1-го типа (TIMP-1), участву-

У всех мышей ткань печени и кровь забирали

ет в регенерации печеночной ткани [8, 14].

через неделю после последней инъекции. Далее

Одной из задач генной терапии заболеваний

на основании полученной модели проводили

человека является поиск эффективных и безопас-

анализ терапевтического воздействия HGF. Вся

ных способов доставки генетического материала

выборка животных была разбита на две группы:

в клетки. В этой связи в задачи настоящей рабо-

первая (контрольная) группа (n=5) – мыши,

ты входило, во-первых, изучение эффективности

которым в хвостовую вену под давлением вво-

генной терапии на примере экспериментальной

дился физиологический раствор, и вторая группа

модели фиброза печени у мышей после введения

(n=5) – животные, получавшие аналогичным

генетических конструкций, содержащих компле-

способом плазмидную ДНК, содержащую кДНК

ментарную ДНК (кДНК) фактора роста гепато-

HGF человека.

РЖГГК он-лайн – www.gastro-j.ru

23

Оригинальные исследования

4, 2010

Для анализа содержания мРНК из образцов

3 сменах парафина по 1 ч и по окончании работы

печеночной ткани выделяли тотальную РНК с

кусочки заливали расплавленным парафином.

помощью набора «RNeasy Mini Kit» – «Qiagen»

Срезы толщиной 6 мкм готовили на микротоме

(США). Качественный и количественный ана-

«Microm». Для изучения общей морфологической

лиз РНК проводили с помощью аналитической

картины готовые срезы окрашивали гематок-

системы «Experion» (Automated Electrophoresis

силином и эозином, а для оценки накопления

Station) и набора реактивов «RNA StdSens Kit»

коллагена использовали краситель пикросириус

– «BioRad» (США). Для построения кДНК

красный. Перед окраской срезы депарафиниро-

использовали тотальную РНК и набор реакти-

вали в ксилоле и проводили по спиртам нисходя-

вов «Fermentas» (Латвия). Для изучения экс-

щей концентрации. Срезы заключали с помощью

прессии выбранных генов применялся метод

синтетического средства – «BioOptica» (Италия).

полимеразной цепной реакции в реальном вре-

Степень повреждения печени после внутрибрю-

мени – ПЦР-РВ (Real-Time PCR), выполненной

шинного введения CCl4 оценивали с помощью

на амплификаторе «RotorGene 3000» («Corbett

полуколичественного

индекса гистологической

Reaserch», Австралия). Был использован набор

активности (ИГА), или системы Кноделя [9].

реактивов для проведения ПЦР-РВ в присут­

Степень регрессии фиброза печени на фоне ген-

ствии интеркалирующего красителя SYBR Green

ной терапии определяли методом морфометрии в

I – «Синтол» (Россия). Дизайн праймеров выпол-

программе «MetaMorph 7.1» (Molecular Devices).

няли с использованием программы DNASTAR.

Для изучения степени выраженности цитолиза

Специфичность отжига праймеров проверяли с

клеток печени проводили сравнение активности

помощью программы «Blast» (www.ncbi.nlm.nih.

печеночных ферментов – аланинаминотранс-

gov/Blast/). Праймеры по предоставленным пос-

феразы (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы

ледовательностям были синтезированы фирмой

(АсАТ) в плазме крови в каждой группе живот-

ЗАО «Синтол» (Россия). В работе использовали

ных на базе клинической лаборатории ФГУ

следующие последовательности праймеров: HPD-

РКНПК Минздравсоцразвития РФ.

-VESTI

for-mouse (GGC CGC CCC ATC TTC TTA CTA

Для .выбораRUоптимального способа введения

C) и HPD-rev-mouse (CCT GGT GGT TGT GAC

генетического материала в клетки печени срав-

GTT GAA TGA) длина ампликона 206; TIMP-1-

нивали эффективность трансфекции плазмидной

for-mouse (GCA TGG ACA TTT ATT CTC CAC

конструкцией pc-DNA3-β-Gal при прямой инъ-

TGT) и TIMP-1-rev-mouse (ТCT CTA GGA GCC

екции и с помощью гидродинамического метода.

CGA TCT G) длина продукта 66; aSMA-for-mouse

Многие клетки млекопитающих имеют собствен-

.M

ный ген Lac Z, продуцирующий эукариотическую

(CAG CGC CTC CAG TTC CT) и aSMA-rev-mouse

(AAA AAA AAC CAC GAG TAA CAA ATC AA)

β-галактозидазу. Поскольку она может давать

длина продукта 67; Coll1α1-for-mouse (GAA ACC

фон, мешающий идентификации маркирован-

CGA GGT ATG CTT GA) и Coll1α1-rev-mouse

ных клеток, была выделена группа контрольных

(GAC CAG GAG GAC CAG GAA GT) длина про-

животных, которым

путем прямого введения

дукта 274; MMP-13-for-mouse (GCT GGT CAG

в паренхиму печени

и методом гидропорации

TCG CCC TTT T) и MMP-13-rev-mouse (TAA

в хвостовую вену вводился физиологический

GGA AAG CAG AGA GGG ATTWWWAAC A) длина

раствор. Проверку функциональной активности

продукта 73; TGFb1-for-mouse (TGA GTG GCT

плазмиды pc-DNA3-β-Gal выполняли на клетках

GTC TTT TGA CG) и TGFb1-rev-mouse (ACT

линии HEK-293.

TCC AAC CCA GGT CCT TC) длина продукта

Трансфекцию клеток проводили с использо-

350; HGF-for-human (CAT GTC AGC GTT GGG

ванием коммерческого реагента липофектами-

ATT CTC AG) и HGF-rev-human (ATT TTT GCC

на – Lipofectamine (Invitrogen, N11668-027) по

ATT CCC ACG ATA AC) длина продукта 221.

предложенному протоколу, после чего подсчиты-

Для каждой матрицы кДНК одновременно ста-

вали процентное содержание клеток, экспресси-

вилась ПЦР в 2 пробирках: с геном домашнего

рующих ген β-галактозидазы. Плазмидную ДНК

хозяйства и одним из исследуемых генов. Для

pc-DNA3-β-Gal перед инъекцией в паренхиму

анализа экспрессии гена HGF (hHGF) в составе

органа смешивали с Lipofectamine в соотношении

мышиной кДНК животных использовали ПЦР.

1:1. Методом гидропорации вводили незащищен-

После ее окончания ампликоны детектировались с

ную плазмидную ДНК. Работу выполняли на раз-

помощью электрофореза в 2% агарозном геле.

работанной ранее модели фиброза печени.

Для гистологического анализа ткань печени

В эксперименте участвовали мыши после 4 нед

помещали в 4% раствор формалина на 24 ч.

от начала введения CCl4, т. е. на стадии развер-

Затем образцы ткани обезвоживали в спиртах

нутого фиброза. Печень для гистологического

восходящей концентрации (3 смены 96° спирта по

исследования забирали через сутки, 3 и 6 дней

30 мин и 30 мин в 100° спирте). На следующем

после введения генетического материала. Далее

этапе кусочки печени помещали в 3 смены ксило-

получали криосрезы печеночной ткани, которые

ла по 20 мин. После этого ткань пропитывали в

окрашивали с помощью субстрата X-Gal для обна-

24

РЖГГК он-лайн – www.gastro-j.ru

Оригинальные исследования

4, 2010

Median

25–75%

Min–Max

-VESTI

Рис. 2. Динамика экспрессии генов, участвующих в развитии фиброза.RUпечени

А – TGF-β1; B – α-SMA; С – Сoll1α1; D – TIMP-1; E – MMP-13

мостовидного фиброза: от портальных триад в

тов: для АлАТ получено статистически значимое

глубь паренхимы дольки тянутся пучки волокон

отличие между группами при множественном

вновь синтезированного коллагена. В некоторых

сравнении, а также между контрольной группой и

.M

каждой из исследуемых групп, для АсАТ имеется

участках они формируют портопортальные септы.

ИГА равен 8.

статистически значимое отличие только между

Спустя 4 нед в центральных отделах долек распо-

группой здоровых мышей и животными, которым

лагаются участки ацидофильного некроза и гепато-

CCl4 вводился в течение 4 нед.

циты в состоянии жировой дистрофии. Портальная

Для того чтобы выяснить, как изменяется экс-

вена расширена. Имеются признаки значительного

прессия генов, участвующих в развитии фиброза,

портального воспаления. Мостовидный фиброз

в ткани печени мышей, получавших CCl4, мы

выражен в большей степени, чемWWWу мышей через

проанализировали содержание мРНК этих генов

2 нед после начала эксперимента. ИГА равен 11.

с помощью ПЦР (рис. 2). Так, коллаген 1α1

Сравнивая морфологические изменения пече-

является основным компонентом патологического

ночной ткани животных трех рассмотренных

внеклеточного матрикса [11]. TGF-β1 считают

групп можно заметить общие для них признаки:

ключевым цитокином фиброгенеза. Под его вли-

нарушение долькового и балочного строения вок-

янием происходит активация генов коллагена 1α1

руг центральных вен, выраженность портального

и гладкомышечного α-актина (α-SMA) [2, 5].

воспаления, прогрессирование интралобулярной

Мы также оценили изменение экспрессии α-SMA,

дистрофии. Разрастание соединительной ткани в

поскольку он является маркером активированных

области портальных трактов на фоне длительно

клеток Ито. В настоящее время эти клетки отно-

существующего воспаления с переходом в мосто-

сят к основным источникам избыточного внекле-

видный фиброз начинается после 2 нед экспери-

точного матрикса [6, 12].

мента. Через 6 нед балочное строение долек пол-

Вследствие того, что в активации клеток Ито

ностью нарушено. Есть признаки цирроза печени

участвует матриксная металлопротеиназа 13-го

в виде перестройки гистоархитектоники органа

типа (MMP-13), мы изучили уровень ее экспрес-

– ложные дольки. При окраске пикросириусом

сии, а также тканевого ингибитора матриксных

красным можно видеть выраженный ступенчатый

металлопротеиназ 1-го типа [7, 13]. Согласно

некроз, который захватывает более 2/3 порталь-

данным литературы, характер экспрессии гена

ных трактов. ИГА составляет 12 баллов.

ММР-13 в ходе развития фиброза печени имеет

Полученные выводы согласовываются с резуль-

волнообразный характер. Первый пик активности

татами изучения активности печеночных фермен-

приходится на начало фиброгенеза. Возможное

26

РЖГГК он-лайн – www.gastro-j.ru

объяснение заключается в профиброгенном дейс-

М –К +К 1

2 3

4

5

твии матриксной металлопротеиназы за счет раз-

рушения нормального микроокружения клеток

Ито с последующей их активацией. Затем следует

спад уровня экспрессии гена ММР-13. Следующее

повышение приходится на период репарации пов-

режденной ткани [13].

Таким образом, внутрибрюшинное введение

четыреххлористого углерода вызывает статисти-

Рис. 3. Анализ экспрессии кДНК HGF человека в

чески значимое повышение уровня экспрессии

генов, участвующих в фиброгенезе. При этом

печени мышей.

пик экспрессии генов Сoll1α1, TGF-β1, α-SMA и

–К – контроль без сDNA; +К – контроль с hсDNA;

М – маркер 50 bp; 1–5 – cDNA мышей, получавших

TIMP-1 приходится на 4-ю неделю эксперимента,

терапию hHGF. Длина ампликона 221 bp

а для ММР-13 – на 2-ю и 4-ю. Снижение экспрес-

сии всех генов наблюдается к 6-й неделе экспери-

мента. Эти данные согласуются с результатами

Для того чтобы подобрать оптимальные усло-

гистологического исследования печеночной ткани

вия доставки плазмидных конструкций в ткань

и свидетельствуют о том, что внутрибрюшинное

печени, вводили раствор кДНК β-галактозидазы

введение CCl4 приводит к развитию фиброза

с помощью локальных инъекций и методом гид-

печени на сроке от 2 до 4 нед, а в период с 4-й по

ропорации. Сохранность ткани оценивали после

6-ю неделю формируется цирроз. После анализа

окраски срезов печени гематоксилином и эозином,

полученных результатов было решено вводить

эффективность трансфекции – морфометричес-

плазмидные конструкции начиная с 4-й недели

ким методом. В случае обкалывания паренхи-

эксперимента.

мы печени на срезах

отмечали

значительную

.RU

лейкоцитарную

инфильтрацию

и обширное повреждение пече-

-VESTI

ночной

ткани

с

последующим

замещением

жировой

тканью.

При этом эффективность транс-

фекции, подсчитанная морфо-

метрическим методом, составила

0,05%. После введения раствора

.M

кДНК

методом

гидропорации

признаков повреждения

ткани

не выявлено. Клетки, транс-

A

B

фицированные

плазмидной

WWW

ДНК, располагались преиму-

щественно по ходу кровенос-

ных

сосудов.

Эффективность

трансфекции

составила

1,4%.

Содержание мРНК HGF чело-

века в печени мышей оценивали

через

неделю

после последней

инъекции плазмиды с помощью

ПЦР с праймерами, специфич-

ными к кДНК HGF человека.

C

D

Проведенный

анализ

подтвер-

дил

экспрессию

кДНК

HGF

Рис. 4. Трансфекция клеток плазмидной ДНК. Клетки линии HEK 293

человека в

печеночной

ткани

мышей, получавших внутривен-

А – окраска субстратом Х-Gal;

B – срез печени на стадии фиброза через 6 дней после введения плазмид-

ные инъекции плазмидной конс-

ной ДНК, содержащей кДНК β-галактозидазы, методом гидропорации,

трукцией (рис. 3).

окраска субстратом X-Gal и пикросириусом красным. Стрелками показа-

Эффективность генной тера-

ны участки печени, трансфицированные плазмидной ДНК, содержащей

пии фактором роста гепатоци-

кДНК β-галактозидазы;

С – срез печени на стадии фиброза после введения физиологического

тов изучали с помощью мор-

раствора методом гидропорации;

фометрического анализа срезов

D – после трансфекции плазмидной ДНК, содержащей кДНК фактора

печеночной ткани, окрашен-

роста гепатоцитов человека, методом гидропорации, окраска пикросириу-

ных

пикросириусом

красным.

сом красным.

Установлено

статистически

Увеличение ×10

4, 2010

Оригинальные исследования

Potential of albumin dialysis at terminal liver failure in patients

with chronic liver diseases

RU

O.E. Nikiforova, Ye.N. Bessonova, O.M. Lesnyak, O.A. Stroganova

.

Цель исследования. Изучить эффективность

Aim of investigation. To study efficacy of albumin

альбуминового диализа (MARS) при осложнениях

dialysis (MARS) at complications of end-stage liver dis-

терминальной стадии заболеваний печени, имею

eases having various etiology.

щих различную этиологическую природу.

-

VESTIMaterial and methods. Overall 65 patients with

Материал и методы. В исследование были

chronic terminal liver diseases of Child–Pugh B and C

WWW

включены 65 пациентов с хроническими терминаль.M-

classes have been included in original study.

ными заболеваниями печени классов В и С по Child–

The first (main group) included 25 patients, that

Pugh.

received albumin dialysis in addition to traditional drug

Первая (основная) группа наблюдения составила

therapy. The second group (comparison group) includ-

25 человек и получала в дополнение к традиционной

ed 40 patients who received only traditional pharma-

медикаментозной терапии альбуминовый диализ.

ceutical therapy. In relation to etiology of disease all

Вторая группа (группа сравнения) включала 40 боль-

patients were divided into three groups: 1) cirrhoses of

ных, которые получали только медикаментозную

the nontoxic etiology as an outcome of viral hepatitis,

традиционную терапию. В зависимости от этио-

primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangi-

логии заболевания все пациенты были разделены

tis; 2) cirrhosis of toxic (alcohol-induced) etiology and

на три группы: 1) циррозы нетоксической природы

3) focal liver lesions – hepatocellular carcinoma (HCC).

– исход вирусного гепатита, первичный билиар-

Results. Among patients, receiving treatment with

ный цирроз, первичный склерозирующий холангит;

albumin dialysis the stage of hepatic encephalopathy

2) цирроз токсической (алкогольной) этиологии и

at patients in the subgroup with cirrhosis of toxic (alco-

3) очаговые поражения печени – гепатоцеллюляр-

hol-induced) etiology significantly decreased (р<0,01).

ная карцинома (ГЦК).

In general the level of biochemical scores of blood at

Результаты. Среди получавших терапию с

patients after MARS was lower, than at patients who did

использованием альбуминового диализа достовер-

not receive MARS, however no improvement in AST,

но снижалась степень печеночной энцефалопатии

ALT activity was found. Study results (triple decrease

у больных в подгруппе с циррозом токсической

of bilirubin level and significant decrease of creatinine

РЖГГК он-лайн – www.gastro-j.ru

29

Оригинальные исследования

4, 2010

(алкогольной) этиологии (р<0,01). В целом уро-

contents) testify the greater efficacy of albumin dialysis

вень биохимических показателей крови у пациентов

in subgroup of patients with liver cirrhosis of toxic (alco-

после проведения MARS ниже, чем у лиц, не полу-

hol-induced) etiology. At patients with nontoxic cirrhosis

чавших MARS, однако не установлено положитель-

(mainly cholestatic), who received MARS-therapy, the

ной динамики в отношении активности АсАТ, АлАТ.

majority of whom were in the waiting list of liver trans-

Результаты исследования (трехкратное снижение

plantation (9 patients), decrease of total bilirubin level

уровня билирубина и достоверное снижение содер-

was accompanied by decrease of pruritis. In group of

жания креатинина) свидетельствуют о большей

patients with HCC no significant decrease of bilirubin

эффективности альбуминового диализа в подгруппе

level was observed. It is necessary to point, that in none

пациентов с циррозом печени токсической (алко-

patients MARS was complicated by bleeding or progres-

гольной) этиологии. У больных с нетоксическим цир-

sion of other manifestations of hemorrhagic syndrome.

розом (преимущественно холестатическим), полу-

Conclusions. Albumin dialysis in the patients with

чивших MARS-терапию, большинство из которых

cirrhosis enrolled to the waiting list of liver transplanta-

находились в листе ожидания трансплантации пече-

tion, allows to prolong scheduled interim to liver trans-

ни (9 человек), снижение уровня общего билиру-

plantation that is the extremely important factor, allow-

бина сопровождалось уменьшением кожного зуда.

ing to survive to operation and to decrease mortality in

В группе пациентов с ГЦК достоверного снижения

patients with terminal liver failure.

уровня билирубина не наблюдалось. Следует заме-

Key words: albumin dialysis, liver failure.

тить, что ни у одного больного проведение MARS не

осложнилось кровотечениями или усилением других

проявлений геморрагического синдрома.

Выводы. Проведение альбуминового диализа

у больных циррозом, стоящих в листе ожидания

трансплантации печени, дает возможность продлить

RU

намечаемый срок пересадки печени, что является

крайне важным фактором, позволяющим дожить до

.

операции и снизить смертность у пациентов с тер-

минальной печеночной недостаточностью.

VESTI

-

Ключевые слова: альбуминовый диализ, пече-

ночная недостаточность.

.M

(альбуминовый диализ), при котором происходит

о данным ВОЗ, опубликованным в 2004 г.

мире насчитывается примерно 20 млн боль-

комбинация специфического выведения накапли-

Пных хроническими заболеваниями печени,

вающихся при печеночной недостаточности альбу-

около 14 млн имеют цирроз печени (ЦП). Болезни

минсвязанных токсинов с удалением водораство-

печени входят в десятку наиболее частых причин

римых токсинов путем диализа [9, 10]. При этом

смерти. Трансплантация печени, которая успешно

благодаря использованию избирательного мемб-

развивается в мировой медицинской практике,

ранного транспорта процесс не сопровождается

привела к переосмыслению подходовWWWк лечению

выведением полезных и необходимых веществ и

пациентов с терминальными стадиями хроничес-

белков [9]. Система была разработана J. Stange

ких диффузных и очаговых поражений печени,

и S.R. Mitzner (Германия) в качестве детокси-

обеспечив возможность радикального излечения

кационной терапии при острых и хронических

с долгосрочным и благоприятным прогнозом [6].

заболеваниях печени, протекающих с печеночной

В связи с этим возникает острая необходимость

недостаточностью [19].

развития и широкого внедрения максимально

Ключевым моментом технологии альбумино-

эффективных методов терапии данной группы

вого диализа, а именно молекулярной адсорби-

пациентов, в большинстве случаев находящихся в

рующей рециркулирующей системы (Molecular

листе ожидания пересадки печени.

adsorbent recirculating system – MARS), является

Вследствие того, что состояние больных с тяже-

перенос через определенным образом модифици-

лым течением заболеваний печени, приводящим к

рованную высокопроницаемую диализную мемб-

прогрессирующей печеночной недостаточности,

рану токсинов, имеющих сродство с альбумином,

требует интенсивной терапии при развитии поли-

из крови на акцептор. Акцептором выступает

органной недостаточности, все чаще возникает

донорский человеческий альбумин, циркулиру-

потребность в применении искусственных экстра-

ющий в замкнутом контуре. Водорастворимые

корпоральных методов очищения крови [12]. При

низкомолекулярные вещества удаляются по гра-

возникновении проблемы временного замещения

диенту концентрации как при диализе [17].