Физико-химические свойства белков и методы их выделения

Растворимость зависит от:

1. Форма молекул

2. Молекулярная масса

3. Суммарный заряд

4. Соотношение полярных и не полярных групп на поверхности нативных молекул белков

5. Состав растворителя

Методы выделения и очистки белков Методы разрушения тканей и экстракции белков

Гомогенизация биоматериала	PH, C солей, сосуд в котором растирает пестик
Метод замораживания и оттаивания тканей	Кристаллизация разрушает ткани, центрифугированием осаждают осадок
Экстракция белков св с мембранами на протомеры	Детергенты (разрушают гидрофобные св в олигомерных белках)
Удаление из раствора небелковых в-в	Используя физ-хим св-ва

Методы отчистки белков

1. Проводится при низко температуре (избежать денатурации)

Избирательная денатурация	50-70 С или PH 5.0 удаляет большинство белков
Высаливание	(NH4)2SO4, чем больше р-сть тем больше конц соли. Соли щм щзм вызывают обратимое осаждение
Гель фильтрация или метод молекулярных сит
Ультрацентрифугирование
Электрофорез
Ионообменная хроматография
Аффинная хроматография или хроматография по сродству

Количественное определение белков

Оптические методы основаны на оптических свойствах белков. К ним относятся:

• спектрофотометрические методы, оценивающие интенсивность поглощения белками УФ лучей в диапазоне около 200 нм и 260 нм. Степень УФЛ - поглощения пропорциональна концентрации белка;

• рефрактометрические методы основаны на способности растворов белков преломлять свет пропорционально их концентрации;

• нефелометрические методы основаны на способности растворов белков рассеивать свет пропорционально их концентрации;

• поляриметрические методы основаны на способности растворов белков вращать плоскость поляризованного света пропорционально их концентрации.

Колориметрические методы основаны на цветных реакциях белков

2. Биуретовая реакции. Метод основан на биуретовой реакции, образующей в щелочной среде окрашенные в фиолетовый цвет комплексы пептидных связей с ионами меди (II). Он известен в двух модификациях: макрометод и микрометод. Макрометод (макроопределение) применяют в случаях, когда содержание белка в исследуемом образце достаточно велико (1-10 мг/мл); Микрометод позволяет определить в 4 мл щелочного раствора 0,1-2 мг белка. На окраску, даваемую белками, оказывают влияние соли аммония, сахароза, глицерин и др. Ниже приведено описание макрометода.

3. метод Лоури. В щелочной среде ионы Cu+2 образуют комплекс с пептидными связями, переходя в Cu+. Одновалентные ионы меди реагируют с реактивом Фолина (фосфомолибденовая кислота с фенолом), образуя нестабильный продукт, переходящий в молибденовую синь, с максимумом адсорбции при 750 нм. Увеличение адсорбции при 750 нм пропорционально концентрации белка. Метод очень чувствителен к наличию в растворе посторонних восстановителей (что затрудняет его использование при определении белка в неочищенных препаратах), чувствительность к белку — 10 — 100 мкг/мл.

4. Метод Бредфорда. Метод основан на реакции красителя кумасси (coomassie) с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет голубую окраску с максимумом поглощения при 595 нм. Таким образом увеличение адсорбции раствора при длине волны, равной 595 нм, пропорционально количеству белка в растворе. Метод даёт хорошее значение концентрации белка в пределах от 2 мкг/мл до 120 мкг/мл (в этих границах соблюдается линейная зависимость увеличения адсорбции от концентрации, в целом чувствительность метода зависит от соотношения концентраций определяемого белка и красителя: чем больше красителя, тем чувствительней метод), менее «капризный» по сравнению с методом Лоури.

5. метод сорбции белками определённых красителей. Интенсивность окраски определяется концентрацией белкового раствора.

6. 3 % р-р сульфосалициловой кислоты дает помутнение

7. Пирогаллоловый метод ( краситель пирогаллоловый красный связывается с + заряженными аминогруппами- красное окрашивание)

Азотометрические методы основаны на определении содержания азота и пересчёте его на концентрацию белка (в белках 16% азота).

Навеску анализируемого материала кипятят с концентрированной серной кислотой. При этом углерод органических веществ окисляется до диоксида углерода, водород – до воды; азот (отрицательно заряженный трехвалентный) превращается в аммиак, который с серной кислотой, взятой в избытке, образует сульфат аммония. Минерализованную пробу затем подщелачивают, аммиак отгоняют в раствор кислоты, где определяют титрованием.

Азот нитратов и нитритов, ядер гетероциклических соединений в ходе этого процесса в аммонийную соль не превращается.

ДРУГИЕ: Гравиметрические методы (выделения; осаждения; отгонки)

Гравиметрические (весовые) методы определения общего белка сыворотки основаны на высушивании белков до постоянной массы и взвешивании на аналитических весах. Методы трудоемки и в настоящее время практически не используются для определения общего белка сыворотки. Гравиметрический метод продолжает использоваться в некоторых лабораториях для определения фибриногена в плазме крови.

Титриметрический метод- на основе всех видов реакций (перенос водорода эелектрона эл пары и процессы осаждения)