неисчерпаемого мыслимого числа белков. Ведь из 20 аминокислот можно построить 20×20=400 разных димеров (т.е. попарно соединенных аминокислот), 20×20×20=203=8000 тримеров, а сравнительно коротких белков длиной всего в 100 аминокислотных остатков – 20100 = 10130, что гораздо больше, чем число атомных ядер во всей доступной наблюдению части Вселенной (последнее оценивается как 1080). Определенные характерные для данного организма белки не могут возникать случайно. При образовании в живом организме (биосинтезе) белков должна существовать некоторая управляющая система, которая содержит информацию о том, какие именно последовательности аминокислот нужно собирать в данном организме. Первичным материальным носителем такой информации является ДНК.
Итак, первичная структура генетически детерминирована и определяет индивидуальные свойства белков, их видовую специфичность, на ее основе формируются все последующие структуры.
2. Вторичная структура
Это регулярная организация полипептидной цепи, удерживаемая водородными связями между NH и СО группами пептидных связей стержня цепи. Она может быть в виде α-спирали и β-
структуры. В α-спирали водородная связь возникает в пределах одной цепи между первым и пятым аминокислотными остатками и направлена параллельно оси молекулы. На каждый виток (шаг) спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка, шаг спирали равен 0,54 нм.
В β-структуре водородные связи возникают между соседними цепями (или в одной цепи), перпендикулярно оси молекулы.
Особую вторичную структуру имеет коллаген.
Не все полипептиды способны образовывать устойчивую α- спираль. Препятствуют образованию α-спирали подряд расположенные глутаминовая кислота, аргинин, лизин, аспарагин, серин, треонин, лейцин. Когда в полипептидной цепи встречается пролин, α-спираль нарушается и возникает петля или изгиб, т.к. пролин не способен образовывать внутрицепочечную водородную связь.
Степень α-спирализации некоторых белков
1. |
Гемоглобин |
80% |
2. |
Инсулин |
46-60% |
3. |
Альбумин (яйца) |
30-45% |
4. |
Пепсин |
20-30% |
5. |
Казеин |
10% |
21
3. Третичная структура
Это расположение полипептидной цепи в трехмерном про-
странстве. Эту структуру стабилизируют дисульфидные связи (цисцис), ионные (асп-лиз), водородные (тир-гис), гидрофобное взаимодей-
ствие (лей-вал, изо-ала). Связи образуются между боковыми ради-
калами аминокислот. В зависимости от формы третичной структуры различают глобулярные и фибрилярные белки. В глобулярных бел-
ках часто преобладает α-спираль, фибриллярные белки образуются на основе β-структуры.
В крупных белках при сворачивании полипептидной цепи часто образуются две или более пространственно разделенные области, называемые доменами. По своей структуре каждый домен напоминает небольшой белок. Обычно в одном домене от 40 до 300 остатков аминокислот.
На поверхности глобул располагаются гидрофильные группы, внутри – гидрофобные.
Длинные белковые цепи состоят зачастую более чем из 1000 аминокислотных остатков, среди которых имеются как полярные, так и неполярные (гидрофильные и гидрофобные) радикалы. Последние предпочитают взаимодействовать не с водой, а друг с другом. В результате этого белковые молекулы принимают компактную форму с наименьшей площадью поверхности. Этому требованию при заданном объеме отвечает сфера. Таким образом, если число гидрофильных аминокислотных остатков достаточно велико для того, чтобы покрыть поверхность сферического гидрофобного ядра, белковая молекула будет иметь сферическую (глобулярную) форму. Если их число больше минимально необходимого, глобула принимает форму эллипсоида. Если же, напротив, гидрофильных радикалов не хватает, чтобы защитить гидрофобное ядро молекулы от водной атаки, в ней остаются незащищенные участки. Такие белковые молекулы имеют тенденцию образовывать надмолекулярные ассоциаты, и в дополнении ко вторичной и третичной структурам белки приобретают четвертичную структуру.
4. Четвертичная структура
Характерна для белков, состоящих из нескольких субъединиц. Это взаиморасположение субъединиц белка в пространстве. Формируют эту структуру слабые связи между комплементарными поверхностями субъединиц.
Для четвертичной структуры вводят следующую терминологию: протомер – отдельная полипептидная цепь в третичной структуре; субъединица – протомер или несколько протомеров, несущих часть функциональной активности белка; мультимер – сочетание субъединиц белка, несущих полную функциональную активность.
22
Для проявления биологической активности белка необходима нативная третичная, а для мультимерных белков – четвертичная структура.
Олигомерные глобулярные белки, имеющие четвертичную структуру, часто обладают регуляторными свойствами.
Рассмотрим, как наличие четвертичной структуры сказывается на функции. Для этого сравним два белка: миоглобин и гемоглобин.
Миоглобин – белок, сохраняющий и транспортирующий кислород в мышцах. Состоит из одной полипептидной цепи (153 аминокислотных остатка), свернутой в пространстве в виде плотной глобулы (третичная структура). В гидрофобном кармане располагается гем, железо в составе которого способно присоединять кислород. Кривая насыщения миоглобина кислородом имеет гиперболическую форму. Эффект полного насыщения кислородом наблюдается при низком значении рО2 (которое имеется в мышцах).
Гемоглобин – мультимер, образованный из 4-х субъединиц двух типов – α2β2 (четвертичная структура). Каждая из субъединиц похожа на молекулу миоглобина. Молекула гемоглобина способна присоединять 4 молекулы кислорода. При этом проявляется совместный (кооперативный) эффект субъединиц. При оксигенации гемоглобина связывание кислорода одной субъединицей так изменяет конформацию остальных субъединиц, что присоединение к ним кислорода облегчается.
Физиологический смысл заключается в том, что при рО2 меньше 35 мм рт.ст. (ткани) кислород будет связываться миоглобином. Сигмоидный характер оксигенации гемоглобина обеспечивает его транспортную функцию.
Возникает вопрос: почему многие белки состоят из субъединиц? Какие преимущества это дает по сравнению с одной длинной пептидной цепью?
1)Наличие субъединичной структуры позволяет «экономить» генетический материал. Для олигомерных белков, состоящих из идентичных субъединиц, резко уменьшается размер структурного гена и соответственно длина матричной РНК.
2)При сравнительно небольшой величине цепей уменьшается влияние случайных ошибок, которые могут возникнуть в процессе биосинтеза белковых молекул. Кроме того, возможна дополнительная выбраковка «неправильных», ошибочных полипептидов в процессе ассоциации субъединиц в единый комплекс.
3)Наличие субъединичной структуры у многих белков позволяет клетке легко регулировать их активность, например, путем смещения равновесия ассоциация – диссоциация в ту или иную сторону.
4)Субъединичная структура облегчает и ускоряет процесс молеку-
23
лярной эволюции. Мутации, приводящие лишь к небольшим конформационным изменениям на уровне третичной структуры за счет многократного усиления этих изменений при переходе к четвертичной структуре, могут способствовать появлению у белка новых свойств.
Характерной особенностью белков с четвертичной структурой является их способность к самосборке. Легко происходит, например, самосборка гемоглобина из смеси альфа- и бета-цепей. Таким образом, в аминокислотной последовательности полипептидных цепей олигомерного белка закодированы как бы два уровня информации: один из них определяет трехмерную структуру отдельных полипептидных цепей, а второй, поскольку каждая субъединица содержит специфические участки связывания с другими субъединицами, определяет четвертичную структуру всей многокомпонентной молекулы в целом.
При денатурации, когда разрушаются пространственные структуры путем разрыва дисульфидных и слабых нековалентных связей, белок теряет свою биологическую активность. Потеря биологической активности связана с утратой неповторимой мозаики функциональных групп и радикалов на поверхности молекулы белка.
Денатурацию вызывают агенты, влияющие на заряд молекулы белка (кислоты, щелочи) и гидратную оболочку (нагревание, водоотнимающие вещества). При денатурации первичная структура сохраняется. Денатурация обратима, если после удаления денатурирующего агента восстанавливаются нативная конформация и свойства бел-
ковой молекулы.
Белки можно разделить на два основных класса: фибриллярные белки – это расположенные параллельно друг другу вытянутые полипептидные цепи, и глобулярные белки, в которых полипептидные цепи плотно свернуты в глобулы.
9. Белковая глобула – твердое тело или жидкость?
Итак, глобула сформировалась. В ней присутствуют элементы вторичной структуры, например достаточно протяженные α-спирали и
β-слои, уложенные определенным образом и формирующие как бы каркас макромолекулярной структуры. Между элементами вторичной структуры определенным образом уложены неспирализованные участки полипептидной цепи, в части глобулы могут присутствовать молекулы воды, гидратирующие полярные группы. Каковы общие физические характеристики белковой глобулы? На что был бы похож материал, из которого сделана глобула, если глобулу можно было бы взять в руки?
Ответ на этот вопрос имеет непростую историю. Практически до начала 80-х годов считалось, что белок скорее похож на органические
24
кристаллы. В этом убеждали данные рентгеноструктурного анализа, которые показывали, что атомы в глобуле уложены очень плотно и каждый из них, как в кристалле, четко знает свое место. Так как периодичности (как в кристаллах) в расположении атомов в глобуле не наблюдается, то появился даже термин для описания физического состояния глобулы – «апериодический кристалл».
На рисунке представлена упрощенная схема устройства белковой глобулы, которая поможет понять ее основные свойства как механической системы. Элементы вторичной структуры образуют довольно жесткий спиральный каркас. Спиральный каркас окружен значительно более быстро движущимися боковыми группами. Они образуют как бы жидкоподобную «опушку» вокруг жесткого каркаса. То есть с точки зрения механики глобулу можно представить как армированную каплю.
а
b
Модель армированной капли для белковой глобулы: a
– относительно жесткие спиральные структуры; b – жидкоподобные области
К.В. Шайтан, 1999
Итак, белковая глобула при обычных температурах сочетает свойства очень вязкой капельки жидкости и не очень упругого твердого тела. Сочетание таких свойств оказывается весьма удачным для обеспечения функционирования белков. Упругий каркас поддерживает структуру с точностью до нескольких ангстрем, формируя группы активного центра в конфигурации, близкой к наиболее благоприятной для осуществления функционального акта. Химические изменения, происходящие в активном центре, сопровождаются перемещениями атомов и групп на расстояния около 1 ангстрем. Жидкоподобная внутрибелковая среда, характеризуемая достаточно быстрыми временами конформационной релаксации, не является непреодолимым препятствием для движений атомных групп в определенных пределах, необходимых для проведения реакции. Но эта же среда будет резко тормозить перемещения атомных групп, геометрия которых не вписывается в пределы, определяемые упругими (жесткими) элементами данной белковой глобулы. Тем самым создаются физические предпосылки регуляции стереоспецифичности биохимических реакций.
25
10. Формирование нативной структуры белка
10.1. Внутриклеточная регуляция формирования нативной пространственной структуры белков
Синтезируемые в клетке полипептидные цепи, образованные в результате последовательного соединения аминокислотных остатков, представляют собой как бы полностью развернутые белковые молекулы. Для того, чтобы белок приобрел присущие ему функциональные свойства, цепь должна определенным образом свернуться в пространстве, сформировав функционально активную («нативную») структуру. Несмотря на громадное число теоретически возможных для отдельной аминокислотной последовательности пространственных структур, сворачивание каждого белка приводит к образованию единственной нативной конформации. Таким образом, должен существовать код, определяющий взаимосвязь между аминокислотной последовательностью полипептидной цепи и типом пространственной структуры, которую она образует. Выяснение этой взаимосвязи – нерешенная проблема, важность которой трудно переоценить. Действительно, в настоящее время уже понятно, каким образом закодированы аминокислотные последовательности в структуре ДНК, однако принципы, определяющие формирование нативной конформации белка, все еще остаются «секретом жизни». Работы по изучению сворачивания белка были начаты сравнительно недавно. Накопленная информация (главным образом основанная на результатах исследований, проведенных с растворами отдельных очищенных белков) позволила заключить, что образование пространственной структуры – процесс спонтанный, не требующий ни дополнительной информации, ни источника энергии. Предполагалось, что эти положения применимы также и для сворачивания белков внутри клетки. Однако, как это часто случается в биологии, последующие открытия заставили отказаться от такой логики; они показали, что в действительности дело обстоит значительно сложнее. Оказалось, что процесс сворачивания белка in vivo не может считаться ни спонтанным, ни энергонезависимым. Благодаря существующей внутри клетки высоко координированной системе регуляции, полипептидная цепочка с самого момента своего «рождения», сходя с рибосомы, попадает под контроль факторов, которые, не изменяя специфического пути сворачивания (определяемого генетическим кодом), обеспечивают оптимальные условия для реализации быстрого и эффективного образования нативной пространственной структуры.
26
10.2. Образование пространственной структуры белка – процесс многостадийный
Как показали результаты рентгеноструктурного анализа белковых кристаллов, пространственная (третичная) структура каждого бел-
ка характеризуется сочетанием элементов вторичной структуры (α- спиралей, β-тяжей), а также гибких участков полипептидной цепи, называемых петлями. Способность того или иного участка полипептидной цепи образовывать элемент вторичной структуры (например, свернуться в α-спираль) зависит от характера аминокислотной последовательности данного отрезка цепи. Таким образом, число и расположение α-спиралей, β-тяжей и петель по ходу полипептидной цепи различно у разных белков и определяется генетическим кодом. Этим объясняется потенциальная способность любой полипептидной цепи к спонтанному сворачиванию в уникальную третичную структуру.
Согласно современным представлениям, процесс сворачивания имеет иерархическую природу: вначале очень быстро (за миллисекунды) формируются элементы вторичной структуры, служащие как бы «затравками» для образования более сложных структур (стадия 1). Второй стадией (также происходящей очень быстро) является специфическая ассоциация некоторых элементов вторичной структуры с образованием супервторичной структуры (это могут быть сочетания нескольких α-спиралей, нескольких β-цепей либо смешанные ассоциаты данных элементов). Следующим этапом, играющим важнейшую роль для формирования уникальной «архитектуры» белка, является образование специфических контактов между участками, значительно удаленными один от другого в аминокислотной последовательности, но оказывающимися сближенными в третичной структуре. Полагают, что это, главным образом, гидрофобные взаимодействия, обусловленные сближением неполярных групп и вытеснением молекул воды, расположенных между ними. Для формирования уникальной пространственной структуры каждого белка необходимо, чтобы образовалось определенное (оптимальное в каждом случае) число таких специфических контактов. На пути к достижению оптимального варианта возможны ошибки, образование «неправильных» контактов; в этом случае происходит перебор разных вариантов структуры до тех пор, пока не будет достигнут тот единственный вариант, который соответствует функционально активному состоянию данного белка.
На пути, ведущем от образования элементов супервторичной структуры к окончательному сворачиванию цепи в компактную глобулу, имеется промежуточная стадия (стадия 3), связанная с формированием основных элементов третичной структуры (специфического сочетания α-спиралей, β-тяжей, соединяющих петель) и образованием
27
гидрофобного ядра молекулы.
Стадии
сворачивания
полипептидной цепи в нативную конформацию
(1-4).
Н.К. Наградова, 1996 г.
Молекула приобретает пространственную структуру, близкую к структуре нативного белка‚ вместе с тем, она еще не обладает присущей данному белку функциональной активностью. Это состояние, получившее название «расплавленная глобула», отличается от нативного меньшей степенью упорядоченности структуры; неполярные группы, формирующие гидрофобное ядро молекулы, «упакованы» недостаточно плотно. Отсутствие ряда специфических взаимодействий приводит к изменению ориентации подвижных петель; в целом молекула более лабильна и склонна к «слипанию» с другими такими же молекулами с образованием агрегатов. Таким образом, неспецифическая агрегация (стадия 5) может уменьшать число молекул белка, находящихся на правильном пути сворачивания (стадия 4), то есть снижать эффектив-
28
ность этого процесса. Как показали модельные эксперименты, проведенные in vitro, образование «расплавленной глобулы» происходит значительно быстрее, чем ее переход в нативную структуру; реакция 4 (связанная с перебором разных конформаций) является, таким образом, самой медленной стадией процесса сворачивания.
Вероятность агрегации сильно возрастает при повышении температуры и концентрации белка, поэтому эффективное спонтанное сворачивание полипептидной цепи происходит в разбавленных растворах и при низких температурах. Обращаясь к ситуации, имеющей место in vivo, мы должны признать, что условия, существующие в клетке, сильно отличаются по этим параметрам. Вместе с тем, в физиологических условиях вновь синтезируемые полипептидные цепи сворачиваются достаточно быстро и эффективно. Следовательно, в клетке должны существовать специальные механизмы регуляции процесса сворачивания.
Прежде чем перейти к рассмотрению этих механизмов, отметим, что изображенная на рисунке схема описывает стадии сворачивания полипептидной цепи, кодируемой одним геном. Многие белки, однако, возникли в процессе эволюции в результате слияния разных генов; участки полипептидных цепей таких белков, кодируемые разными генами, сворачиваются независимо друг от друга, по разным путям и с разными скоростями, образуя после сворачивания глобулярные структуры, называемые доменами. Формирование нативной структуры белков, состоящих из двух или более доменов, усложняется за счет дополнительной стадии – установления специфических контактов между доменами. Ситуация еще более усложняется, когда функционально активна олигомерная форма белка (то есть состоящая из нескольких полипептидных цепей, каждая из которых после сворачивания образует так называемую субъединицу). В этих случаях добавляется еще одна стадия – установление контактов между субъединицами.
10.3. Механизмы регуляции процесса сворачивания полипептидной цепи внутри клетки
Согласно современным представлениям, клетка располагает, по крайней мере, двумя типами таких механизмов: 1) основанным на регуляции скорости превращения «расплавленной глобулы» в нативную структуру (реакция 4) 2) обеспечивающим защиту частично свернутого белка от неспецифической агрегации, обозначенной на рисунке как реакция 5.
29
Схематическое изображение структуры «расплавленной глобулы» по сравнению со структурой нативного белка. Элементы вторичной структуры представлены двумя спиральными участками (цилиндры). Заштрихованные фигуры изображают неполярные группы аминокислотных остатков
Н.К. Наградова, 1996 г.
Ферменты, ускоряющие процесс сворачивания
Как уже отмечалось, стадия превращения «расплавленной глобулы» в нативный белок является самой медленной, ограничивающей скорость всего процесса. Это обусловлено тем, что установление «оптимального набора» специфических взаимодействий, стабилизирующих нативную конформацию, связано с необходимостью структурных перестроек, происходящих относительно медленно. К их числу относится цис-транс-изомеризация пептидной связи, предшествующей остатку пролина. Поскольку транс-конформация более стабильна, она преобладает во вновь синтезированной полипептидной цепи. Однако, для образования нативной структуры белка необходимо, чтобы около 7% связей, образованных остатками пролина, изомеризовались в цисконформацию. Эта реакция, приводящая к повороту цепи на 180о вокруг C–N связи, идет чрезвычайно медленно. In vivo она ускоряется благодаря действию специального фермента – пептидил-пролил-
цис/транс-изомеразы.
Второй фермент, ускоряющий процесс сворачивания, катализи-
рует образование и изомеризацию дисульфидных связей. Он лока-
лизуется в просвете эндоплазматического ретикулума и способствует сворачиванию секретируемых клетками белков, содержащих дисульфидные мостики (например, инсулин, рибонуклеаза, иммуноглобулины). Характерная особенность обоих ферментов состоит в том, что они не способны связываться с нативными белками; их субстраты имеют частично развернутую структуру, близкую к состоянию «расплавленной глобулы». Ускоряя стадии, лимитирующие скорость сворачивания, ферменты способствуют удержанию белка на правильном пути приобретения нативной структуры, снижая риск протеолитической деградации и агрегации лабильных промежуточных форм.
30