2 курс / Биохимия / БИОХИМИЯ

1/2!Vmах (реакция идет медленно); низкая величина Кm указывает на то,

что для насыщения фермента достаточно небольшого количества суб-

страта. Итак, величина Кm большая Ã низкое сродство субстрата к ферменту, Кm малая Ã высокое сродство субстрата к ферменту.

v

В соответствии с этим уравнением строим график в координатах 1/V и 1/(S). Получаем прямую, тангенс угла который равен величине Km/Vmax; отрезок, отсекаемый прямой от оси ординат – 1/Vмах; отрезок, отсекаемый от оси абсцисс – 1/Кm.

[s]

Для регуляторных ферментов с четвертичной структурой зависимость скорости реакции от концентрации субстрата имеет S-образный

характер вследствие кооперативного эффекта (незначительное изменение концентрации субстрата приводит к резкому увеличению скорости реакции).

2. Влияние концентрации фермента

52

3. Влияние температуры

реакции максимальна. Для ферментов растений tопт – 45-50°С, фермен-

тов теплокровных – 37°С. Исключение: миокиназа мышц выдерживает нагревание до 100°С.

4. Влияние рН среды

Ферменты, как и белки, имеют заряженные группы. Об- Vmax щий заряд молекулы фермента за-

висит от рН среды. Зависимость скорости ферментативной реакции от величины рН носит колоколообразный характер. Любые отклонения вправо и влево от оптимума рН изменяет заряд фермента,

7.4вплоть до достижения ИЭС, что приводит к потере каталитических

свойств. Большинство ферментов проявляет максимальную активность в узком диапазоне рН. Для большинства ферментов крови оптимум рН-

7,4. Для некоторых ферментов оптимум рН находится в кислой либо щелочной среде. Например, для пепсина оптимум рН-1,5, для трипсина

– 8,6.

Лекция 4

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ. МЕДИЦИНСКАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Способы регуляции активности ферментов

Активность ферментов, а значит и скорость химической реакции, можно регулировать, изменяя следующие параметры:

53

1)Абсолютное количество фермента.

2)Условия протекания реакции (рН, t, р), количество субстрата, наличие активаторов, ингибиторов.

3)Каталитическую эффективность фермента.

1. Регуляция количества ферментов

Абсолютное количество фермента в клетке определяется скоростями его синтеза и распада.

В клетке существует два вида ферментов:

1.Конститутивные ферменты – всегда присутствуют в клетках данного организма. Они являются обязательными компонентами клетки, синтезируются с постоянной скоростью в постоянных количествах.

2.Адаптивные ферменты – их образование зависит от условий, складывающихся в клетке. Среди них выделяют индуцируемые и репрессируемые ферменты.

Индуцируемыми обычно бывают ферменты с катаболической функцией (катаболизм – процессы распада). Их образование может быть вызвано или ускорено субстратом данного фермента.

Репрессируемыми обычно бывают анаболические ферменты (анаболизм – процессы синтеза). Ингибитором (репрессором) синтеза ферментов может быть конечный продукт данной ферментативной реакции.

2.Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов

Активаторы ферментов

Активаторы ферментов – вещества, которые разными путями повышают способность ферментов ускорять реакцию.

Свойства активаторов:

1.Формируют активный центр фермента (Со2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+).

2.Облегчают образование фермент-субстратного комплекса

(Mg2+, Мn2+).

3.Стабилизируют нативную структуру фермента.

4.Защищают функциональные группы активного центра от повреждения, например, восстанавливают SH-группы активного

центра (глутатион, цистеин).

5.Воздействуют на субъединицы молекулы фермента (протеинкиназа регулируется цАМФ).

54

Активаторами обычно бывают катионы (в таблице Менделеева с 19 по 30), реже анионы. Исключение: ионы хлора и анионы других галогенов активируют пепсин, амилазу, аденилатциклазу. Активаторами могут быть белки: апопротеины АI активирует ЛХАТ, апопротеины СIIЛПЛ.

Ингибиторы ферментов

Это соединения, которые взаимодействуя с ферментом, препятствуют образованию нормального фермент-субстратного комплекса,

уменьшая тем самым скорость реакции или прекращая её.

Классификация ингибиторов ферментов

Ингибиторы

неспецифические специфические

необратимые обратимые

конкурентные неконкурентные (изостерические) (аллостерические)

Неспецифические ингибиторы вызывают денатурацию фермента (соли тяжелых металлов, кислоты, щелочи). Их действие не связано с механизмом ферментативного катализа.

Специфические ингибиторы – их действие связано с механизмом ферментативного катализа.

При необратимом ингибировании образуется прочный комплекс фермента и ингибитора, и фермент частично или полностью теряет свою активность. Даже если удалить свободный ингибитор из среды, та часть молекул фермента, которая успела связаться с ингибитором,

остается угнетенной длительное время.

Примеры необратимых ингибиторов

1.Ингибиторы металлосодержащих ферментов – НСN, KCN, CO,

NaN3 – дыхательные яды, они стойко меняют валентность Fe и Сu, вхо-

дящих в состав ферментов дыхательной цепи, препятствуя переносу электронов на О2.

2.Вещества, связывающие SH группы активного центра – моноиодацетат, соединения ртути и мышьяка.

3.Вещества, связывающие OH-группы серина в активном центре

55

–фосфорорганические соединения – боевые отравляющие вещества.

Вслучае обратимого действия ингибитор образует с ферментом непрочный комплекс, способный распадаться, в результате чего снова возникает активный фермент. Обратимые ингибиторы бывают конкурентные и неконкурентные.

Конкурентный ингибитор – эта молекула очень похожая на суб-

страт и фермент не может различить их, т.е. ингибитор и субстрат кон-

курируют за активный центр фермента.

Врезультате связывания конкурентного ингибитора с активным центром фермента падает концентрация фермент-субстратных ком-

плексов и скорость реакции уменьшается, т.к. комплекс ингибитор- фермент I-Е не способен давать продукт. Однако для активного центра

фермента все же лучше подходит субстрат. Поэтому при достаточно

большой концентрации субстрата его молекулы начнут вытеснять

ингибитор I из активного центра фермента, увеличится число молекул фермент-субстратного комплекса ЕS и скорость реакции увеличится.

Т.е. путем увеличения концентрации субстрата можно нейтрализовать действие конкурентного ингибитора и достичь максимальной скорости реакции. Однако для ее достижения потребуется гораздо большая концентрация субстрата.

Действие конкурентных ингибиторов: +I → EI → E + P

E

+S→ ES → E + P

Кинетика ферментативных реакций при действии конкурентных ингиби ов

Vmax = VmaхI

KmI > Km

Вывод: конкурентные ингибиторы увеличивают Km реакции, но не влияют на Vmax.

56

Пример конкурентного ингибирования:

СДГ – сукцинатдегидрогеназа

Сукцинат (янтарная кислота) – истинный субстрат для фермента сукцинатдегидрогеназы, который превращает ее в фумарат.

Малонат похож по строению на сукцинат и может взаимодействовать с активным центром фермента (конкурентный ингибитор), но фумарат не образуется.

В медицине широко применяются антиметаболиты. Это структурные аналоги природных субстратов (метаболитов). Антиметаболиты выступают в роли конкурентных ингибиторов ферментов, превращающих природные метаболиты. Пример: сульфаниламидные препараты:

Для роста и размножения бактерий необходима фолиевая кислота, которая синтезируется из ПАБК (природного субстрата) под действием фермента.

Сульфаниламиды, будучи похожими по строению на ПАБК, вытесняют ее из активного центра ферментов, фолиевая кислота не синтезируется, микробы не размножаются.

Неконкурентные ингибиторы связываются не с активным центром фермента, а с каким-либо другим участком фермента (часто с аллостерическим центром). В результате активный центр фермента свободен и к нему может присоединиться субстрат, т.е. образуется комплекс ЕSI.

Механизм ингибирования состоит в том, что комплекс ЕSI медленно образует продукт и увеличение [S] не влияет на Vmах, Vmах

57

реакции будет снижена. Поскольку эти ингибиторы не мешают связыванию субстрата с активным центром – величина Кm не меняется.

Действие неконкурентных ингибиторов:

Кинетика ферментативных реакций при действии неконкурентных ингибиторов

VmaхI<Vmax

KmI=Km

Вывод: неконкурентные ингибиторы понижают Vmax, но не влияют на Km.

3. Регуляция каталитической эффективности ферментов

Это все изменения активности фермента, происходящие при по-

стоянном его количестве.

Рассмотрим наиболее важные пути регуляции:

58

1.Превращение проферментов в активные ферменты. Ряд ферментов (например, протеолитические) синтезируются в неактивной форме – в виде проферментов. Чтобы перейти в активную форму, профермент должен подвергнуться ограниченному протеолизу (т.е. удалению части полипептидной цепи). В ходе протеолиза открывается или формируется активный центр и фермент активируется. Протеолитические ферменты синтезируются в поджелудочной железе в форме проферментов (исключается самопереваривание железы), а активация происходит только в желудочно-кишечном тракте при появлении пищи.

2.Химическая модификация. Это ковалентное присоединение или отщепление от фермента небольшой химической группы, что приводит

кизменению активности фермента. Чаще всего к ферменту присоединяется или отщепляется фосфатная группа – фосфорилирование-

дефосфорилирование фермента. Такой способ регуляции характерен для ферментов синтеза и распада гликогена.

Фосфорилирование и дефосфорилирование проводится разными ферментами, т.е. процесс обратим в функциональном смысле (активен

"неактивен), но не в химическом.

3.Мультиферментные комплексы. Это объединение нескольких ферментов, катализирующих многоступенчатую последовательность метаболических реакций. Пример: все ферменты синтеза жирных кислот объединены в единый мультиферментный комплекс – синтаза. Адекватное взаимное расположение ферментов облегчает перенос промежуточных продуктов от одного фермента к другому, что ускоряет выход конечного продукта. Кроме того, такое объединение обеспечивает более эффективный метаболический контроль.

4.Аллостерическая регуляция. Это регуляция путем взаимодействия эффекторов с аллостерическим центром фермента. Как правило, аллостерическая регуляция характерна для ферментов, имеющих субьединичное строение. Их называют аллостерическими или регуляторными ферментами. Каждая субъединица такого фермента содержит свои активный и аллостерический центры. Различают гомотропные и гетеротропные регуляторные ферменты.

Гомотропные: субстрат служит и эффектором. Гетеротропные: эффекторы не являются субстратом.

В аллостерических ферментах активный центр одной субъединицы фермента оказывает влияние на активный центр другой субъединицы в той же молекуле. В результате такого взаимодействия между субъединицами связывание субстрата становится кооперативным. Т.е. кинетические свойства таких ферментов не описываются уравнением Ми- хаэлиса-Ментен и зависимость скорости реакции от концентрации суб-

страта имеет форму S-образной кривой, а не гиперболы. При этом не-

59

большое увеличение концентрации субстрата будет приводить к значительному возрастанию скорости реакции.

Для объяснения кооперативных эффектов используют 2 модели:

симметричную (Моно, Уаймен, Шанжи) и последовательную (Кош-

ланд, Немети, Филмер). Рассмотрим фермент, состоящий из двух субъединиц, имеющих свои активные центры, которые могут в третичной структуре находиться в двух конформациях – R и Т. Причем если фермент находится в R (relax – расслаблять) конформации, субстрат

имеет высокое сродство к ферменту, а если в Т (tense – напрягать) – низкое сродство. Из таких субъединиц возможны следующие комбинации четвертичной структуры: RR; TT; RT.

По симметричной модели каждый мультимерный фермент может существовать в двух разных состояниях с неодинаковой четвертичной структурой, но все субъединицы в этих состояниях имеют одинаковую третичную структуру. Т.е. согласно этой модели возможны четвертичные структуры RR, TT и не может быть RT. В отсутствии субстрата преобладают формы ТТ. При связывании субстрата с Т-

конформерами произойдет одновременный переход всех субъединиц в R-состояние, что вызовет значительное увеличение скорости реакции.

По этой модели гомотропная регуляция всегда положительная, т.к. присоединение субстрата всегда увеличивает сродство фермента к нему – все ТТ перейдут в RR.

S+TT →RR

Последовательная модель, кроме состояний ТТ, RR допускает существование состояния TR, когда отдельные субъединицы мультимера могут в одно и то же время иметь разные третичные структуры. При этом связывание субстрата одной субъединицей вызывает изменение третичной структуры соседней субъединицы и в результате увеличивается или уменьшается их сродство к субстрату.

S+TT → TR →RR (+)

S+RR → TR → TT (-)

Т.е. по этой модели гомотропное взаимодействие может быть положительным и отрицательным.

Аллостерическая регуляция может приводить к активации или ингибированию фермента.

На базе симметричной модели: если эффектор сдвигает конформационное равновесие R " T в сторону R, то субстрат будет иметь увеличенное сродство к ферменту – положительный кооперативный эффект. Следовательно, эффектор – активатор. Если эффектор сдвинул равновесие в сторону конформации Т, имеет место уменьшение сродства к ферменту – отрицательный кооперативный эффект; т.е. эффектор – ингибитор.

5. Регуляция по типу обратной связи. Характерна для последова-

60

тельных реакций, при этом каждая реакция катализируется своим ферментом. Различают ретроингибирование и форактивацию:

а) Ретроингибирование – ингибирование по типу отрицательной обратной связи.

(-)

Конечный продукт Z обычно не влияет на активность промежуточных ферментов системы, а ингибирует ее первый фермент Е1. Этим

обеспечивается целенаправленность регуляции, т.к. цель системы состоит в образовании именно конечного продукта, а не промежуточных соединений.

б) Форактивация – активация предшественником. Накопление субстрата А стимулирует его распад до продукта Z через активацию фермента более поздних стадий превращения.

4. Медицинская энзимология

Включает энзимодиагностику, энзимопатологию, энзимотерапию. Энзимодиагностика – исследование ферментов в биологических средах организма с диагностической целью. Условно выделяют 4 груп-

пы ферментов:

1.Ферменты, широко представленные в различных органах и тканях. Это ферменты основных метаболических процессов, без которых жизнь клетки невозможна (обмен белков, жиров, углеводов). При повреждении мембран клеток эти ферменты появляются в крови. Определение повышенного количества этих ферментов в крови не позволяет локализовать патологический процесс.

2.Органоспецифические ферменты преимущественно локализованы в определенных органах. Эти ферменты катализируют обычно ре-

акции, обеспечивающие специфическую функцию данного органа. В

клетках других органов этих ферментов нет или очень мало. Выход органоспецифических ферментов в кровь сигнализирует о поражении определенного органа, т.е. позволяет диагностировать место поражения. Например, АлАТ – появляется в крови преимущественно при поражениях печени, АсАТ – сердца.

3.Изоферменты.

4.Ферменты, локализованные в органеллах клеток (окисли- тельно-восстановительные в митохондриях, кислые гидролазы в лизо-

61