гации и в их передаче другому «белку-помощнику», шаперонину, роль которого Ã обеспечить оптимальные условия для эффективного сворачивания.
В клетках эукариот шапероны выполняют также важную роль в транспорте белков через мембраны митохондрий, хлоропластов и эндоплазматического ретикулума. Такой транспорт необходим, так как многие белки клеточных органелл синтезируются в цитоплазме, а окончательно сворачиваются в месте своей постоянной локализации. Роль hsp70, «подносящего» к мембране частично развернутый белок, становится понятной, если учесть, что разворачивание – обязательное условие проникновения белковой молекулы через мембрану. Интересно, что митохондриальный матрикс содержит собственные шапероны, «подхватывающие» пересекающий мембрану белок и способствующие его «втягиванию» в митохондрию. Аналогичный механизм реализуется и при проникновении синтезированных в цитоплазме белков в просвет эндоплазматического ретикулума. Описанные функции шаперонов hsp70 иллюстрируются следующей схемой.
Участие шаперонов и шаперонинов в сворачивании белка в клетке эукариот.
1- Сходящая с рибосомы полипептидная цепь, связанная с шаперонами hsp70
32
цитоплазмы; 2- шапероны hsp70 экранируют гидрофобные области полипептида, предотвращая его агрегацию; 3- белки, сворачивающиеся в цитоплазме, передаются с шаперона hsp70 на цитоплазматический шаперонин, где и происходит сворачивание; 4- белки, сворачивающиеся в митохондрии. Цитоплазматический шаперон hsp70 «подносит» развернутый белок к внешней мембране митохондрии. Митохондриальный шаперон hsp70, прочно связываясь с
пересекающим мембрану белком, способствует его втягиванию внутрь митохондрии, а затем передают его на митохондриальный шаперонин, где и происходит сворачивание; 5- белки, сворачивающиеся в эндоплазматическом ретикулуме. Цитоплазматический шаперон hsp70, с одной стороны, и шаперон hsp70 просвета эндоплазматического ретикулума, с другой, обеспечивают
проникновение развернутого белка через мембрану. Детали сворачивания таких белков пока не выяснены
Н.К. Наградова, 1996 г.
Возникает вопрос: от чего же зависит прочность связывания шаперона с полипептидной цепью? Каков механизм, позволяющий развернутому белку освободиться от hsp70 и перейти на шаперонин (hsp60)? Детальные исследования, проведенные на системах белков, выделенных из клеток бактерий, показали, что главным фактором является способность шаперона связывать АТФ, в определенных условиях осуществлять его гидролиз и изменять прочность взаимодействия с полипептидной цепью в зависимости от природы связанного нуклеотида (АТФ или АДФ).
Шаперонины, обеспечивающие эффективное сворачивание белков
В отличие от довольно просто построенных шаперонов (состоящих из одной–двух полипептидных цепей – субъединиц), шаперонины представляют собой сложные олигомерные структуры. Наиболее изученные hsp60 митохондрий, а также клеток E. coli, построены из 14
субъединиц, организованных в два семичленных кольца, лежащих одно под другим. В центре построенного таким образом цилиндра имеется полость – канал (диаметром 45 ангстрем), в котором и происходит сворачивание полипептидной цепи, перешедшей на шаперонин с шаперона hsp70. На рисунке также показана структура hsp10, маленького белка, также образующего олигомерную структуру – кольцо из семи субъединиц, способное, как «шапочка», прикрывать вход в канал молекулы шаперонина после того, как туда попадает полипептидная цепь.
Создав шаперонины, природа нашла элегантный способ обеспечить сворачивание белка в условиях, исключающих его агрегацию с другими белками внутри клетки. Действительно, попадая в центральный канал молекулы шаперонина, единичная полипептидная цепь ока-
33
зывается полностью изолированной и получает возможность реализовывать медленные стадии сворачивания с очень высоким выходом нативного белка. Как и в случае hsp70, связывание развернутого белка с шаперонином и его отщепление регулируются АТФ-азной активно-
стью шаперонина. В связывании сворачивающегося белка (находящегося в состоянии «расплавленной глобулы») может принимать участие каждая из 14 субъединиц олигомерной молекулы шаперонина. Количество мест связывания зависит от стадии сворачивания: чем ближе структура к нативной, тем меньше участков, «распознаваемых» шаперонином. Роль маленького шаперонина hsp10, называемого ко-
шаперонином, закрывающего вход в центральный канал, состоит в том, чтобы предотвращать «преждевременный» выход во внешнюю среду белка, не завершившего окончательное сворачивание в нативную структуру.
Структура шаперонина hsp60 и его кофактора Ã hsp10.
Показано проникновение полипептидной цепи в центральный канал молекулы hsp60,
сопровождающееся присоединением hsp10 и закрыванием входа в канал
Н.К. Наградова, 1996 г.
На рисунке ниже показан принцип функционирования такой системы. Данная модель дает лишь самое общее представление о механизмах функционирования шаперонинов. Она основана на изучении этих белков, изолированных из митохондрий или бактериальных клеток. Между тем, недавно было выяснено, что цитоплазматический шаперонин клеток эукариот весьма существенно отличается по своим свойствам: он построен из неодинаковых субъединиц и, по-видимому, не взаимодействует с ко-шаперонином. Вероятно, что общие принци-
пы функционирования, установленные для hsp60, распространяются и на этот шаперонин, однако конкретные механизмы, вовлеченные в регуляцию эффективности сворачивания белков в разных компартментах клетки, могут существенно различаться.
34
Модель сворачивания белка с участием шаперонинов.
Овальная фигура обозначает структурное состояние шаперонина hsp60 с
сильным сродством к развернутому белку, прямоугольная фигура – состояние, в котором шаперонин такой белок не связывает. Вверху показан hsp10, который диссоциирует по окончании сворачивания. 1- Белок в состоянии «расплавленной
глобулы» связан с гидрофобными участками «стенок» центрального канала молекулы шаперонина. Это взаимодействие стимулирует присоединение АТФ, в результате которого структура шаперонина меняется (гидрофобные участки «стенок» экранируются), и белок освобождается, переходя в центральный канал
(2). Спонтанное сворачивание белка продолжается до тех пор, пока не произойдет гидролиз АТФ и переход шаперонина в состояние, способное связывать частично развернутый белок (3). Стадии 1, 3 и 5 различаются количеством «развернутых» участков структуры белка, взаимодействующих со «стенками» центрального канала. Стадия 7: нативный белок, не способный связываться с шаперонином, выходит наружу
Н.К. Наградова, 1996 г.
Успехи, достигнутые в понимании общих принципов организации полипептидной цепи в уникальную пространственную структуру, а также внутриклеточных механизмов контроля за процессом сворачивания белка, привели к формированию особой области исследований, объединяющей усилия биохимиков, молекулярных биологов и клеточных биологов. Главными проблемами, которые предстоит решить, остаются расшифровка второй половины генетического кода (понимание структурных основ, определяющих путь сворачивания полипептидной цепи), с одной стороны, и выяснение молекулярных механизмов регуляции скорости и эффективности этого процесса, – с другой. Накопленная к настоящему времени информация позволяет заключить, что определяющую роль в такой регуляции играют белок-белковые взаимодействия. Они реализуются, во-первых, между выставленными на
поверхность участками полипептидной цепи и специальными белками, имеющими две функции: 1) предотвращать неспецифическую агрегацию вновь синтезируемых белков и 2) обеспечивать транспорт этих белков в те внутриклеточные компартменты, где они постоянно локализуются и функционируют. Такая, образно выражаясь, диспетчерская роль шаперонов дополняется их участием в проникновении белков через мембраны. Способность шаперонов (и шаперонинов) распознавать ненативные участки структуры белков лежит также в основе механизма, обеспечивающего чрезвычайно высокую эффективность сворачивания.
35
Второй уровень белок-белковых взаимодействий, вовлеченных в
регуляцию сворачивания белка in vivo – это взаимодействия между субъединицами в сложных молекулах шаперонинов, обеспечивающие согласованное изменение их конформации в каждом цикле сворачивания. Эта очень интересная область остается пока почти не разработанной.
Не подлежит сомнению, что важнейшую роль в регуляции сворачивания белков in vivo играют белок-белковые взаимодействия третьего уровня, возникающие между отдельными белками-шаперонами.
Скорее всего, клетка располагает высоко организованными ансамблями белков, действующих согласованно. В состав таких ансамблей, вероятно, образующихся в цитозоле эукариотической клетки, входят, помимо hsp70, шапероны других типов (например, hsp90 и связанные с ним низкомолекулярные шапероны, не требующие АТФ для своего функционирования), ферменты, ускоряющие процесс сворачивания, а также ряд других белков, роль которых пока остается неясной. Расшифровка молекулярных механизмов функционирования таких «машин сворачивания» – одна из актуальных проблем современной науки.
Функции шаперонов сводятся не только к участию в формировании нативной структуры. Белок hsp90 играет крайне важную роль в об-
разовании комплекса стероидных гормонов с их рецептором. Вместе с hsp70 и другими белками hsp90 контролирует функциональную актив-
ность рецепторов стероидных гормонов, направляя их «поведение» в клетке. Установлено, что hsp90 образует комплексы с некоторыми про-
теинкиназами, контролируя их активность. В свою очередь, протеинкиназы фосфорилируют самые различные клеточные белки и благодаря этому регулируют их активность. Нsp90 обнаружен в клетках растений,
однако сведений о его функции у растений пока нет.
К шаперонам относится также убиквитин – белок, присоединение которого к N-концу полипептида делает этот полипептид мишенью
для разрушения протеазами. Это «метка смерти» для белков, и при ее помощи происходит выбраковка поврежденных, недостроенных и функционально неактивных полипептидов. Ассоциированный с убиквитином белок разрушается в особых мультикомпонентных комплексах, называемых протеосомами. Тепловой шок приводит к появлению в клетках недостроенных и поврежденных белков, для удаления которых важен убиквитин. Вместе с тем появление поврежденных и недостроенных белков в клетках является сигналом к синтезу шаперонов даже при нормальной температуре.
36
Лекция 2
СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА
Способность белков к специфическим взаимодействиям
Одним из важнейших свойств белков, лежащих в основе их биологических функций, является способность к специфическим взаимодействиям. Такое взаимодействие оказывается возможным, если у белковой молекулы и вещества, с которым она взаимодействует, имеются на поверхности функциональные группы, способные образовать связи между собой. Это могут быть ионные, водородные связи, силы гидрофобного взаимодействия. Такие поверхности, имеющие функциональные группы, которые соответствуют друг другу, называются комплементарными. Если на поверхности белковой молекулы имеется гидрофобная группа, то на другой молекуле также должна быть гидрофобная группа, если имеется группа с положительным зарядом –NH3+, то на
второй поверхности должен быть отрицательный заряд –СОО–. Специфичность взаимодействия молекул определяется способностью образовать между участками поверхностей молекул максимально возможное число связей.
При этом важной особенностью белков является также их способность изменять свою конформацию (т.е. пространственную конфигурацию), подгоняя ее к поверхности лиганда. Примером такой подгонки является формирование активного центра фермента при его взаимодействии с субстратом (по Кошланду). Присоединение лигандов к белковым молекулам происходит по большому числу центров связывания.
Специфичность взаимодействия белков лежит в основе действия ферментов при их соединении с субстратами, в основе реакций анти- ген-антитело, а также взаимодействия гормонов с рецепторами, ко-
торые являются белками, в основе образования сложных белков: нук- лео-, липо-, гликопротеинов и др.
Самосборка белков и надмолекулярных структур
Это же специфическое взаимодействие лежит в основе процесса самосборки олигомерных белков (т.е. белков, имеющих в своем составе несколько полипептидных цепей) и надмолекулярных структур.
Соединение протомеров или субъединиц в олигомерную молекулу (мультимер) происходит за счет взаимодействия определенных контактных участков, между которыми образуются десятки связей.
Процесс самосборки отличается высокой специфичностью. Про-
37
томеры белка «узнают» друг друга и соединяются только между собой комплементарными поверхностями, и ошибочное соединение практически невозможно.
Примером олигомерного белка является молекула гемоглобина, состоящая из 4-х субъединиц (4 полипептидных цепей двух типов
ααββ). Одноименные субъединицы, в основном, связаны между собой ионными связями, а разноименные – в основном, гидрофобным взаимодействием. При обработке раствором мочевины молекула гемоглобина распадается на четыре неактивных протомера, а после удаления мочевины они вновь соединяются, образуя нативную молекулу гемоглобина.
Примерами самосборки является образование молекулы вируса табачной мозаики, клеточных структур – мембран, микротрубочек и т.д.
Количественное определение белков
Все методы количественного определения белков делят на две группы.
Первая группа основана на физико-химических свойствах:
Биуретовый (определяют интенсивность окраски комплексного соединения белка с ионами двухвалентной меди фиолетового цвета, образующегося в щелочной среде).
Основанные на оптических свойствах белков.
Нефелометрический – по степени мутности раствора белка.
Рефрактометрический – основан на способности раствора белка преломлять проходящий луч света, а степень рефракции зависит от количества, размеров и физического состояния растворенных частиц.
Спектрофотометрический – основан на способности остатков ароматических аминокислот (радикалов) поглощать в ультрафиолетовой части спектра при λ=280 нм.
Все эти методы позволяют определить суммарное количество белков в исследуемом материале.
Для количественного определения индивидуальных белков исполь-
зуется вторая группа методов на основе их биологических свойств (специфичности взаимодействия): это иммунорадиометрический и иммуноферментный.
Радиоиммунологический анализ основан на способности белков к специфическим взаимодействиям. Он широко используется для диагностики опухолей, так как некоторые из них образуют характерные антигены, которые можно найти в крови или моче (хорионный гонадотропин, плацентарная щелочная фосфатаза и др.). Этим методом можно определять количество димеров пиримидина в ДНК после облучения ультрафиолетовыми лучами, даже очень малые количества клинически важных веществ (гормонов, антигемофилического фактора, вирусных
38
антигенов), фармакологических агентов (морфина, опийных алкалои-
дов, сердечных гликозидов, барбитуратов и др.).
Иммунорадиометрический метод используется для количест-
венного определения индивидуального белка X в смеси (A+B+X). Для этого «чистым» белком X иммунизируют животное и выделяют из сыворотки крови образующиеся на него антитела. Их метят 125J. К иссле-
дуемой смеси белков добавляют меченые антитела в избытке. Идет реакция антиген-антитело. Образующийся комплекс выделяют, подсчиты-
вают радиоактивность и определяют количество метки. По количеству метки определяют количество антитела и соответственно количество белка X. Этот метод отличается большой чувствительностью.
Иммуноферментный анализ используется для определения ксенобиотиков, природных лекарственных веществ, индивидуальных белков. Метод заключается в том, что фермент, связанный с антигеном или антителом, выступает в качестве индикатора высокоспецифической реакции антиген - антитело. Например, для определения количества инсу-
лина в исследуемой жидкости вначале иммунизируют животное и получают к инсулину антитела. Их связывают с нерастворимым носителем. К инсулину (как антигену) «пришивают» фермент. В исследуемую жидкость, содержащую инсулин, количество которого нужно определить, вносят точное количество инсулина, связанного с ферментом. Эту жидкость пропускают через носитель с антителами. Оба инсулина конкурируют за места связывания с иммобилизованными антителами. По ферментной реакции определяют количество инсулина, «сшитого» с ферментом и связавшегося с антителами или оставшегося в растворе, рассчитывают количество свободного инсулина в анализируемой жидкости.
Методы выделения белков из тканей и получение индивидуальных белков
Выделение и очистка белков – одна из самых сложных проблем белковой химии, так как в биологических объектах обычно присутст-
вуют смеси большого количества белков часто с близкими характеристиками их физико-химических свойств. Трудности выделения и очист-
ки белков обусловлены также неустойчивостью белков, их высокой чувствительностью к повышению температуры, к действию химических реагентов, что может вызвать денатурацию. Поэтому весь процесс выделения проводят при возможно низких температурах.
Выделение белков включает следующие этапы:
1.Разрушение ткани и гомогенизация:
В ступке на холоду.
С помощью гомогенизаторов: с вращающимися ножами, пестико-
39
вых с притертыми поверхностями (стеклянные, тефлоновые пестики), где измельчение происходит между двумя поверхностями. Последние позволяют выделять неповрежденные отдельные структуры клеток - ядра, митохондрии.
Путем попеременного замораживания и оттаивания.
Ультразвуком (но необходимо подбирать режим: частоту колебаний, мощность источника).
Шаровыми или валковыми мельницами.
2.Экстракция белков:
Проводится водой, растворами нейтральных солей (NaCl, KCl –
10%), буферными растворами (фосфатным, цитратным, боратным, ве- ронал-мединаловым, трис – триоксиметил-аминометан и его соли с НCl). При этом учитывается ионная сила растворов, подбираются значения рН, t0, продолжительность извлечения.
Извлечение белков также проводят органическими растворителями: глицерином, растворами сахарозы, спирта различной концентрации.
Выбор экстрагента проводится с расчетом наиболее полного извлечения.
3.Осветление раствора: путем фильтрования или центрифугирования.
4.Разделение экстрагированных белков основано на различиях в рас-
творимости белков, в размерах, массе и др.
Высаливание – метод, основанный на различиях в растворимости. Высаливание – это выделение белков из раствора путем прибавления нейтральных солей щелочных или щелочноземельных металлов. Ме-
тод основан на разрушении солями (обладающими водоотнимающими свойствами) гидратной оболочки – фактора устойчивости белковых молекул в растворе. Белки, осажденные этим способом, могут вновь легко растворяться в воде.
Классический пример разделения белков методом высаливания –
осаждение альбуминов и глобулинов сульфатом аммония. Глобулины осаждаются полунасыщенным, а альбумины – насыщенным раствором соли. Но это метод группового разделения, так как осаждаются белки с близкими физико-химическими характеристиками.
Более тонкое разделение получают растворами спирта разной концентрации.
На различиях в молекулярной массе основан метод ультрацен-
трифугирования. В ультрацентрифуге (сконструирована в 1925 году Т. Сведбергом) скорость вращения ротора составляет от 75000 до 150000 об/мин. Центробежная сила превышает силу земного притяжения в 500000 раз, и создается такое центробежное ускорение, которое необходимо для осаждения небольших белковых молекул. Белки с разной массой движутся ко дну пробирки с разной скоростью, при этом между слоем жидкости, содержащей белок, и слоем, освободившимся от
40
белка, изменяется константа преломления света, и появляется граница
раздела фаз. По их числу судят о количестве фракций или об однородности белка.
К этой группе методов относится и гель-фильтрация, использую-
щая полимеры сефадексы, построенные из нитевидных молекул полисахарида декстрана, сшитых через определенные промежутки поперечными связями и свернутых в виде гранул. Образуется молекулярное сито с контролируемым размером отверстий.
Выпускаются марки сефадексов:
G – 200 (пропускают белки с М.м. 200000 Да и <). G – 100 (–//– 100000 Да и <).
G – 75 (–//– 50000 Да и <).
G – 50 (–//– 10000 Да и <).
G – 25 (–//– 4000 Да и <).
Гелем сефадекса заполняют колонку и в нее вводят смесь белков. Сверху постоянно подают ток растворителя. Молекулы, размер которых меньше отверстий, легко диффундируют в гранулы. Под влиянием тока жидкости молекулы выходят из гранул и заходят в следующие. Поэтому молекулы движутся медленнее тока жидкости. Молекулы больших размеров не могут пройти в гранулы, обтекают их и проходят через колонку без задержки. Собирая вытекающую жидкость малыми порциями, можно разделить белки на фракции. Это очень эффективный метод фракционирования веществ.
Белки Ã заряженные вещества. В зависимости от величины заряда и молекулярной массы они имеют разную скорость передвижения в электрическом поле. На этом основан метод электрофореза. Он проводится в буферном растворе с определенным значением рН (веронал-
мединаловый – рН=8,6). Возможен бумажный электрофорез и в геле:
полиакриламидном, крахмальном. Разделение в гелях более тонкое, так как они играют роль молекулярного сита, а не только опорной среды, т.е. здесь имеют значение величина заряда и величина частиц.
Эффективными методами разделения и идентификации химических соединений, в том числе и белков, являются хроматографические
методы. Метод хроматографии был разработан в 1906 году русским ботаником М.С. Цветом, который разделял растительные пигменты. В настоящее время используются четыре основных вида хроматографии:
1)Адсорбционная.
2)Распределительная.
3)Ионообменная.
4)Аффинная
Разработаны различные приемы их применения в зависимости от решаемых задач: от идентификации каких-либо веществ до получения
даже больших количеств чистого вещества. Хроматографическое разде-
41