2 курс / Биохимия / БИОХИМИЯ

На этой стадии окисление полиненасыщенных жирных кислот может завершаться перегруппировкой разделенных метиленовой груп-

Н

пой двойных связей в сопряженную диеновую и даже триеновую структуру. Образуются так называемые коньюгированные диены и триены,

определение которых иногда проводят для оценки интенсивности перекисного окисления липидов.

II стадия – развитие цепных реакций. Образовавшийся липидный радикал (R), быстро реагирует с молекулярным кислородом.

R· + О2 R Ã ОО·R Ã ОО· + RH R Ã OOH + R· и т.д.

Как видно, перекисный радикал R-ОО вступает во взаимодейст-

вие с новой молекулой ненасыщенной жирной кислоты (RH); при этом образуется липидная гидроперекись R-OOH и вновь появляется свобод-

ный липидный радикал R . Это придает всему процессу пероксидации цепной характер. Схематически эта стадия пероксидации представляется в следующем виде:

Часть липидных гидроперекисей подвергается распаду, давая образование различных альдегидов, в том числе и малонового. Определение последнего часто используют для оценки пероксидации в целом.

Другая часть гидроперекисей образует свободные радикалы:

132

R ООН R Ã О· + HО·

R Ã ООН + Fe2+ R Ã O· + HO- + Fe3+

Последние вступают во взаимодействие с новыми порциями жирных кислот, придавая цепной реакции лавинообразный характер. Счита-

ется, что именно гидроперекиси жирных кислот (RÃOOH) являются главным пусковым механизмом пероксидации. Развитию процесса способствует наличие ионов двухвалентного железа и других переходных металлов, например, меди.

Добавление этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), связывающей ионы этих металлов, активно задерживает пероксидацию in vitro.

III стадия – завершение (образование продуктов, не содержащих свободных липидных радикалов).

Часть свободных радикалов рекомбинирует друг с другом, образуя неактивные продукты:

R· + R· R Ã R

R Ã ОО· + R· R Ã OO Ã R

На этой стадии, собственно, и завершается пероксидация жирных кислот. Очень сходно подвергаются пероксидации ненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав фосфолипидов и эфиров холестерина.

R Ã ОО· + R Ã ОО· R Ã OO Ã R + О2

Наиболее устойчивы к пероксидации сфингомиелины, харак-

теризующиеся наименьшей ненасыщенностью входящих в них жирных кислот (нервная ткань, мозг!). По сообщениям Е. М. Крепса (1981), в мозговой ткани мамонтов, пролежавших свыше 40000 лет в условиях

133

вечной мерзлоты в Сибири, сфингомиелины полностью сохранились, тогда как глицерофосфолипиды разрушились, вероятно, в результате окислительной деградации.

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) в организме происходит не только спонтанно, но и в результате ряда ферментных реакций. Примером может служить окисление полиненасыщенных жирных кислот, протекающее в тромбоцитах и лейкоцитах при действии микросомных липоксигеназ. Если жирная кислота содержит не менее трех двойных связей, то при ее окислении липоксигеназами одним из конечных продуктов является малоновый диальдегид (МДА) (например, при превращении арахидоновой кислоты в простагландины в тромбоцитах).

4. Активные формы кислорода (АФК)

Основное количество потребляемого О2 (95-98%) расходуется на

выработку энергии и окислительный катаболизм субстратов. Относительно небольшая часть (2-5%) переходит в активные формы кислорода

(АФК) и затем частично используется для окислительной модификации (ОМ) макромолекул.

Термин “АФК” шире, чем “свободные радикалы кислорода” (О2-·, НО·), так как кроме последних включает также молекулы Н2О2 , синглетный кислород 1О2, озон О3 и гипохлорит HOCl.

АФК генерируются во всех частях клетки. Наибольший вклад вносит дыхательная цепь митохондрий, особенно при низкой кон-

центрации АДФ. Важна роль и системы цитохрома Р450, локализован-

ной в эндоплазматической сети. Участвуют ядерная мембрана и другие части клетки, при этом АФК часто возникают не только спонтанно, но и ферментативно (НАДФН-оксидаза дыхательного взрыва в плазматиче-

ской мембране и ксантиноксидаза в гиалоплазме). АФК вызывают обра-

зование органических гидропероксидов ROOH – ДНК, белков, липи-

дов, а также малых молекул. ROOH образуются и в реакции с обычным молекулярным О2 при участии ферментов диоксигеназ или циклоок-

сигеназ:

RH + O2 → ROOH

ROOH по своей структуре подобны Н2О2 (R–O–O–H и Н–О–О–Н)

и химически тоже активны, при последующем метаболизме они переходят в спирты, альдегиды, эпоксиды и другие окисленные соединения. Образование гидропероксидов называют перекисным окислением (пероксидацией), а совокупность изменений, происходящих в молекулах под действием АФК, называют окислительной модификацией молекул (ОМ).

134

На протяжении многих лет перекисное окисление липидов (ПОЛ) считали преимущественно спонтанным (неферментативным) и неспецифическим самоускоряющимся процессом и ему придавали ведущее значение в ОМ и ее последствиях. Однако затем стало ясно, что: 1) огромное значение имеют и ферментативные реакции, катализируемые липоксигеназами и циклооксигеназами – первыми ферментами путей, приводящих к образованию специфических регуляторов – эйкозаноидов; 2) большое значение имеет ОМ и других макромолекул – ДНК и белков, усиленно изучаемая в 90-е годы.

Биологическое значение

Долгое время основной акцент делали на вредных эффектах АФК и ОМ. Они действительно существуют, но теперь уже нет сомнений, что образование АФК и ОМ приносит и пользу.

Эйкозаноиды – это гормоны, производные С20 – полиненасыщен-

ных жирных кислот типа арахидоновой. Их разделяют на циклические (простаноиды) и линейные (прежде всего лейкотриены). Промежуточными метаболитами являются пероксиды. Простаноиды защищают от повреждений клетки желудка, сердца и других органов. Лейкотриены, как и простаноиды, способствуют развитию воспаления (первично это полезная защитная реакция).

Серьезной проблемой для многоклеточных организмов является борьба с клетками-врагами. Важную роль в этом играют фагоциты (ней-

трофилы и макрофаги), которые захватывают микроорганизмы, а затем убивают их, используя АФК в качестве основного оружия, повреждающего макромолекулы и мембраны путем их ОМ. Макрофаги разрушают поврежденные, старые или иммунологически несовместимые клетки, а также способствуют уничтожению злокачественных клеток и клеток, пораженных вирусами. Остеокласты (специализированные макрофаги) применяют АФК для разрушения кости – обязательного условия ее обновления. Во всех этих случаях клетки-защитники быстро поглощают большое количество О2 (дыхательный взрыв) и затем используют

его для образования АФК при помощи расположенной в плазматической мембране НАДФН-оксидазы дыхательного взрыва:

2О2 + НАДФН → 2О2•- + НАДФ+ + Н+

Важное значение АФК для защиты от бактерий доказывается тем, что при инактивирующей мутации этого фермента возникает хронический септический грануломатоз: фагоцитированные микроорганизмы остаются живыми, что приводит к повторным хроническим инфекциям. Н2О2 используется также для окисления галоген-анионов: в нейтрофи-

135

лах Сl– – для образования мощного окислителя гипохлорита HClO, также убивающего бактерии, а в щитовидной железе – J-, что необходимо

для синтеза гормонов иодтиронинов.

В последнее время обнаружены новые функции АФК – регуляторные. АФК стимулируют накопление в клетке вторичных посредников – циклонуклеотидов: цAMФ и цГМФ. АФК вызывают накопление ионов Са2+ в цитозоле и стимуляцию фосфорилирования белков в ре-

зультате активации протеинкиназ (особенно протеинкиназы С) и протеинтирозинкиназ и ингибирования протеинфосфатаз; активируют белок Ras, играющий важную роль в передаче сигналов в ядро клетки. Активно исследуется, не могут ли АФК сами прямо выполнять функции вторых посредников гормонов.

АФК и липидные ROOH в низких субтоксических концентрациях индуцируют такие процессы, как экспрессия генов и деление клеток. Н2О2, накапливающаяся при инвазии вирусов и бактерий, приводит к

индукции ряда цитокинов и иммунных рецепторов и в результате к иммунным и воспалительным ответам, а также к индукции белков острой фазы воспаления и адгезии (последние способствуют выходу лейкоцитов в ткани, что важно при воспалении). Очевидно, роль АФК в защите организма шире, чем предполагалось ранее: она включает не только фагоцитоз опасных клеток, но и запуск других воспалительных реакций и иммунных процессов.

Патологические последствия возникают при чрезмерном накоплении АФК, пероксидов и их вторичных продуктов – состоянии, называемом обычно оксидативным стрессом, а факторы и вещества, способст-

вующие этому, называют прооксидантами. Факторы, вызывающие оксидативный стресс, различны, но все они, в конечном счете вызывают ОМ макромолекул. Прежде всего это избыток О2, особенно при гипер-

барической оксигенации (лечении кислородом под повышенным давлением) и реперфузии, то есть возобновления кровотока после его нарушения из-за тромбоза (закупорки сосуда) или сильного спазма, харак-

терных для инфаркта миокарда или инсульта головного мозга; значительная выраженность воспаления с активацией нейтрофилов и макрофагов также неизбежно приводит к накоплению АФК; к другим факторам относят избыток гема, Fe2+ и Cu+ , ионизирующие и ультрафиолето-

вое излучения, курение, витамин Д, большие дозы витамина А и некоторые ксенобиотики.

Оксидативный стресс приводит к повреждению наиболее важных полимеров – нуклеиновых кислот, белков и липидов. Из АФК только НО• вызывает повреждения ДНК (окисление оснований, их модификации, разрывы цепей, повреждения хромосом), при этом сейчас считают, что АФК вызывают больше мутаций, чем другой класс мутагенов – алкилирующие вещества. Мутации могут привести к патологии и гибели

136

клеток или к их злокачественному перерождению (раки, лейкозы и др.), а мутации в ДНК половых клеток – к наследуемым заболеваниям. Высокие концентрации АФК и липидных гидропероксидов ингибируют синтез ДНК и деление клеток и могут активировать апоптоз (программированную смерть клеток), что полезно для организма, так как ценой гибели части клеток предупреждается прогрессирование злокачественных процессов и гибель целого организма.

ОМ белков, вызванная АФК, не только изменяет аминокислотные остатки, но и нарушает третичную структуру и даже вызывает агрегацию и денатурацию белка. В результате снижается или исчезает их многообразная функциональная активность.

ПОЛ прежде всего повреждает клеточные мембраны, кроме того, продукты ПОЛ (малоновый диальдегид и др.) являются мутагенными и цитотоксичными.

Избыток некоторых эйкозаноидов также дает патологические эффекты: тромбоз и гипертонию (тромбоксаны), гиперчувствительность, участие в патогенезе бронхиальной астмы, шока, инфаркта миокарда, язвы желудка (лейкотриены).

Все описанные нарушения могут серьезно или полностью дезорганизовать функционирование клеток и организма в целом, утяжелить или даже вызвать серьезные болезни и привести к смерти и/или наследственной патологии. Оксидативный стресс с накоплением в тканях и биологических жидкостях АФК и вторичных продуктов ОМ макромолекул обнаружен при многих (>60) болезнях и патологических синдро-

мах, часто называемых свободно-радикальной патологией:

Заболевания, в возникновении которых участвуют активные формы кислорода:

Атеросклероз: (коронарные, церебральные, ренальные, кишечные, периферические нарушения кровоснабжения).

Сахарный диабет и диабетическая ангиопатия.

Легочные заболевания: (хронический обструктивный бронхит, бронхиальная астма, эмфизема).

Ревматико-воспалительные и дегенеративные заболевания сус-

тавов.

Катаракта.

Виды рака, возникающие из-за экзогенных факторов.

Старость.

Болезнь Паркинсона.

Различные интоксикации.

В наших клетках ежесекундно образуются АФК, но мы продолжаем жить благодаря существованию системы сдерживания свободнорадикального окисления.

137

Антиокислительная система организма (АОС) – это система защиты организма от токсического действия кислорода.

АОС включает ферментативные и неферментативные компонен-

ты.

Ферментативные: ферменты супероксиддисмутаза, пероксидаза, каталаза.

Супероксиддисмутаза – высокоактивный фермент, присутствующий во всех клетках, она инактивирует супероксидные радикалы.

О2 + О2 +2Н+ Н2О2 + О2

Образующаяся токсичная перекись обезвреживается в дальнейшем ферментами каталазой или пероксидазой.

Пероксидаза – сложный фермент, содержащий геминовое железо. Распространена в основном у растений, а так же в лейкоцитах, тромбоцитах. Для ее действия необходим дополнительный субстрат – донор водорода. В качестве такого дополнительного субстрата служат аскорбиновая кислота, хиноны, глутатион. Рассмотрим механизм действия глутатион-пероксидазы, присутствующей в эритроцитах. Глутатион-

пероксидаза в качестве простетической группы содержит селен, донором водорода для обезвреживания Н2О2 служит глутатион. Глутатион – это трипептид, содержащий цистеин, т.е. SН-группы:

Глутатионпероксидаза катализирует реакцию:

Н2О2 + 2НS-глутатион 2 Н2О + SÃГ

SÃГ

Каталаза: 2Н2О2 2Н2О + О2 Каталаза – гемсодержащий фермент, находится в крови, костном

мозге, слизистых оболочках, печени, почках. Для обезвреживания Н2О2

не нужен дополнительный субстрат – донор водорода. В качестве донора водорода служит сам Н2О2, т.е. одна молекула Н2О2 – донор водоро-

да, а вторая – разрушается.

Неферментативная система защиты

1)Витамин Е – содержится в липидной фазе мембраны. Это жирорастворимый витамин. Он способен отдавать свой водород на перекисный радикал жирной кислоты, прерывая тем самым цепную реакцию перекисного окисления липидов (ПОЛ).

2)Водорастворимые соединения – аскорбиновая кислота, ураты.

3)Биорегуляторы – тироксин, стероидные гормоны.

4)Соединения с SН-группой – глутатион, цистеин.

5)Комплексоны – связывающие Fе.

138

Все антиоксиданты по механизму действия можно разделить на 2 группы:

1.Действуют на стадии инициации ПОЛ (превентивные) – каталаза, пероксидаза, комплексоны.

2.Прерывают цепные реакции ПОЛ – супероксиддисмутаза, витамины С, Е, ураты.

Лекция 10

ОБЩИЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА

В результате специфических путей катаболизма углеводов, липидов и аминокислот происходит сокращение числа превращающихся субстратов, и образуются только два общих промежуточных продукта – пировиноградная кислота и ацетил-КоА. Они вступают в общий путь

катаболизма, который является единым продолжением специфических путей.

К общему пути катаболизма относят два процесса:

1.Окислительное декарбоксилирование пирувата.

2.Окисление ацетил-КоА в цикле трикарбоновых кислот.

Пируват является продуктом превращения углеводов (глюкозы),

глицерина, гликогенных аминокислот. Ацетил-КоА образуется в мито-

хондриях при:

1.Окислительном декарбоксилировании пирувата.

2.-окислении высших жирных кислот.

3.Превращении кетогенных аминокислот.

Таким образом, в общий путь катаболизма могут вступать продукты специфических путей на уровне пирувата, ацетил-КоА и метабо-

литов цикла трикарбоновых кислот.

Окислительное декарбоксилирование пирувата

Образовавшаяся в цитоплазме пировиноградная кислота поступает в митохондрии, где подвергается окислительному декарбоксилированию при участии полиферментного пируватдегидрогеназного комплекса. Процесс протекает в матриксе митохондрий.

Комплекс включает три фермента и пять кофакторов:

139

1)Пируватдегидрогеназа с коферментом тиаминпирофосфат.

2)Дигидролипоилтрансацетилаза с коферментами амидом липоевой кислоты и коферментом А.

3)Дигидролипоилдегидрогеназа, имеющая кофакторы ФАД и

НАД.

Все ферменты имеют субъединичное строение. Субъединицы дигидролипоилтрансацетилазы составляют ядро комплекса, вокруг которого расположены субъединицы пируватдегидрогеназы и дигидролипоилдегидрогеназы.

OOH OH PO

OH

Благодаря объединению ферментов с кофакторами в комплекс промежуточные продукты быстро взаимодействуют с ними.

Пировиноградная кислота представляет молекулу, в которой электронная плотность оттягивается на кислород, в связи с чем он приобретает частично отрицательный заряд, а углерод – частично положительный. Пируват взаимодействует с тиаминпирофосфатом (ТПФ) пируват-

140

дегидрогеназы, у которого атом азота положительно заряжен и оттягивает электронную плотность. Вследствие поляризации связи у второго углеродного атома водород становится подвижным, а на атоме углерода остается электронная пара, т.е. он представляет карбанион, который атакует положительно заряженный углеродный атом пирувата. Образуется карбоксиэтилтиаминпирофосфат, который легко декарбоксилируется и превращается в оксиэтилтиаминпирофосфат.

оксиэтил-ТПФ

Образовавшийся оксиэтил-ТПФ взаимодействует с липоевой ки-

слотой – коферментом дигидролипоилтрансацетилазы.

R1 N+ C CH3 CH3

HCS C R2 + C~OS ЛК

HS ацетил-S-липоат

Происходит окисление оксиэтильной группы в ацетильную с переносом ее на липоевую кислоту, а тиаминпирофосфат выделяется. Дигидролипоилтрансацетилаза переносит ацетильный радикал на HS–КоА,

а липоевая кислота восстанавливается.

141