2 курс / Биохимия / БИОХИМИЯ

диационная биохимия.

Исследования по нейрохимии, проводившиеся в институте физиологии (с 1953 г.), отделе регуляции обмена веществ (1970) Академии Наук БССР, медицинских институтах и Белорусском государственном университете, были посвящены проблемам функциональной биохимии центральной нервной системы (ЦНС) и синапсов; нейрохимическим основам поведения, патологической химии ЦНС; влиянию фармакологических средств и экстремальных факторов на нервную систему и др. (А.И. Булыгин, А.С. Дмитриев и др.).

В области радиационной биохимии белорусскими учеными определена роль гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы в меха-

низмах действия малых доз ионизирующей радиации и зависимость углеводного, энергетического и нуклеинового обмена в ЦНС от обеспеченности организма глюкокортикоидами (Л.С. Черкасова, А.Т. Пикулев, М.Ю. Тайц, К.В. Фомиченко и др.).

Исследована реактивность липидтранспортной системы крови при действии разных доз радиации (каф. биохимии ВГМУ).

Белорусскими биохимиками особое внимание уделялось изучению биологических функции витамина В1. Инициатором этих исследо-

ваний явился заведующий кафедрой биохимии Гродненского медицинского института в 1957-1967 годах Ю.М. Островский (1925-1991), ко-

торый в 1962 г. в Гродненском мединституте создал проблемную витаминологическую лабораторию, в 1970 г. на её базе организовал отдел регуляции обмена веществ, ныне – институт биохимии – один из главных центров по витаминологии в Беларуси. Белорусские ученые занимаются исследованиями гиповитаминозов, межвитаминных взаимоотношений, проблем витаминотерапии (Б.М. Барановский, В.М. Борец, Н.К. Лукашик, Н.З. Яговдик, Т.Я. Морозкина, В.В. Виноградов). Создана межведомственная программа по диагностике и предупреждению болезней витаминной недостаточности (А.Г. Мойсеенок, К.М. Белявский).

СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

1. История изучения белков

Белки составляют основной материал клеток. В тканях млекопитающих на их долю приходится 10-20%, а на долю углеводов и липи-

дов всего от 1 до 5%. Другое название белков – протеины, произошло от греческого слова «протос» – первичный.

В начале 19 века голландский химик Мульдер установил наличие азота в белках. В 1820 г. Браконно из кислотного гидролизата желатины выделил первую аминокислоту – глицин. В 1871 г. Любавин уста-

12

новил, что при переваривании белков образуются аминокислоты. В 1902 г. Фишер показал, что аминокислоты в белках соединяются пептидной связью. В 20-х годах XX века Сведберг применил ультрацен-

трифугу для определения молекулярной массы белков. В это же время Самнер, Нортроп, Кунитц привели доказательства, что ферменты являются белками. Последовательность аминокислот в белке впервые изучена Сенджером на примере инсулина (1955). Пространственная структура белков впервые изучена на примере гемоглобина и миоглобина Перутцем и Кендрью с помощью рентгеноструктурного анализа.

2. Роль аминокислот в организме

Белки – это биополимеры, построенные из аминокислот (АК). Все аминокислоты по значению делят на 2 группы: протеиногенные (участвуют в построении белка) и непротеиногенные или метаболические. Протеиногенные (20 АК) в свою очередь подразделяются на заменимые (синтезируются в организме человека) и незаменимые (не синтезируются и должны поступать с пищей). Различают 8 абсолютно незаменимых аминокислот: триптофан, валин, треонин, метионин, лизин, фенилаланин, лейцин, изолейцин и 3 полузаменимых – аргинин, гистидин, тирозин.

Метаболические аминокислоты подразделяются на аминокислоты, содержащие -аминогруппу и не содержащие -аминогруппы. Ме-

таболическими их назвали вследствие участия в обмене веществ. Примеры метаболических аминокислот с NH2 группой: орнитин, цитрул-

лин, участвуют в синтезе мочевины.

Метаболические аминокислоты без NH2 группы:

-аланин – входит в состав пантотеновой кислоты, кофермента

А, таурин – образует парные соединения с желчными кислотами. Аминокислоты используются как лекарственные препараты, на-

пример, сублингвальное применение препаратов глицина стимулирует физиологические механизмы адаптации, т.к. вызванное им усиление тормозных нейромедиаторных процессов в ЦНС защищает клетки от избыточного влияния катехоламинов и оказывает, таким образом, стресс-протекторное, дезинтоксикационное действие, что дает основа-

ние назначать глицин после травм головного и спинного мозга, при энцефалопатиях, неврозах и т.д.

3. Классификация аминокислот

Все аминокислоты, входящие в состав белка, являются - аминокислотами, они содержат две функциональные группы – NH2 и COОН

и радикал.

13

NH2 CH COOH

R

Индивидуальные свойства аминокислот определяются строением радикала. По полярности радикалов все протеиногенные аминокислоты делятся на 4 группы:

1.Неполярные (гидрофобные).

2.Полярные (гидрофильные) незаряженные.

3.Отрицательно заряженные (кислые).

4.Положительно заряженные (основные).

4. Классификация белков

Белки являются высокомолекулярными полипептидами. Граница между полипептидами и белками лежит в диапазоне молекулярной массы 6000-12000 дальтон. Простые белки состоят только из амино-

кислот. Белки, содержащие добавочные (простетические) группы, такие как гем, производные витаминов, липиды, углеводы и металлы, называются сложными белками. Название таких белков начинается с названия добавочной группы: гемпротеины, липопротеины, гликопротеины, металлопротеины. Белковая часть сложных белков называется

апопротеин.

Белки классифицируют по растворимости, форме и размерам белковой молекулы, по функциональному признаку. Некоторые белки, представляющие интерес для медицины, классифицируются по методам их разделения и выявления.

Классификация по растворимости – была предложена в 1907-

1908 гг., в настоящее время имеет ограниченное применение. Альбумины – растворимы в водных растворах солей, глобулины

– плохо растворимы в воде, но хорошо растворимы в солевых растворителях.

Протамины – растворимы в 70-80% этаноле, но не растворимы в

воде и абсолютном этаноле. Богаты аргинином. Гистоны – растворимы в солевых растворах.

Склеропротеины – нерастворимы в воде и солевых растворах (богаты глицином, аланином, пролином).

Классификация по форме и размерам:

Глобулярные и фибриллярные белки. При этом учитывается аксиальное отношение, т.е. отношение длины молекулы к ширине. У глобулярных белков аксиальное отношение меньше 10, чаще 3-4 (ин-

сулин, альбумины, глобулины, многие ферменты). У фибриллярных белков аксиальное отношение больше 10 (кератин, миозин, коллаген, фибрин).

14

Классификация по функции: каталитические, сократительные, регуляторные и т.д.

Специальные медицинские классификации по методам вы-

деления. Например, классификация липопротеинов:

а) по подвижности в электрическом поле: -липопротеины, - липопротеины, пре- -липопротеины, хиломикроны.

б) по степени осаждения при ультрацентрифугировании – липопротеины высокой плотности (ЛПВП), липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП).

в) по содержанию апопротеинов – апо В-содержащие и апо А-

содержащие липопротеины.

5. Биологические функции белково-пептидных веществ

Главная функция белков-ферментов – катализ биохимических

реакций, и только ее одной было бы достаточно, чтобы считать белки самым важным классом биорегуляторов. Как биологические катализаторы ферменты участвуют в тысячах превращений, происходящих в живой клетке и составляющих основу ее метаболизма. Особое значение имеют такие универсальные ферментные системы, как ДНК- и РНК-полимеразы, разнообразные аденозинтрифосфатазы (АТФазы),

аденилатциклазы.

Классификация белков по функциям:

1.Ферменты (рибонуклеаза, трипсин, ДНК- и РНК-полимеразы и др.).

2.Защитные белки (иммуноглобулины, комплемент, интерферон

идр.).

3.Двигательные белки (актин, миозин, спектрин и др.).

4.Структурные белки (коллаген, кератин и др.).

5.Запасные белки (казеин, яичный альбумин и др.).

6.Антибиотики (неокарциностатин, актиноксантин и др.).

7.Токсины (ботулинический, дифтерийные токсины и др.).

8.Транспортные белки (гемоглобин, цитохром с, мембранная АТФаза и др.).

9.Регуляторные белки (гистоны, репрессоры, факторы инициа- ции и др.).

10.Рецепторные белки (родопсин, холинорецептор и др.).

11.Гормоны (инсулин, гормон роста, липотропин и др.).

Биологические функции пептидов:

1.Гормоны (окситоцин, вазопрессин и др.).

2.Нейропептиды мозга (энкефалины, эндорфины, скотофобин).

3.Алкалоиды (эрготамин, пандамин и др.).

4.Антибиотики (грамицидины А,В,С,S, актиномицин D и др.).

15

5.Токсины и антитоксины (фаллоидин, антаманид и др.).

6.Регуляторные пептиды (рилизинг-факторы или либерины, кар-

нозин, ансерин и др.).

Недавно открыты нейропептиды мозга – энкефалины, эндорфины, пептиды памяти, сна и т.п. Установлено, что эти пептиды образуются из более сложных белковых предшественников путем процессинга. Быстрый рост числа вновь обнаруживаемых соединений такого типа свидетельствует о важности химических механизмов в регуляции поведения и высшей нервной деятельности.

Наиболее мощные из известных токсинов являются белками микробного происхождения. По уровню токсичности не имеют себе равных ботулинический, столбнячный и дифтерийный токсины и ряд энтеротоксинов.

6. Молекулярная масса белков, методы ее определения

Наиболее важной характеристикой белка является его молекулярная масса, она колеблется в широких пределах.

Молекулярная масса белков

Известны следующие методы определения молекулярной массы:

1.Химический метод требует точного знания количественного содержания одной из аминокислот. Применение ограничено.

2.Электронная микроскопия – позволяет наблюдать отдельные молекулы белка. Навеска белка окрашивается осмиевой кислотой (молекулы черного цвета) и просматривается в электронном микроскопе. Подсчитывают число частиц и делят навеску на их число, т.е. находят массу одной молекулы. Применение ограничено.

3.Метод ультрацентрифугирования. В пробирке ультрацентри-

фуги создается центробежное ускорение, превышающее земное в сотни тысяч раз. По мере перемещения молекул белка от центра к периферии пробирки образуется граница раздела белок – растворитель, которая регистрируется. Регистрация основана на способности растворов белка преломлять луч света, т.е. специальная оптическая система на-

16

правляет луч света на раствор белка и записывается граница раздела в виде пика. По перемещению этой границы можно определить расстояние, пройденное молекулой белка ко дну пробирки. Определяют кон-

станту седиментации (осаждения) белка S, которая зависит от массы и формы белковой молекулы:

V S – константа седиментации, измеряется в Сведбергах S= -------- (по фамилии ученого, ее предложившего). 1 S = 10–13 сек.

2 r V – скорость перемещения границы белок – растворитель,

– угловая скорость ротора, r – расстояние от центра ротора до середины пробирки с раствором белка.

Величина молекулярной массы вычисляется далее по уравнению Сведберга:

– плотность растворителя.

4.Гельфитрация и диск-электрофорез в полиакриламидном геле

получили наибольшее распространение.

Для определения молекулярной массы белка производят калибровку хромотографической колонки. Колонку заполняют набухшими гранулами сефадекса. Сефадекс – это полимерные молекулы полисахарида, сшитые через определенные промежутки поперечными мостиками и свернутые в гранулы. Каждая гранула имеет поры.

На поверхность набухшего сефадекса помещают смесь белков с известной молекулярной массой и сверху льют растворитель. Белки с

током растворителя будут проходить через колонку – элюироваться – и покидать ее с определенным объемом растворителя – элюционным объемом. Белки с большой молекулярной массой выйдут из колонки первыми с наименьшим элюционным объемом, т.к. они не смогут по-

ММх пасть внутрь гранул. Мелкие молекулы белков будут через поры заходить во все гранулы, поэтому они покинут колонку самыми последни-

ми, с наибольшим элюционным объемом. Следовательно, между молекулярной массой и элюционным объемом есть зависимость. Строят ка-

17

либровочный график зависимости Lg молекулярной массы от элюционного объема. Затем через калибровочную колонку пропускают белок с неизвестной массой и измеряют объем элюата (Vэлх). И далее по графику находят М.М.

Аналогичный принцип положен в основу метода определения молекулярной массы при электрофорезе в полиакриламидном геле. Здесь сравнивают электрофоретическую подвижность неизвестного белка с электрофоретической подвижностью стандартных (калибровочных) белков.

7. Физико-химические свойства белков

Белки образуют коллоидные растворы, поскольку размеры частиц находятся в пределах 0,1-0,001 мкм. Для коллоидных растворов

характерны следующие свойства:

1)Низкое осмотическое давление.

2)Высокая вязкость.

3)Незначительная способность к диффузии.

Вклинической биохимии используют три свойства коллоидных растворов белков – 1) способность растворов белка рассеивать луч света – конус Тиндаля, это явление используется для количественного определения белка методом нефелометрии; 2) способность растворов белка преломлять луч света – также для количественного определения белка методом рефрактометрии; 3) молекулы белка не способны проходить через полупроницаемую мембрану, это используется для очистки растворов белка от низкомолекулярных примесей методом диализа.

Белковые молекулы в растворе способны к ионизации за счет аминных и карбоксильных групп радикалов 3 и 4 групп аминокислот, а

также концевых NH2 и COOH групп всех аминокислот. Благодаря на-

личию этих групп белки обладают амфотерными свойствами. В зависимости от аминокислотного состава различают нейтральные белки –

количество NH2 и СООН групп равно, при рН=7 такие белки не имеют

заряда. Но, учитывая более высокую ионизацию СООН– групп чем аминогрупп, такие нейтральные белки имеют слабый отрицательный заряд. И таких белков – большинство.

Если в составе белка преобладают аминокислоты 3 группы, т.е. отрицательно заряженные, то общий заряд белковой молекулы при рН=7 будет отрицательным, это кислые белки. При преобладании в составе белка аминокислот 4-ой группы, т.е. положительно заряженных,

общий заряд белковой молекулы будет положительным – основные белки.

Для клинической биохимии имеет значение возможность снятия

18

заряда с белковой молекулы, т.е. перевода ее в изоэлектрическое со-

стояние (ИЭС). ИЭС Ã это состояние белка, когда он электроней-

трален. Перевести белок в ИЭС можно, изменяя рН среды. То значе-

ние рН, когда заряд белковой молекулы равен нулю, называют изоэлектрической точкой (ИЭТ). Для нейтральных белков ИЭТ ле-

жит в слабокислой среде, рН≤7, т.е. к такому белку нужно добавить немного кислоты (Н+), чтобы нейтрализовать незначительный отрица-

тельный заряд.

Отсюда ИЭТ кислых белков лежит в кислой среде, рН<7, ос-

новных Ã в щелочной, рН>7 – т.к. нужно добавлять ОН– для нейтрализации их положительного заряда.

Вокруг заряженных групп будут собираться диполи воды, формируя гидратную оболочку. Отсюда факторами устойчивости белка в растворе являются 1) наличие заряда и 2) наличие гидратной оболочки. Поэтому, чтобы осадить белок, т.е. перевести его в нерастворенное состояние, нужно воздействовать на эти факторы. Снятие заряда осуществляется путем подведения рН к ИЭТ. Снятие гидратной оболочки осуществляется:

1)Водоотнимающими средствами – соли щелочных металлов в высоких концентрациях (например, сернокислый аммоний), спирт, ацетон.

2)При денатурации белка – т.е. при разрушении всех пространственных структур.

При осаждении белков солями щелочноземельных металлов белки не подвергаются глубоким изменениям и могут быть растворены, если убрать соли (например, диализом). Такой метод осаждения белков называют высаливанием.

Реакции осаждения белков используют в медицине для выделения и обнаружения белка в биологических жидкостях – крови, моче.

8. Уровни структурной организации белков

Выделяют 4 уровня:

1. Первичная структура

Это строго определенная линейная последовательность аминокислот, соединенных между собой пептидными связями. Пеп-

тидная связь прочная, ковалентная, занимает промежуточное положение между одинарной и двойной связью. Разрушить пептидную связь можно гидролизом. Различают кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз. Последовательность аминокислот задается генетическим кодом.

Рассмотрим значение первичной структуры белков на примере

19

гомологичных белков. Это белки, которые у разных видов живот-

ных выполняют одинаковые функции. Например, гемоглобин у всех позвоночных транспортирует кислород. В гомологичных белках во многих положениях полипептидной цепи всегда находятся одни и те же аминокислоты – инвариантные остатки. В других положениях могут быть различия – эти аминокислотные остатки называют вариабельными. Всю совокупность сходных черт в аминокислотных последовательностях гомологичных белков называют гомологией последовательностей. Наличие такой гомологии предполагает, что животные, у которых были выделены гомологичные белки, имеют общее эволюционное происхождение.

Число остатков, по которым различаются белки любых видов, пропорционально филогенетическому различию между данными видами. Например, молекулы цитохрома «с» лошади и дрожжей (эволюционно весьма далеких видов) различаются по 48 аминокислотным остаткам из 100, тогда как аналогичное различие между цитохромом “с” курицы и утки касается только 2-х аминокислот.

Изучение первичной структуры важно и для патологии. Известно генетическое заболевание – серповидно-клеточная анемия, которая обусловлена присутствием в эритроцитах аномального гемоглобина S. В бета-цепи гемоглобина S в шестом положении находится валин, а в

гемоглобине А (нормальном) – глутаминовая кислота. Замена гидрофильной аминокислоты на гидрофобную приводит к уменьшению растворимости гемоглобина. При низком парциальном давлении кислорода такой гемоглобин выпадает в осадок и обуславливает серповидную форму эритроцитов. Они быстро разрушаются в селезенке, и возникает анемия.

Известно, например, что повышенная чувствительность к алкоголю, характерная для многих представителей восточных народов, связана с заменой одной аминокислоты (лизина на глутамат) из 487 расположенных последовательно аминокислот в ферменте альдегиддегидрогеназа, ответственном за удаление из организма уксусного альдегида, который накапливается при окислении этилового спирта.

Следовательно, в отдельных случаях замена одной мономерной единицы в огромной последовательности приводит к серьезным биологическим последствиям. В то же время в некоторых случаях большое число замен не лишает биополимер его главной функции.

Для каждого живого организма характерен свой набор белков с определенными последовательностями аминокислот и соответственно свой набор нуклеиновых кислот с определенными последовательностями нуклеотидов. Этот набор может быть достаточно большим. По грубым оценкам в человеческом организме содержатся многие десятки тысяч разных белков. Это, однако, ничтожная часть от практически

20

неисчерпаемого мыслимого числа белков. Ведь из 20 аминокислот можно построить 20 20=400 разных димеров (т.е. попарно соединенных аминокислот), 20 20 20=203=8000 тримеров, а сравнительно коротких белков длиной всего в 100 аминокислотных остатков – 20100 = 10130, что гораздо больше, чем число атомных ядер во всей доступной наблюдению части Вселенной (последнее оценивается как 1080). Опре-

деленные характерные для данного организма белки не могут возникать случайно. При образовании в живом организме (биосинтезе) белков должна существовать некоторая управляющая система, которая содержит информацию о том, какие именно последовательности аминокислот нужно собирать в данном организме. Первичным материальным носителем такой информации является ДНК.

Итак, первичная структура генетически детерминирована и определяет индивидуальные свойства белков, их видовую специфичность, на ее основе формируются все последующие структуры.

2. Вторичная структура

Это регулярная организация полипептидной цепи, удерживаемая водородными связями между NH и СО группами пептидных связей стержня цепи. Она может быть в виде -спирали и -

структуры. В -спирали водородная связь возникает в пределах одной

цепи между первым и пятым аминокислотными остатками и направлена параллельно оси молекулы. На каждый виток (шаг) спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка, шаг спирали равен 0,54 нм.

В -структуре водородные связи возникают между соседними

цепями (или в одной цепи), перпендикулярно оси молекулы. Особую вторичную структуру имеет коллаген.

Не все полипептиды способны образовывать устойчивую - спираль. Препятствуют образованию -спирали подряд расположен-

ные глутаминовая кислота, аргинин, лизин, аспарагин, серин, треонин, лейцин. Когда в полипептидной цепи встречается пролин, -спираль

нарушается и возникает петля или изгиб, т.к. пролин не способен образовывать внутрицепочечную водородную связь.

Степень -спирализации некоторых белков

21