4 курс / Акушерство и гинекология / M_Капанадзе_Д_Л_Акушерские_и_перинатальные_исходы_у_беременных_с

2.2. Методы исследования

Обследование пациенток проводилось с использованием клинико-

лабораторных и инструментальных (УЗИ, допплерография, КТГ в динамике)

методов. Лабораторные методы включало общий анализ крови,

биохимический анализ крови, общий анализ мочи, исследование параметров системы гемостаза (подробно описаны ниже).

С целью исследования системы гемостаза забор крови производился сухой стерильной иглой из локтевой вены в пластиковую пробирку в соотношении с антикоагулянтом 9:1. В качестве антикоагулянта использовали 3,8% раствор трехзамещенного цитрата натрия. Необходимая обработка и выполнение срочных тестов проводились в течение 2 часов после взятия крови. Для получения богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали при 1000 об./мин в течение 5 минут. Для приготовления безтромбоцитарной плазмы кровь центрифугировали при 3000 об./мин в течение 10 минут.

Исследование системы гемостаза включало:

1. Оценку показателей коагулограммы: активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового индекса (ПИ),

тромбинового времени, уровня фибриногена по Клаусу, уровня АТ III.

2. Определение количества тромбоцитов в периферической крови

(автоматический счетчик «Тrombocounter», Франция). 3. Оценку гемостазиограммы, которая включала:

•Тромбоэластографию: r+k (хронометрический показатель), ma (максимальная амплитуда), ИТП (индекс тромбодинамического потенциала) (тромбоэластограф «Hellige», Германия);

•Определение агрегации тромбоцитов с АДФ и ристомицином по методу Воrn (агрегометр Рауtоn (США));

•Определение уровней D-димера полуколичественным методом

(латекс-тест Dimertest, Agen, Австралия);

• Определение растворимых комплексов мономеров фибрина (РКМФ).

51

4. Определение уровня гомоцистеина в крови (иммуноферментный метод с использованием реактивов Axis® фирмы Axis-ShieldAS, Норвегия на приборе ANТОS 2020, США). Использовались следующие критерии оценки тяжести гипергомоцистеинемии: легкая степень (уровень гомоцистеина 11-30

мкмоль/л), средняя степень (31-100 мкмоль/л) и тяжелая степень (>100

мкмоль/л).

5. Определение глобальной функции протеина С (коагулометрический метод с использованием коммерческих наборов «Парус»-тест фирмы

«Технология-Стандарт», Барнаул, Россия на приборе «START 4», Stago,

Франция).

6. Диагностику антифосфолипидного синдрома, которая включала определение:

• Антифосфолипидных антител (иммуноферментный метод, Stago,

AsserachromAPA);

•Волчаночного антикоагулянта (ВА);

•Кофакторов антифосфолипидных антител: антител к бета-2

гликопротеину I, антител к протромбину, антител к аннексину V.

Определение ВА включало 3 этапа:

1) скрининговые методы; осуществлялись с помощью фосфолипид-

зависимых тестов:

- АЧТВ с низким содержанием фосфолипидов (РТТ - LA; STAGO,

Франция);

-время разведенного яда гадюки Рассела (Stago, Франция; dRVVT);

-протромбиновое время с разведеннымтромбопластином (TTI, STAGO,

Франция).

Если фосфолипид-зависимые тесты были нормальными, то скрининговая проба на выявление ВА считалась отрицательной. Удлинение фосфолипид-зависимых тестов (одного или нескольких) диктовало необходимость проведения коррекционной пробы.

52

2) коррекционная проба; осуществлялась путем смешивания исследуемой плазмы с нормальной плазмой в соотношении 1:1; 1:4 и 4:1

соответственно с целью исключения дефицита факторов.

Если при добавлении нормальной плазмы фосфолипид-зависимые тесты оставались удлиненными, проводились тесты, подтверждающие направленность циркулирующих ингибиторов против фосфолипидов.

3) подтверждающая проба; для этой цели использовались лизаты тромбоцитов (PNP, STAGO, Франция) и гексагональный фосфолипид

(Staclot, Stago, Франция).

Укорочение АЧТВ до нормы свидетельствовало об антифосфолипидной природе циркулирующих ингибиторов.

На четвертом этапе в ряде случаев проводилось дифференцирование других причин нарушения свертываемости крови - дефициты отдельных факторов и другие специфические антикоагулянты.

7. Определение генетических форм тромбофилии, генетических полиморфизмов компонентов системы гемостаза и генетических полиморфизмов провоспалительных цитокинов (метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)).

Определялись: мутация MTHFR C677T, мутация FV Leiden, мутация протромбина G20210A, полиморфизм 675 4G/5G в гене PAI-1, полиморфизм

163G/T в гене А-субъединицы фактора XIII, полиморфизм I/D в гене t-PA,

полиморфизм в гене XII фактора (фактора Хагемана) 46C/T, полиморфизм -

455G/A в гене фибриногена, полиморфизм 807C/T в гене гликопротеина GpIa

тромбоцитов, полиморфизм 1565T/C в гене гликопротеина GpIIIa

тромбоцитов, полиморфизм 434C/T (HPA-2A/2B) в гене гликопротеина

GpIba, полиморфизм 1166 А/C в гене рецептора ангиотензина II 1-го типа

(АТGR1), полиморфизм I/D в гене АПФ, полиморфизм 704T/C в гене ангиотензиногена, полиморфизм -31T/C в гене интерлейкина 1b (ИЛ-1b),

полиморфизм -308G/A в гене фактора некроза опухолей альфа (TNF-альфа),

полиморфизм 5032С/G в гене CD46, полиморфизм -174G/C в гене ИЛ-6.

53

Для установления диагноза тромбофилии использовали критерии,

разработанные международной комиссией на конференции в Израиле

(AirTravelandHealth, Эилат, Израиль, 9-12 ноября 2006 г.) в составе Макацария А.Д., Бицадзе В.О. и Brenner B:

•Наличие антифосфолипидных антител, мутации FV Leiden,

протромбина G20210A, гипергомоцистеинемии, их комбинаций;

•≥3 гомозиготных генетических полиморфизма;

•≥5 гетерозиготных генетических полиморфизма;

Диагноз АФС устанавливался с учетом клинических и лабораторных критериев, представленных ниже:

Клинические критерии:

1.сосудистый тромбоз (один и более эпизодов артериального, венозного тромбозов или тромбоза мелких сосудов в любом органе или ткани);

2.патология беременности

a.одна или более необъяснимые смерти морфологический нормального плода в сроки 10 и более беременности;

b.одна и более преждевременные роды до 34 недель беременности,

протекающей с тяжелым гестозом или тяжелой фетоплацентарной недостаточностью, с рождением морфолагический нормального плода;

c.три и более необъяснимых последовательных прерываний беременности в сроки до 10 недель с исключением

анатомических и гормональных причин, а также хромосомных

аномалий;

Лабораторные критерии:

1.обнаружение ВА в плазме крови в 2 и более случаях с 12 –

недельным промежутком;

54

2.наличие антикардиолипиновых антител в средних или высоких титрах в сыворотке или плазме крови в 2 и более случаях, с

интервалом не менее 12 недель;

3.наличие антител к β2-гликопротеину I в сыворотке или плазме крови в 2 и более случаях, с интервалом не менее 12 недель и антител к

аннексину V и протромбину .

Для установления диагноза АФС достаточно одного лабораторного и одного клинического критерия.

Обследование на генетические формы тромбофилии проводилось однократно. Определение уровней гомоцистеина и АФА выполнялось по показаниям, например, для оценки эффективности лечения, при ухудшении состояния матери и плода, появлении новых симптомов, позволяющих заподозрить развитие осложнений, а также у пациенток с впервые выявленным АФС для подтверждения диагноза.

55

Глава 3. КЛИНИКО-ГЕМОСТАЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ ПАЦИЕНТОК.

3.1. Клиническая характеристика пациенток с синдромом потери плода в анамнезе, генетическими и приобретенными формами тромбофилии

49 женщин с синдромом потери плода в анамнезе и тромбофилией

(генетическими и приобретенными формами) составили I группу исследования.

Самым частым осложнением в акушерском анамнезе у пациенток I

группы был самопроизвольный выкидыш. Его распространенность составила около 38%. У 30% женщин в анамезе была замершая беременность; у 30% –

неразвивающаяся беременность; в 13% случаев встречалась АГП; 11% -

анэмбрионемия; в 10% случаев в анамнезе у наших пациенток имела место преэклампсия и гестоз тяжелой степени; в 5% – преждевременные роды,

столько же составили преэмбрионические потери и интранатальная гибель плода; 1% – ПОНРП. Следует отметить, что плановое кесарево сечение в анамнезе наблюдался только у 1% пациенток, 11% приходилось на долю экстренного кесарева сечения.

56

Потери плода в анамнезе у пациенток с синдромом потери плода были на разных сроках беременности: 69% пациенток имели ранние потери; 18% –

поздние потери, 13% пациенток имели как ранние, так поздние потери.

Формы тромбофилии, которые были выявлены у пациенток этой группы, включали:

-мутацию Лейдена изолированно (12%);

-мутацию Лейдена с полиморфизмами других генов (20%);

-АФС и мультигенные формы тромбофилии (8%);

-- АФС изолированно (3%);

-мутацию протромбина изолированно (8%);

-мутацию протромбина в сочетании с полиморфизмами других генов

(9%);

-гипергомоцистеинемию с мультигенной тромбофилией (3%);

-АФС и гипергомоцистеинемию (2%);

-АФС, гипергомоцистеинемию и мультигенную тромбофилию (9%);

-мультигенную тромбофилию (27%);

57

-мутации провоспалительных цитокинов и полиморфизмы других генов (2%);

-сочетанние мутации Лейдена и мутации протромбина (3%).

Распределение форм тромбофилии у исследуемых пациентов

сочетанная форма лейдена и протромбина полиморфизмы провоспалительных цитокинов

мультигенная тромбофилия гипергомоцистеинемия+мультигенная…

гипергомоцистеинемия+АФС гипергомоцистеинемия+мультигенная тромбофилия

сочетанный с протромбином чистый протромбин

чистый АФС

АФС +МУЛЬТИГЕННАЯ ТРОМБОФИЛИЯ

сочетанный с лейдоном

чистыый лейден

Мы также оценили частоту разных форм тромбофилии у пациенток с синдромом потери плода.

Частота мутации Лейдена у женщин с синдромом потери плода

n=49

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

Из 46 женщин, у которых не было мутации Лейдена, синдром потери плода был у 6, а из 19 женщин с мутацией Лейдена - синдром потери плода был у 10.

58

Частота сочетанной тромбофилии у женщин с синдромом потери плода в анамнезе

n=49

40%

35%

30%

25%

20%

15%

10%

5%

0%

Рисунок. Частота сочетанной тромбофилии (мультигенная тромбофилия +АФС) у женщин с синдромом потери плода в анамнезе.

Связь статистически доставерна (р=0,033).

Из 11 женщин с сочетанной формой тромбофилии (АФС +

мультигенная тромбофилия) синдром потери плода был у всех 11 пациентов.

Частота мультигенной тромбофилии у женщин с синдромом потери плода в анамнезе

n=49

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

-10%

Рисунок 3. Частота мультегенной тромбофилии у женщин с синдромом потери плода в анамнезе.

Связь статистически доставерна (р=0,002).

Из 46 женщин без мультигенной формы тромбофилии синдром потери плода был у 30 женщин. У женщин с мультигенными формами тромбофилии синдром потери плода был у всех 19 пациенток.

59

Анализ гинекологического анамнеза в данной группе пациенток показал следующее: наиболее частой формой патологии явились хронические инфекционные и вирусные заболевания мочеполовой системы

(22,4%); на втором месте оказалась внематочная беременность (10,2%); далее кисты яичников (7%), бесплодие (4,1%), аномалии мочеполовой системы

(4,1%), эрозия шейки матки (4,1%), эндометриоз (2%), СПКЯ (2%).

Критериями отягащенного семейного тромбогеморрагического анамнеза явилось наличие в анамнезе у близких родственников наших пациенток:

-ишемической болезни сердца и, как следствие, инфаркта миокарда;

-нарушений мозгового кровообращения и инсультов;

-тромбозов сосудов нижних конечностей и тромбоэмболии легочной артерии.

Семейный тромбогеморрагический анамнез был отягащен у 41%

пациенти, не отягащен – у 59%.

60