ГИ-2
.docx1-дәрістің тақырыбы: Гендік инженерия ғылымы туралы жалпы мәлімет
Гендік инженерия ғылымының даму тарихы. Ген инженериясы молекулалық биологияның жаңа саласы. Ол лабораториялық әдіс арқылы генетикалық жүйелер мен тұқымы өзгерген организмдерді алу жолын қарастырады. Ген инженериясының пайда болуы генетиканың, биохимияның, микробиологияның және молекулалалық биологияның жетістіктерімен байланысты. Бұл атаудың екі түрі қол-данылады: "генетикалық инженерия" және "ген инженериясы". Соңғы кезде "генетикалық инженерия" жалпылама түрде колданылып жүр, ген инженериясы да осының ішіне кіреді.
Молекулалық биология ғылыми жетістіктерінің нәтижесінде пайда болған ген инженериясы организмнің бағалы қасиетін сақтап қана қоймай, оған жаңа әрі саналы қасиетте бере алады. "Инженерия" деген атау құрастыру деген мағынаны білдіреді. Яғни ген инженериясы дегенді ген кұрастыру деп түсіну қажет. Ген инженериясының дәуірі басталмай тұрып 1969 жылы Г. Корана нуклеотидтерді белгілі бір жүйемен орналасқан ДНҚ синтезінің методологиясын жасап берген. Жекеленген дербес амин қышқылы - ашытқының аланиндік тРНҚ-ның бастауыш жүйесі ашылғаннан кейін Г. Корана химиялық жолмен осы РНҚ-ның көлемі 77 полинуклеотидтен тұратын кодтық бөлігін синтездеді. Кейіннен 1979 жылы осы лабораторияда ішек таяқшасының тирозиндік тРНҚ-сы синтезделді және ол Т4 бактериофагының құрамына енгізіліп, бактерияның клеткасында жұмыс істеді.
Ген инженериясының дүниеге келген уақыты 1972 жыл деп есептеледі. Сол жылы Т. Берг алғаш рет пробиркада үш түрлі микроорганизмнің ДНҚ-ларының фрагменттерінен жаңа гибридтік ДНҚ құрастырды. Бірақ маймылдың рак вирусының, бактериофагтың және ішек бактериясының гендік ДНҚ-ларынан құрастырылған ол гибридтік ДНҚ-ның клетка ішінде ойдағыдай жұмыс істей алатындығы тексерілмеді, себебі құрамында рак вирусының нуклеин қышқылы болғандықтан ғалымдар тәуекелге бармады.
Клеткада жұмыс істей алатын гибридтік ДНҚ-ны 1973-74 жылдары С. Коэн мен Г. Бойер құрастырды. Олар басқа организмнен бөліп алған ДНҚ фрагментін (генін) бактерия плазмидасының құрамына енгізді. Ол плазмидадағы бөтен гендердің алғаш рет жаңа организм ішінде жұмыс істей алатынын көрсетті. Соның артынша-ақ дүние жүзінің көптеген лабораторияларында жұмыс істей алатын әр түрлі плазмидалар алынды. Совет елінде ондай бөтен гені бар плазмида академик А.А. Баевтың басшылығымен жасалды.
Гендік инженерияның мақсаты мен міндеттері. Ген инженериясы деп рекомбинантты ДНҚ-лар жасап, оларды басқа тірі клеткаларға енгізуді айтады.
Ген инженериясы шешетін мәселелер: 1) генді химиялық немесе ферментті қолдану жолымен синтездеу; 2) әр түрлі организмнен алынған ДНҚ фрагменттерін бір-бірімен жалғастыру (ДНҚ рекомбинанттарын алу); 3) бөтен генді жаңа клеткаға векторлық ДНҚ арқылы жеткізу және олардың қызмет жасауын қамтамасыз ету; 4) клеткаларға гендерді немесе генетикалық жүйелерді енгізу және бөтен белокты синтездеу; 5) бөтен генге ие болған клеткаларды таңдап бөліп алу жолдарын ашу.
Генетикалық инженерия. Микроорганизмдер генетикасы мен молекулалық биологияның екпінді дамуы біздің ғасырымыздың 70-жылдарының бірінші жартысында генетикалық инженерия, ген инженериясы немесе рекомбинатты ДНҚ техникасы деп аталатын жаңа эксперименттік технологияның пайда болуына әкелді. ТМД елдерінде алғашқы - екі, ал батыста соңғы аталу кең қолдану алды.
Генетикалық инженерия деп in vitro жағдайында функциялық пәрменді генетикалық құрылымдарды (рекомбинантты ДНҚ-ны) құрастыруды және оларды тірі клеткаларға енгізуді түсінеді. «Генетикалық инженерия» және «ген инженериясы» терминдері синоним ретіңде қаралғанмен, олардың мағынасы бірдей емес: генетикалық инженерия - генетикамен байланысқан, ал ген инженериясы - тек генге ғана қатысы бар.
Ген инженериясы. Рекомбинантты ДНҚ (рДНҚ) дегеніміз әр текті ДНҚ-лардан құралған (табиғи немесе синтетикалық ДНҚ фрагменттерін жалғастыру арқылы) және клеткаларда репликациялана алатын генетикалық құрылымды түсінеді. Бұл арадан, біз үш терминнің де жалпы анықтамасы бір бағытта екендігін байқауымыз керек, шын мәнінде, олардың мақсаттары бірдей және қазіргі жаңа биотехнологияның негізгі, әрі перспективалы әдісі болып саналады.
Ген инженериясы мынадай кезеңдерден тұрады: 1) генді (ДНҚ фрагментін) алу; 2) рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру; 3) реципиент клеткасына рекомбинантты ДНҚ молекуласын енгізу; 4) қажет рекомбинантты ДҢҚ молекулалары бар клондарды (бактериялық клеткаларды) ортадан табу.
Гендік инженериядағы генді алу әдістері. Генді тікелей бөлу әдісі. Генді алудың үш әдісі бар: табиғи генді тікелей бөлу (сирек мүмкіндік), химиялық, ферменттік синтез.
Табиғи генетикалық материалдан - ДНҚ-дан арнайы ферменттердің (рестрикциялық эндонуклеазалардың) көмегімен қажет ген «кесіліп» алынады. Бұл әдістің елеулі кемшіліктері бар. Біріншіден, ДНҚ-дан қажет генді танып, кесе алатын ферментті таңдап алу қиын. Фермент генді әрқашанда нақты шекарасында емес әр қилы үзеді: не геннің екі жағынан артық нуклеотидтерді үзуі, не түгел үзбеуі мүмкін, мұндай ДНҚ фрагментерінің қызметі жеткіліксіз, сондықтан оларды пайдалану мүмкін болмайды.
Екіншіден, эукариоттық организм геномының экзон-интрондық құрылысы, олардың гендерін бактерияларға енгізгенде функциялық тұрғыдан қиындық туғызады, өйткені бактериялық клеткада сплайсинг процесі (интрондардың кесілуі) өтпейді.
Үшіншіден, егер ген барлық ДНҚ-ның аз ғана бөлігін құраса, онда оны бөлу мен анықтауда елеулі қиындықтар пайда болады. Сондықтан бұл әдіс негізінен генетикалық эксперименттер талабына сәйкес вирус пен бактериялардың генін бөлуде қолданылады.
Генді синтездеудің химиялық әдісі. Бұл әдістер белоктың немесе полипептидтің бірінші құрылымы (амин қышқылдар қатары) белгілі болса, оның генінің нуклеотидтер қатары химиялық жолмен синтезделеді.
Берілген нуклеотидтер тізбегі бойынша ДНҚ - синтездеу әдісін 1969 жылы, ген инженериясының дәуірі басталмаған кезде-ақ, Г. Корана ұсынған болатын. Ашытқы тРНҚ-ның гені осылай синтезделді. Бұл ген 77 н. ж. құралған. Алдымен, ұзындығы 5-12 нуклеотидтерден тұратын ДНҚ-ның қысқа фрагменттері синтезделді, онан соң олар арнайы ферменттің (лигаза) әсерімен бір-бірімен қосылды. Алайда, алғаш синтезделген бұл генді ішек таяқшасының клеткасына енгізген кезде жұмыс істей алмады, өйткені онда реттеуші элементтер - промотор және терминация бөліктері жоқ болатын. Кейін, 1976 ж. Г. Корана қызметкерлерімен тирозиннің тРНҚ-ының генін синтездей алды. Геннің ұзындығы 126 н. ж. тең болды, оған 52 н. ж. құралған промотор, 21 н. ж. - терминатор және ұштарына тетрануклеотидтер (ААТТ және ТТАА) жалғанды. Нәтижесінде, осы генді бактериофаг арқылы Е. Со1і клеткасына енгізгенде олар өз функциясын көрсете алды.
Қазіргі уақытта Г. Корана өңдеген әдістер бірқатар жасанды гендерді синтездеу үшін қолданылады. Осындай жолмен адамның - инсулин және интерферон, адам мен жануарлардың - энкефалин және бардикинин гормондарының функциялы гендері синтезделді.
Қазіргі кезде гендерді автоматты синтездейтін құралдар бар. 1980 ж. Итакура алғаш өзінің құрамында алдын ала берілген тізбек бойынша 6 сағ. ішінде 12-мүшелік олигонуклеотидті синтездеуге қабілетті автоматтың жұмысын компьютер бақылады. Мұндай жабдықтардың 1982 жылғы бағасы 36000-39500 долларға тең болатын. Егер 1979 жылы 120 н. ж. генді синтездеу үшін екі жыл керек болса, ал 1981 ж. бұл мақсатқа үш-ақ күнде жетуге болады.
2-дәрістің тақырыбы: Генді синтездеудің ферменттік (энзимдік) әдісі.
Ферменттік (энзимдік) әдіс. Генді синтездеудің үшінші әдісі кеңінен таралған және кейін рекомбинанты ДНҚ күйінде бір, кейде көп клеткалы организмдерде көбейетін гендердің негізгі шығу көзі болып саналады. Оның мәні ферменттік синтез арқылы генді алудан тұрады және төмендегіге саяды. Ең алдымен, клеткалардан (мұнда, қажет геннің белсенділігі жоғары болуы керек) ақпараттық (матрицалық) РНҚ (иРНҚ) молекулаларын бөліп алады, олардың арасында ген коделейтін иРНҚ бар, міне осы иРНҚ-ны бөлу қажет. Бұдан кейін кері транскриптаза (ревертаза) ферментінің көмегімен бөлінген иРНҚ-да комплементарлы ДНҚ (кДНҚ) синтезделеді. Кері транскрипция процесінде матрицалық иРНҚ-да кДНҚ-ның синтезі басталуы үшін иРНҚ-ның 3'— ұшына комплементарлы «ашытқы»-олигонуклеотид (қысқа тізбек) қажет. Жаңа кДНҚ тізбегі синтезделуі үшін тағы Мg иондары мен дезоксинуклеозидтрифосфаттар керек.
Ферменттік әдісте қолданылатын ферменттер. Жаңа кДНҚ синтезделіп біткеннен кейін, оны тазалап, ДНҚ-ның екінші тізбегін синтездеу үшін матрица ретін де пайдаланады. Ол үшін ортаға ревертазаны немесе ДНҚ-полимеразаны (бактериялардан алынған) қосады.
ДНҚ-ның екінші тізбегінің синтезі басталуы үшін олигонуклеотид (ДНҚ-ның 3'— ұшына комплементарлы) керек, әйтпесе кДНҚ-ның 3'— ұшы белгісіз себептермен шпилькалы кұрылым түзейді, осы құрылым екінші ДНҚ-ның синтезін инициациялай алады. ДНҚ-ының екінші тізбегі синтезделіп болғаннан кейін, оның алғашқы кДНҚ-ымен қосылған бөлігі (шпилькалы) нуклеаза 51 ферментінің әсері арқылы ажырайды, нәтижесінде қос тізбекгі ген алынады, оңы қос тізбекті комплементарлы ДНҚ (кДНҚ) деп атайды. РНҚ жіпшелері сілтінің әсерімен гидролизденеді, ал олигонуклеотидтер аталған нуклеазаның әсерімен ыдырайды.
Кері транскриптаза ферменті арқылы синтезделген гендерді бактерия клеткасына енгізбестен бұрын, оларға реттеуші элементтер жалғайды. Прокариоттарда сплайсинг өтпейтінін ескерсек, онда генді ферменттік жолмен синтездеу үшін матрица ретінде гяРНҚ-ны емес, жетілген иРНҚ пайдалану керек.
Рестрикциялық ферменттер (эндонуклеазалар). Рестриктизалалық ферменттердің ашылуы. Ген инженериясының немесе рекомбинантты ДНҚ технологиясының қалыптасуы ерекше ферменттер класы — эндонуклеазалардың немесе рестриктазалардың ашылуымен және қолданылуымен байланысты. Рестрикция ферменттерін 1972 ж. В. Арбер бактерия клеткасында ашты. Барлық бактериялар қос тізбекті ДНҚ-ның белгілі нуклеотидтер бөлігін үзе алатын бір немесе бірнеше рестриктазаларды синтездейді. Рестрикция ферменттерінің клеткадағы қызметі — бактерияға енген бөтен ДНҚ молекуласынан қорғау, рестрикция тоқтату деген мағынаны білдіреді. Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қышқылын үзіп, оның бактериялық клеткада кебеюіне жол бермейді.
Рестриктизалалық ферменттердің типтері. ДҢҚ тізбегінің үзілуі не симметрияның өсі бойынша жүруі мүмкін, онда «доғал» ұшты фрагменттер түзіледі (мысалы, Ваll немесе ВsuRI рестриктазалары), не симметрия өсінен біршама қашықтықта өтуі мүмкін, онда шығыңқы «жабысқақ» 5' (ЕсоRІ, Ніnd III— және т. б. рестриктазалар) немесе 3' (РstІ рестриктазасы) ұштары бар фрагменттер түзіледі.
Әр түрлі рестриктазалардың II типінің ішінен ДНҚ-ның бір нуклеотидтер қатарын танитын екі немесе бірнеше ферменттер кездеседі. Осындай жұп немесе топ эндонуклеазалар изошизомерлер деп аталады. Изошизомерлердің екі түрін ажыратады: нағыз изошизомерия — ферменттер белгілі бір нуклеотидтер қатарын танып, ДНҚ-ны бір нүктелерде үзеді және жалған изошизомерия — ферменттер бір нуклеотидтер қатарын тани алғанымен, оларды әр түрлі үзеді.
Рекомбинантты ДНҚ техникасы үшін алуан түрлі рестрикция ферменттерінің ішінен өздеріне комплементарлы «жабысқақ» ұштары бар фрагменттер түзейтін рестриктазалар бағалы болып саналады.
Рестрикция–модификация жүйесінің ашылуы. Рестрикция ферменттерін синтездейтін клетканың ДНҚ молекуласы эндонуклеазалардың әсерінен үзілмейді, өйткені бұл клеткалар модификациялау ферменттерін синтездейді, олардың әсерінен ДНҚ-ның құрылымы модификацияланады (өзгереді) — ДНҚ-ның репликациясы кезінде рестриктаза танитын бөліктерге метил тобын (СНз) жалғайды. Метилденген ДНҚ-ны рестриктаза үзе алмайды. Мұны бактериялардың өзіндік бір иммундық жүйесі деп санауға болады. Дегенмен, кейде бактерия клеткасына енгең кейбір бактериофагтардың нуклеин қышқылы метилденіп кетеді де, бактериялар осы фагтың әсерінен лизиске ұшырайды. Осы құбылысты—Нобель сыйлығының 1973 ж. лауреаттары — X. Смит, Д. Ңатанс және В. Арбер ашты. Рестрикциялау және метилдеу фөрменттері клетканың модификация-рестрикция жүйесін (МR) — құрайды.
Рестриктазалардың негізгі үш типі: I, II және III белгілі. Барлық рестриктазалар қос спиралды ДНҚ-ның белгілі нуклеотидтер қатарын дәл тани алады. Алайда, рестриктазалардың I типі белгілі нуклеотидтер қатарын танығанымен, оны әр қилы нүктелерде үзеді, ал рестриктазалардың II және III типтері ДНҚ-ның нақты бөліктерін дәл үзе алады. Эндонуклеазалардың I және ІІI типтер құрылымы күрделі және екі модификациялық және АТФ-ға тәуелді эндонуклеазалық активтіліктері бар.
Рестрликтазалардың II типі екі жеке белоктардан құралған: рестрициялаушы эндонуклеаза және модификациялаушы метилаза. Аталған себептерге байланысты ген инженериясында тек қана рестриктазалардың II типі пайдаланылады. Екінші жағынан; рестриктазаның II типі ғана бірдей нуклеотид тізбектерінің фрагменттері бар ДНҚ препараттарын алуға және әр түрлі геномдардан алынған фрагменттерден химерлі ДНҚ молекуласын құрастыруға мүмкіндік туғызады.
Рестриктазалардың ІI типінің басым көпшілігі 4—6 н. ж. құралған палиндромды ДНҚ тізбектерін тани алады. Мысалы, Вас. subtilis бактериясының ВsuR1 деп белгіленетін рестриктазасы ДНҚ бөлігін төмендегідей үзе алады:
Модификацияның маңызы. Әр тізбекті 3'— ұшына 5' бағытына қарай көз жүгіртсе, олар бірдей оқылады (ЦЦ ГГ), міне осындай тізбек палиндром деп аталады. Нәтижесінде ДНҚ-ның қос тізбегі симметриялы үзіледі (сілтемемен (стрелка) көрсетілген), сақиналы ДНҚ түзу құрылымға айналады. ДНҚ молекуласының соңында жабысқақ ұштар пайда болады, сондықтан олар ешқандай қосымша өңдеусіз бір-бірімен қайтадан қосылуға қабілетті болады.
Қазіргі кезде рестриктазалардың II типінің 500-ден астам түрлері белгілі және олар ДНҚ-ны бір-бірінен өзгеше 120 жерден үзе алады. 1973 ж. X. Смит және Д.Натанс рестрикция-модификация жүйе (МК) ферменттерін белгілеу номенклатурасын ұсынды. Көпшіліктің мақұлдауы бойынша туыстың бірінші әріпі және түрдің алғашқы екі әріпінен құралған үш әріп ферменттің шығу көзін көрсетеді. Эндонуклеазаларды — R, метилазаларды — М символдарымен белгілейді. Егер клетканың бір типінен екі және одан көп рестрикция ферменттері бөлінген болса, онда оларды рим цифрларымен (I, II, ІІІ т.с.с) нөмірлейді. Осы номенклатураға сүйеніп, Е. Соlі рестриктазасы ЕсоRІ, ЕсоRІІ және т.с.с., ал Вас.subtilis рестриктазасы ВsuRI т.с.с. болып белгіленеді.
3-дәрістің тақырыбы: Ген инженериясының векторлық (тасымалдаушы) молекулалары.
Векторлар және оларға қойылатын талаптар. Ген инженериясының маңызды мақсаты синтезделген немесе бөлінген генді клеткаға тасымалдау саналады. Бұл мақсат ДНҚ-ның векторлық молекулалары немесе қысқаша векторлар (тасымалдаушы немесе тасығыш) көмегімен іске асады. Вектор деп бөтен генетикалық материалды (ДНҚ фрагментін) клеткаға (реципиенттің) тасымалдауға қабілетті ДНҚ молекуласын айтады. ДНҚ молекуласын векторсыз, мысалы, бактериялық клеткаға енгізсе, онда оларды бактериялық ферменттер ыдыратып жібереді. Кейбір жағдайда ДНҚ сақталуы мүмкін, бірақ клетканың бөлінуінде олар тұқым қуаламайды. Осындай жағдай болмас үшін векторлық молекулалар қолданылады.
Векторлар — ген тасығыштар, ал вектор деген сөздің өзі бағыттағыш деген мағынаны білдіреді. Сонымен бірге, векторларды рекомбинантты ДНҚ-ның міндетті бөлігі деп түсіну керек. Векторларды эксперименттік жолмен құрастырады және оларға мынадай талаптар қойылады:
1) вектор клетка ішіне өзімен бірге бөтен генді алып кірген соң, репликациялана (көбейе) алатын болуы керек, сонда ғана ол келесі ұрпаққа тұқым қуалай алады, ол үшін векторға ДНҚ репликациясын бастайтын ерекше нуклеотидтер тізбегін енгізеді;
2) құрамында рестриктазалар танып, үзе алатын нуклеотидтер тізбегі болуы керек, әйтпесе векторға ДНҚ фрагментін енгізу мүмкін емес;
3) оның, бір немесе бірнеше таңбаланған гендері (маркерлері) болуы керек, сол таңбалар бойынша қажет геннің қайсы клетканың (реципиенттік) ішіне енгенін анықтайды;
4) вектордың, клетка ішіндегі копиялары (көшірмелері) жеткілікті мөлшерде болуы керек.
Ген инженериясында векторлық молекуланың шығу көзі болып бактериялық плазмидалар мен вирустар (әсіресе фагтар) саналады. Плазмида және фагтар негізінен бірінші талапқа сай келеді, ал, оларды келесі талаптарға сай келтіру үшін қосымша генетикалық өндеу жұмысын жүргізу керек.
Жоғарыда аталған векторларға қойылған талаптарға сәйкес кез келген генетикалық құрылым, басқа жағынан кез келген плазмида мен фагтар ген тасығыш бола алмайды.
Ген инженериясында қолданылатын векторларды үш топқа бөлуге болады: 1) плазмидалар; 2) бактериофагтар; 3) космидтер және фазмидтер.
Қазіргі кезде рекомбинантты ДНҚ технологиясында алғашқы екі векторлар типі жиі пайдаланылады, егер вектор ретінде плазмида қолданылса, онда ген клеткаға трансформация типімен енеді, ал бактериофаг (фаг лямбда) қолданылса, онда ген клеткаға трансдукция типімен енеді.
Вектор түрлері. Плазмидалық векторлар. Вектор ретінде мөлшері 15—20 мың н. ж. дейінгі, көбінесе 2-ден 10 мың н. ж. құралған кішігірім плазмидалар қолданылады. Плазмидалар бактериялардың хромосомадан тыс генетикалық элементі екендігін және олардың сипаттамасын біз қарастырған болатынбыз. Плазмидалық векторлар генді бактерияларға тасымалдап, оның тиімді жұмысын қамтамасыз ете алады.
Генетикалық инженерияда Е. Соlі бактериясы үшін көптеген векторлық плазмидалар құрастырылды. Олардың ішінен әсіресе СоlЕ1 плазмидасының туындылары кең таралды. Ф. Болвар және Р. Родригес құрастырған осындай плазмида — рВR322 бірнеше мың жұп негіздерден (4362 н. ж.) құралған. Бұл плазмидада антибиотиктер — ампициллин мен тетрациклинге төзімділіктің гендері бар және бірнеше рестриктазалар үзе алатын сайттары (нуклеотидтік нүктелері) бар рВR322 плазмиданың құрамында екі плазмида (рМВ1 және рSС101) және Тn З транспозоны бар. Ампициллинге тұрақтылықтың генінде Pst1 рестриктазасына арналған сайтқа және тетрациклинге тұрақтылық генінде ВаmН1 және SaL1 рестриктазаларына арналған қос сайтқа мән беріңіз. Осындай рестрикциялық сайттарда екі антибиотиктерге төзімділік гендерінің болуы қажет ДНҚ-сы (бөтен ДНҚ-сы) бар плазмидаларды сұрыптап алуға мүмкіндік береді.
Плазмиданы Ваm1 рестриктазасымен үзеді де, босаған орынға бөтен ДНҚ молекуласын (олар да, алдын ала Ваm1 рестриктазасымен үзіледі) жалғайды, нәтижесінде рекомбинантты плазмида тетрациклинді ортада өсе алмайды, өйткені плазмиданың tet генінің біртұтастығы бұзылған. Керісінше, плазмида ампицилинді ортада өсе алады, міне осындай ортада көбейетін бактериялардан қажет генді оңай табуға болады. Бұл арада, вектор антибиотиктерге төзімділік гендері бойынша таңбаланды.
pBR322 векторынан басқа СоlЕ1 плазмидасы негізінде бірнеше векторлар құрастырылған. Басқа плазмидалар (рSC101 т.б.) негізінде алынған векторлар да белгілі.
СolЕ1 плазмидасы негізінде құрастырылған вектордың кемшілігі де бар: бөтен ДНҚ-ның молекулалық массасы артқан сайын рекомбинанттардың саны (копиялары) азая түседі. Осы себептен ұзын ДНҚ фрагменттерінің (10 мың. н.ж. асатын) клондарын алу үшін фагтық векторларды, космид және фазмидтерді пайдаланады.
Фагтық векторлар туралы түсінік. Фагтық векторлар. Вектор ретінде бактериялармен қатар вирустар да қолданылады. Олардан вектор алу әдістемесі лямбда (λ) фагында жете зерттелген. Лямбда фагтың ДНҚ-сы қос тізбекті және формасы түзу, оның геномы 48,5 мың н. ж. тұрады. Фаг ДНҚ-сының 12 н.ж. құралған комплементарлы жабысқақ ұштары бар. Олар, фаг клеткаға енгеннен кейін бір-бірімен бірігіп, ДНҚ сақиналы формаға ауысады. Сақиналы ДНҚ репликациялық форма болып саналады. Лямбда фагтың ДНҚ молекуласында 60-тай ген бар. Фагтың геномында лизистік даму мен ұрпағын көбейту үшін қажет гендері (маңызды) жоқ екі учаскесі бар. Бірінші учаске фаг геномының орталық бөлігінде (маңызды емес гендер) орналасқан, оның ұзындығы 22,0 мың н.ж. тең, екінші учаске P мен Q гендері арасында орналасқан, ұзындығы 3,0 мың н. ж. тең.Міне, осы бөліктерді бөтен ДНҚ молекуласымен ауыстыруға болады. Лямбда фагтың вектор ретінде кең таралуы осы қасиеті мен ерекшелігіне байланысты, бұдан басқа оның орташа фаг екендігі бұрыннан белгілі.
Сонымен фагтың басына 25.0 мың н. ж. құралған бөтен ДНҚ-ны енгізуге болады. Фагтың қалыпты геномы 48,5 мың н.ж. құралғанымен, оның басына 38,0 мын, н.ж. кем емес және 53,0 мың н. ж. артық емес ДНҚ жинала алады, фагтың белокты капсиды ДНҚ-ның осындай мөлшерлерін қоршай алады. Лизистік дамуға қажет ген 29,0 мың н.ж. тең болғанымен, вектордың қалыпты тіршілік етуіне қажет фаг геномының мөлшері 38,0 мың н.ж. кем болмауы керек. Ғалымдар қазіргі кезде лямбда фагтың негізінде аталған шектеулер мен фаг қасиеттерін ескеріп, түрлі рестриктазалардың көмегі бірқатар векторлық молекулалар құрастырды: харон — λфаг, λgt — фаг, ЕМВ1З, λFIХ, λZАР және т. б.
Кейінгі уақытта жалғыз тізбекті ДНҚ -сы бар фаг — М1З негізінде де жақсы векторлар алынды. Жетілген М1З фагының жалғыз ДНҚ молекуласының ұзындығы 6,5 мың н.ж. тең. Клеткаға енгеннен кейін қос тізбекті репликациялық формаға айналып, өзінің 100—200 көшірмесін синтездейді. Ары қарай асимметриялы синтез жүреді: жетілген фагтың құрамына кіретін жалғыз тізбекті ДНҚ ғана синтезделеді. М1З фагы клетканы лизиске душар еткізбейді, бірақ оның бөлінуін бәсеңдетеді. Осының нәтижесінде жетілген фагтар клеткадан ортаға үздіксіз бөлініп тұрады. М1З фагының вектор ретінде негізгі артықшылығы жалғыз тізбекті векторлық ДНҚ-ны ыңғайлы жеке күйде тасымалдай алу қабілетіне байланысты. Мұндай ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарының Сэнгер әдісімен тез анықталуы генетикалық эксперименттерді жеңілдетеді. Тағы да, қазір пайдаланылатын барлық векторларға қарағанда, оларды бөлу және көшірмелерін алу оңайға соғады.
Жоғарыда баяндалғандардан фаг негізінде алынған векторлардың бірнеше артықшылықтарын байқауға болады. Бірақ, олардың сыйымдылығы шектелген, сондықтан рекомбинантты ДНҚ-ны молекулалық массасы бойынша іріктеу керек. Мұндай кемшілік космид деп аталатын векторлық молекулаларда кездеспейді.
Космидтер және фазмидтер. Космидтер. Космид — лямбда фагтың соs — учаскесі (жабысқақ ұштар) бар плазмида яғни тіршілігі екі жақты ДНҚ-ның гибридтік молекуласы. Оларды алғаш рет 1978 ж. Дж. Коллинз бен Б. Хон ашты. Космидтік плазмидалық бөлігі оның бактерияларда репликациялануына мүмкіндік береді, ал лямбда фагтың геномына жататын бөлігі -— соs тізбек — космидтің фаг капсидінің ішіне in vitro жағдайында оралуына және реципиенттік клеткаға трансдукциялануына мүмкіндік береді. Сонымен, космидтер клеткаға трансформация жолымен емес, кәдімгі инфекция арқылы ене алады. Мұның өзі трансформация процесінің тиімділігін ең аз дегенде 100 есе арттырады.
Космидтік векторларда мөлшері 33—49 мың н.ж. бөтен ДНҚ фрагменттерін көбейтуге болады. Космидтер сыйымдылығы ең үлкен векторлар, сондықтан эукариоттық ДНҚ-ның үлкен фрагменттерінің көшірмелерін және геномның гендер банкісін (жинағыш) клондардың ба-рынша аз санымен алу үшін арнайы құрастырылған.
Фазмида. Фаг ретінде де, плазмида ретінде де дамуға қабілетті фаг пен плазмиданың арасындағы гибридтер фазмида деп аталады. Мұндай векторда СоlЕ1 мен λ фагтың инициация нүктесі бар және олар бактериофаг сияқты лизистік, плазмидалар сияқты лизистік емес дамуғақабілетті.
Фазмидалық векторлардың сыйымдылығын лямбда фаг негізіндегі векторлармен салыстыруға болады, ол космидтерден анағұрлым аз.
Сонымен жоғарыда баяндалған мәліметтерден ген инженериясының векторлар системасы микроорганизмдердің және олардың генетикалық элементтерінің қасиеттеріне негізделгенін байқауға болады. Векторлық молекулаларға қойылатын негізгі талаптардың бірі, оларда рестрикциялық нүктелер болуы керек екендігін де атап өттік. Кейбір векторларда рестрикциялық бөліктер артық болуы мүмкін. Мұндай жағдайда, ондай бөліктерді векторлардан делеция (бір немесе бірнеше нуклеотидтерді ДНҚ-дан иондық сәулелер және т. б. әсерімен үзілуі) көмегімен «алып» тастайды.
Керісінше, вектордың керекті бөлігіңде эксперимент үшін аса қажет және рестриктаза үзе алатын тізбектер жоқ болуы да мүмкін. Бұл үшін химиялық синтездеу арқылы рестриктаза тани алатын нуклеотидтер тізбегі бар қысқа синтетикалық олигонуклеотид алынады. Лигазаның көмегімен қысқа синтетикалық олигонуклеотид вектордың керекті бөлігіне жалғанады. Оларды линкер — жалғаулық (ағыл. біріктіру сөзінен) деп атайды. Линкерде әр түрлі бірнеше рестриктазалар үшін тізбектер бар болса, оларды полилинкер деп атайды.
4-дәрістің тақырыбы: Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру.
Рекомбинантты ДНҚ туралы түсінік. Генетикалық инженерияның негізгі мағынасы болып рекомбинантты ДНҚ системасын құрастыру міндеті саналады. Рекомбинатты ДНҚ деп in vitro жағдайында шығу көзі бойынша әр түрлі кез келген екі немесе бірнеше ДНҚ фрагменттерін біріктіру арқылы түзілген ДНҚ-ны түсінеді. Рекомбинантты ДНҚ-ның қарапайым құрамы бөтен ДНҚ мен вектордан тұрады.
Генетикалық инженерияның формалды тұрғыдан дүниеге келген уақыты 1972 ж. деп есептеледі, осы жылы П. Бэрг алғаш рет пробиркада үш түрлі микроорганизмдердің — маймылдың рак вирусының, фагтың және бактериялық плазмиданың (вектордың) — ДНҚ фрагменттерінен бірінші рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырды. Дегенмен, бұл ДНҚ-ның клеткада жұмыс істей алатындығы тексерілмеді, өйткені құрамында рак вирусының гені болғандықтан П. Бэрг тәуекелге бармады. Дәл осы кезде П. Лобан да осындай рекомбинантты ДНҚ молекуласын алу мүмкіндігін көрсетті. Бұл кезде рестриктазалар және оның қасиеттері ашылған болатын.
1973 ж. С. Коэн және Г. Бойер плазмида негізінде векторларды құрастыру үшін рестриктазаларды пайдалану керектігін алғаш түсінді. Олар 1974 ж. клеткада кәдімгідей жұмыс істей алатын рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырды.
Қазіргі кезде рекомбинантты ДНҚ құрастыру жолдары жаңа ғылыми дәйектермен толтырылды және жетілді, ал олардың негізгі принциптері П. Лобан және С. Коэн идеяларына сүйенеді.
рДНҚ құрастырудың әдістері. Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың ең кең таралған әдісі рестриктазаларды қолдануға сүйенеді. Ол жабысқақ ұштар әдісі деп аталады. Бұл әдісте рекомбинантты ДНҚ құрастыру Коэн-Бойер үлгісі бойынша іске асады. Ген де (бөтен ДНҚ үзіндісі де) және векторда бір рестрикциялық ферменттің көмегімен үзіледі, нәтижесінде олардың ұштары бір-біріне комплементарлы, яғни жабысқақ болғандықтан гибридтік (немесе химерлі) ДНҚ молекуласына ДНҚ лигаза ферментінің көмегімен оңай бірігеді. Жабысқақ ұштар әдісі өзі танитын ДНҚ бөлігін симметрия өсінен біршама қашықтықта үзітіп рестриктазаларға сүйенеді.
Рекомбинантты ДНҚ-ны жабысқақ ұштар әдісі бойынша құрастырудың жақсы жақтары және кемшіліктері бар. Алынған гибридтік ДНҚ тізбегінде рестриктаза тани алатын бөліктердің қалпына келуі әдістің жақсы жағын сипаттайды. Бұл бөтен ДНҚ фрагментін осы рестриктазаның әсерімен салыстырмалы оңай бөліп алуға мүмкіндік береді. Ал, рестриктаза арқылы алынған барлық тізбектердің – жабысқақ ұштардың бір-бірімен (гомологты тізбектер) реассоцияланып (қайтадан бірігуі) кетуі әдістің кемшілігін көрсетеді. Осының нәтижесінде векторлық молекулалардың бірқатар бөлігі ендірмелермен емес, өз ұштарымен тікелей әрекеттесуі арқасында қалпына келеді, ал басқа векторлар болса бірнеше біріккен бөтен ДНҚ молекулаларынан құралған ендірмелермен қосылып кетуі мүмкін. Сондықтан бір ғана ендірмесі бар гибридтік векторларды іріктеу жұмысын асыру керек.