ГИ-2
.docxрДНҚ молекуласын жануар клеткасына енгізіп, ген клонын алу. Енді рекомбинантты ДНҚ молекуласын жануар клеткаларына енгізіп, ген клонын алу мүмкіндігімен танысайық. Мұнда, зерттеулер дағдыдағыдай бүкіл организмде емес, жануар клеткасының культурасында жүргізілуде. Қазіргі кезде мұндай клеткаларды, мысалы адам және сүтқоректілер ұлпасының клеткаларын бактерия мен ашытқы сияқты сұйық және қатты ортада ойдағыдай көбейтуге болады. Бірақ, олар өсуі үшін әр түрлі қоректік және т.б. заттарды керек етеді. Жануар клеткаларының жақсы өсуі үшін ортаға фетуин ( — глобулин) белогына бай бұзау қанының сарысуын қосу керек. Қазір, барлық амин қышқылдар, витаминдер, өсу факторлары, тұз және глюкозалар бар толық жасанды орталар қолдану алды. Мұндай орталарда жануарлардың эмбриондық ұлпалары мен мүшелерінен (теріден, өкпеден, бүйректен, жүректен, еттен, тимус және басқа бездерден) алынған клеткаларының клондарын өсіру мүмкін болды.
Жануарлар клеткасына арналған эукариоттық векторлар кейбір вирустарға (папо-, адено, парво-, ретровирустар және вакцина вирусы) негізделеді. Алайда жануар вирустары геномының маңызды емес бөлігінің көлемі аз, сондықтан оларға ұзын ДНҚ фрагменттерін енгізу мүмкін болмайды. Жануарлардың кейбір гендерінің мөлшері өте үлкен (мысалы, тышқанның дегидрофолатредуктаза гені - 42 мың н. ж.). Көпшілік жағдайда бөтен ДНҚ геномның маңызды бөлігінің орнын басады, нәтижесінде рекомбинанты вирустар репликация қабілетінен айырылады.
Жануарлар клеткасы үшін эукариоттық векторды дайындаудың негізгі объектісі —SV40 вирусы. Бұл, ұзындығы 5250 н. ж. сақиналы ДНҚ-сы бар кішкентай вирус мартышка (осыдан SV— simian (маймыл) virus деп аталуы) бүйрегінен бөлінді. SV40 вирусы лямбда бактериофаг сияқты иесінің клеткасының хромосомасына ене алады. SV40 вирусы негізінде бірнеше бағалы векторлар құрастырылды. Бұл векторлардың біразынан бір кемшілікті байқауға болады: олар вирионның қалыптасуына әкелгендіктен иесінің клеткасын жойып жібереді (бактериофаг сияқты). Сондықтан ғалымдар әр уақытта плазмида сияқты векторларды құрастыруға талпынады. 1970 ж. П. Берг SV40 вирусының ДНҚ-сы вирустық емес ДНҚ-дан құралған гибридті ДНҚ молекуласын құрастыруды ұсынды. Ақырында ол 1980 ж. SV40вирусының ДНҚ-сы мен Е.СоІі плазмидасының ДНҚ-сынан тұратын өтпелі плазмидалық векторларды (р SV2, р SVЗ және р SV4) құрастыра алды. Бұл векторлар сүтқоректілер клеткасына генді тиімді енгізе алады. Қоянның — глобии гені ендірілген плазмидалық векторлар маймыл клеткасында көбейе алды: тек иРНҚ ғана емес, сонымен қатар — глобиннің өзі синтезделді.
Генді сүтқоректілер клеткасына енгізудің тәсілдері. Трансфекция және клетканың жиналған ДНҚ-мен қосылуы. Рекомбинантты генетикалық материалды сүтқоректілер клеткасына енгізудің бірнеше тәсілдері белгілі. Ең қарапайым тәсіл - трансфекция немесе ДНҚ-ны клетка мембранасынан өтуін жеңілдететін күйде енгізу. Бұл үшін кальций фосфаты ерітіндісінде ген орналасқан ДНҚ фрагментін тұнбаға түсіреді. Мұндай тұнба кейбір клеткаларға еніп, өз активтілігін көрсете алады. Басқа жағдайда клеткаларды электрофорез немесе электропорация арқылы арнайы химиялық затпен (декстран ДЕАЕ) әсер етіп, оларды шоққа түсіреді, бұл ДНҚ-ның сома клеткалары ішіне енуіне (трансфекциясына) мүмкіндік береді.
Генді сүтқоректілер клеткасына енгізудің екінші тәсілі клетканың жиналған (липосомаларда, бактериялық протопластарда немесе эритроциттерде) ДНҚ-мен қосылуы. Мысалы, ДНҚ-ны липосомаға түсірсе, онда ДНҚ-ның су ерітіндісіндегі микротамшысы фосфолипидті мембрананың ішіне жиналады. Сүтқоректілер клеткасының мембранасы да фосфолипидті қабаттан құралған, сондықтан липосомалар клеткамен қосылып кетеді, яғни ген клетканың ішіне енеді.
Микроинъекция және вирустардың өзін қолдану әдістері. Кейінгі кезде микроинъекция тәсілі кең қолдану алуда және оның болашағы зор. Мұнда, ДНҚ ерітіндісін шприцпен байланысқан өте жіңішке микротүтікшелер арқылы клетканың ядросына тікелей енгізеді.
Рекомбинантты ДНҚ-ны вирустардың өзін қолдану арқылы эукариоттық клеткаларға тасымалдауға болады. Бұл үшін рДНҚ-ға вирустық ДНҚ енгізу керек. Мұндай гендердің экспрессиясы ДНҚ-ны вирустарды қолданғанда жоғары деңгейде өтеді. Әрине, вектор — вирус лизистік немесе лизистік емес жолмен клондарын көбейте алады. Соңғы жағдайда вектор эписома сияқты репликацияланады.
Сонымен, біз жоғарыда баяндалғандардан жануар клеткасы үшін вектор терминінің кең түсіндірме алатынын байқаймыз. Мұнда вектор деп өзінің генетикалық активтілігін эукариоттық клеткада қамтамасыз ете алатын ДНҚ-ның кез келген тізбегін түсінеді. Жануарлар векторларына қойылатын негізгі талап — геннің клеткадағы дұрыс және тиімді активтілігін қамтамасыз ету. Эукариоттық клеткада транскрипция деңгейі, старт алу және терминация нүктесі, процессингтің дұрыс өтуі және иРНҚ-ның тасымалдануы промоторлардан басқа энхансерлерге байланысты.
Сүтқоректілердің векторлары өтпелі болғаны ыңғайлы, өйткені мүндай векторларды бактериялық плазмида сияқты таңбалауға болады, немесе эукариоттық вектор селекциялық белгіні анықтайтын гендер бойынша таңбалануы қажет: рецессивті және доминантты. Рецессивті гендерді, олардың активтілігі жоқ мутантты клеткаларда ғана қолдануға болады. Доминантты гендер, өзі енген клеткаларға төзімділік қасиет береді, нәтижесінде геннің экспрессиясы байқалатын кез келген клетка үшін селекциялық таңба болып саналады.
9-дәрістің тақырыбы: ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарын анықтау
ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарын анықтаудың мәні. Ген инженериясының соңғы этапында алынған ДНҚ үзіндісінің нуклеотидтер қатарын анықтау керек. Көп жылдар бойы бұл проблеманы шешу үшін ғалымдар әр түрлі әдістерді қолданды, алайда оның ешқайсысы ойдағыдай болмады. Ақырында ген инженериясы әдістерінің дамуымен бұл проблема 1977 ж. таза химиялық әдіс арқылы шешімін тапты.
ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер қатарын анықтаудың Максам-Гильберт әдісі. Қазіргі кезде ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер қатарын анықтау үшін екі әдіс — Максам-Гилберт және Сэнгер-кең қолданылады. Екі әдістің де мәні мөлшері бойынша бір негізге айырмашылығы бар жалғыз тізбекті ДНҚ молекуласын алудан тұрады. Мұндай молекулаларды электрофорез көмегімен акриламид гелінде бөлуге болады. Мөлшері әр түрлі белдеулер ұзындығы 300 нуклеотидке дейін жететін «саты» түзейді.
Бірінші әдісті АҚШ ғалымдары У.Гилберт пен оның шәкірті Л.Максам ұсынды. Мұнда қостізбекті ДНҚ үзіндісінің 5'— ұштарын радиоактивті фосформен белгілейді. Мұны ішек таяқшасын зақымдайтын, Т4 бактериофагынан бөлінген полинуклеотидкиназа іске асырады. Бұл фермент АТФ молекуласынан фосфат тобын ажыратып, полинуклеотидтің 5'— ұшына жалғайды. Бұдан кейін қос тізбекті ДНҚ-ны денатурациялап, ДНҚ-ның жеке тізбектерін гельде электрофорез арқылы айырады. Мұнан соң тізбектің әрқайсысын гельден жеке жуып алып, бөлек зерттейді. Ары қарай, үлгілерді төрт бөлікке бөледі.
Біріншісіне ДНҚ-ны кез келген аденинді нуклеотидінен кейін үзетін ерітінді қосады. Оны ДНҚ тізбегінің бір аденин бөлігін ғана үзетіндей етіп қосу керек. Нәтижесінде тізбекте адениннің әр қилы орналасуына байланысты ұзындығы әр түрлі ДНҚ үзінділері пайда болады.
Дәл осындай жолмен басқа үш бөлікті де ДНҚ-ны тиминнен, гуаниннен және цитозиннен кейін үзетін реагенттермен өңдейді. Барлық төрт үлгідегі ДНҚ үзінділері бір-біріне параллель орналасып, полиакриламид гелінде электрофорез арқылы айырады: молекуласы аз кесінділер жоғары молекулалы кесінділерге карағанда гельде жылдам қозғалады. Мұнда қолданылатып электрофорез әдісі жақсы жетілген, ол барлық ДНҚ фрагментерін ұзындығы бойынша жеке бөліктерге айыруға мүмкіндік береді. Қазіргі кезде ұзындығы 300-ге дейін ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер катарын анықтаудың ешқандай қиындығы жоқ.
Геннің нуклеотидтер қатарын оқу үшін қараңғыда гельдің үстіне рентген фотопленкасын беттестіреді, мұнда радаоактивті таңба бар орындар ғана таңбаланады. Фотопленкада 5' - ұштары белгіленген ДНҚ кесінділері ғана көрінеді, ал олардың гельдің басынан жылжыған ара қашықтығы кесіндінің ұзындығына дәлме-дәл келеді. Енді ДНҚ тізбегін төменнен жоғары қарай оқып, геннің нуклеотидтік қатарын анықтауға болады.
Зерттеуші екінші комплементарлы ДНҚ үзіндісінің нуклеотидтер қатарын анықтап, бірінші тізбектен алынған мәлімет дұрыстығын тексере алады. Мұнда тек, бірінші тізбектегі аденин мен цитозиннің орнына екінші тізбекте тимин мен гуаниннің сәйкес келетінін естен шығармау керек.
ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер қатарын анықтаудың Сэнгер әдісі. Сэнгер әдісінің шығу тарихы. ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарын анықтаудың екінші тәсілін Нобель сыйлығының екі дүркін лауреаты атанған ағылшынның атақты ғалымы Ф. Сэнгер ұсынды. Сэнгер әдісінің көп жақтары Максам-Гильберт әдісімен ұқсас болғанымен оның принципінің айырмашылығы бар — Сэнгер бойынша нуклеотидтер қатарын анықтау ДНҚ-полимераза, яғни ДНҚ-ны ажырататын емес, керісінше оны синтездейтін фермент көмегімен іске асады. Мұнда ген үзіндісінің өзі емес, ДНҚ-полимеразаның көмегімен синтезделетін ДНҚ молекуласы зерттеледі. Ферменттің әсерімен ұзындығы әр түрлі ДНҚ молекулалары синтезделеді, олардың 5'— ұштары бірдей, ал 3'— ұштары төрт азоттық негіздің (А, Т, Г немесе Ц) бірі бойынша әр түрлі.
Сэнгер әдісінде нуклеотидтер қатары белгісіз ДНҚ сегментін М1З бактериофагының ДНҚ-сынан құрастырылған арнайы векторға енгізеді. Біз бұл фагтың векторлық молекула ретінде ыңғайлы айырмашылығын жоғарыда қарадық, атап айтқанда генді жалғыз тізбекті күйде тасымалдай алады. Мұндай тізбектің нуклеотидтер қатарын анықтау оңай. М1З бактериофагының ДНҚ-сы қос тізбекті күйде де бола алады. Осындай фагтың негізінде бірнеше векторлар құрастырылды. Фагтың репликациясы үшін оның геномының маңызды емес аймағына шамамен ондаған әр түрлі рестриктазалар үзе алатын полилинкер жалғанады. Полилинкердің қатарына 17 н.ж. құралған тізбек жалғанады. Осындай векторды рестриктазалардың бірімен үзгеннен кейін оны талдауға алынған және сол рестриктазамен үзілген ДНҚ бөлігімен біріктіреді. Мұнда ол вектордың 17 мүшелік тізбегімен қатар орналасады. Міне осындай рекомбинантты ДНҚ-ны бактерия клеткасына енгізіп, одан жалғыз тізбекті ДНҚ-сы бар фагтарды алады. Енді фагтан ДНҚ-ны айырып, оны талдауға кірісуге болады.
«Тізбекті үзу» әдісінің маңызы. Сэнгер әдісі «тізбекті үзу» әдісі деп аталады. Яғни ДНҚ-полимераза арқылы түзілетін комплементарлы ДНҚ-ның синтезі Максам-Гилберт әдісіне сәйкес әрбәр негізде тоқтайды. (үзіледі). Ал, ДНҚ-полимераза үшін ашытқы (праймер) керек, ол үшін вектордың 17-мүшелік тізбегіне комплементарлы олигонуклеотид синтезделеді.
Егер олигонуклеотид-ашытқыны матрицалық ДНҚ-мен байланыстырып, ДНҚ-полимераза мен дезоксинуклеозидтрифосфаттарды қосса, онда ДНҚ бөлігінің толық көшірмесін ала аламыз. Мұнда әрбір келесі азоттық негіз өсіп жатқан тізбектің 3'— ұшының гидроксил тобына жалғанатынына мән беру керек. Сэнгер әдісі үшін ДНҚ бөлігінің толық көшірмесі емес, оның үзінділері қажет.
Матрица-ашытқы комплексін төрт бөлікке бөледі де, олардың әрқайсысына тізбектің 3'— ұштары азоттық негіздерінің аналогтары — дидезоксинуклеозидтрифосфаттарды (ddNТФ) қосады. Мұндай дидезоксинуклеозидтердің рибоза қалдығының көміртегі атомдарында гидроксил тобы болмайды, сондықтан өсіп жатқан 3'— ұшының синтезін белгілі негізден кейін тоқтайды. Мысалы, тимидинмен аяқталатын ДНҚ фрагменттерін алу үшін ортаға дидезокситимидинтрифосфатты, тізбекті аденозин бойынша үзу үшін дидезоксиаденозинтрифосфатты және т.с.с. қосады. Әрине, төрт бөліктің әрқайсысына қалыпты дезоксинуклеозидтрифосфаттардың бірін (dТТФ, dАТФ, (dЦТФ және dГТФ) қосу керек. Нәтижесінде ұзындығы әр түрлі, бірақ 3'— ұштары бірдей олиго — және полинуклеотидтер жиынтығын алады. Олардың электрофореграммасын радиоаутография әдісі арқылы оқып, геннің нуклеотидтер қатарын анықтайды.
Максам-Гилберт және Сэнгер әдістерін қолданып, РНҚ тізбегінің нуклеотидтер қатарын да анықтауға болады. Бұл әдістердің осы заманғы молекулалық биология мен гепетика үшін маңызы зор. Оларды пайдалану арқасында қазіргі кезде көптеген вирустар, бактериялар және олардың плазмидалық элементтері геномдарының алғашқы құрылымы анықталды. Нуклеотидтері белгілі гендердің ұзындығы 6 млн. асып кетті. Қазіргі кезде кейбір митохондрия мен хлоропластардың ДНҚ құрылымы толық белгілі болды, олардың ДНҚ молекуласының ұзындығы 150 н.ж. асып түсті.
Осы заманғы генетикалық инженерияның жетістігін адам геномына инструменттік шабуыл басталуынан байқауға болады. Адам ДНҚ-сының нуклеотидтер қатарын анықтауды АҚШ ғалымдары тікелей қолға алуда. Адамның ДНҚ-сы 3 млрд. нуклеотидтерден құралған, сондықтан олардың орналасу қатарын анықтау көп қаражатты және көптеген ғылыми генетикалық зертханалардың бірігіп жұмыс істеуін керек ететін аса күрделі іс болып саналады. Кейбір ғалымдардың есебі бойынша 3-6 млрд. доллар (әр нуклеотидке 1-2 доллар) жұмсап, адам геномының проектісін 15-20 жыл аралығында шешуге болады. Қазіргі кезде нуклеотидтерді анықтау жылдамдығын көбейтіп, жұмсалатын қаржыны азайту (әр нуклеотидке 50 цент жұмсау) жолдары талқылануда. Мысалы, Сэнгер бойынша нуклеотидтер қатарын анықтаудың автоматты әдістері құрастырылды, мұндай жаңа автоматты приборлар адам геномының оқылуын жеңілдетеді деп күтілуде.
Хромосома және геном деңгейіндегі генетикалық инженерия. Генетикалық инженерияның деңгейлері. Әдетте генетикалық инженерияның үш деңгейін ажыратады: 1) гендік-рекомбинантты ДНҚ-ны тікелей зерттеу; 2) хромосомалық-гендердің үлкен топтарын немесе бүкіл хромосомаларды манипуляциялайды; 3) геномдық — бір клетканың генетикалық материалын басқа клеткаға тасымалдайды. Генетикалық инженерияның бірінші деңгейі рекомбинантты ДНҚ технологиясының әр алуан әдістерін біз жоғарыда толық талқыладық. Енді генетикалық инженерияның қалған деңгейлеріне қысқаша тоқталамыз. Қазіргі кезде хромосома деңгейіндегі генетикалық инженерияны хромосомалық инженерия деп атауға болады, ал геномдық инженерия өзінің мәні бойынша клетка инженериясына сәйкес келеді.
Хромосомалық инженерия. Хромосомалық инженерияны эукариоттық организмдерде қарастыруға болады, өйткені прокариоттарда «хромосома» және «геном» түсініктемелері біртекті қаралады. Жалпы хромосомаларды және олардың фрагменттерін биологиялық объектілерді өзгерту әдісі ретінде тасымалдау, әсіресе, болмашы рөл атқарады. Дегенмен, мұндай әдістің іргелі мағынасы зор және болашақта елеулі рөл атқаруы мүмкін. Хромасомаларды басқа клеткаға (риципиенттік) трансформациялау үшін алдымен оларды клеткадан (донорлық) бөліп алу қажет. Ол үшін клетка бөлінуін колхициннің көмегімен метафаза сатысында тоқтатады. Одан соң клеткаларды гипотонизациялайды. Хромосомалардың таза бөлігін дифференцияалды центрифугалау арқылы бөледі. Бүгін хромосома немесе оның бөліктері реципиенттік клеткаға пиноцитоз жолымен енеді. Клеткаға енген инактілі хромосомалар өздерінің кұрылымын бірнеше ұрпақ деңгейінде сақтап тіпті репликациялана алады. Нәтижесінде мұндай хромосомалардың гендері полипептид синтезін іске асыра алады. Жалпы клеткаға енген хромосомалар ақырында лизосомалық ферменттер әсерінен жеке бөліктерге ыдырайды. Хромосомалық инженерияның әдістері жануарлар хромосомаларының генетикалық картасын құрастыруға үлкен мүмкіндіктер береді.
10-дәрістің тақырыбы: Клетка инженериясы.
Сома клеткаларының гибридизациясы - қосылуы. Клетка инженериясының негізін сома клеткалардың гибридизациясы - қосылуы құрайды. Жануарлар сома клеткаларының организмнен тыс ортада қосылу қабілеттілігін алғаш рет 1900 ж. Ж. Барский байқады. Мұндай қосылудың нәтижесінде гибридтік клеткалар типі түзіледі, олардың ядросында бастапқы клеткалар хромосомаларының қосындысына тең хромосомалар саны болады.
Егер культураға кейбір заттарды, мысалы полиэтиленгликоль немесе инактивацияланған вирустарды қосса, онда гпбридтік клеткалардың түзілуі өте жоғары жиілікпен өтеді. Осындай мақсатпен Сендай вирусы өте жиі қолданылады. Олардың клетка рецепторларымен байланыса алатын бірнеше ерекше бөліктері бар, сондықтан бір мезгілде екі клеткамен байланыса алады.
Вирустың мөлшері өте ұсақ болғандықтан клеткалар өте тығыз жақындасады да, бір-бірімен қосылып, жаңа гибридтік клеткаға бірігіп кетеді. Мұндай қосылуда дикарион — екі ядролы клетка түзіледі. Онан соң екі ядроның хромасомалары бірігіп, синкарион түзілуі мүмкін. Бастапқы клеткалар тек синкарион түзеп қана қоймай, бірнеше ұрпақ көлемінде митоздық бөлінуге қабілетті болуы керек.
Қазіргі кезде әр түрлі сүтқоректілердің, типті жүйелік тұрғыдан бір-бірінен өте алыс түрлердің клеткаларын гибридизациялау әдістері тәжірибелерде ойдағыдай қолдану алды. Мысалы, адам X тышқан, адам X ірі қара, қоян X тауық, ірі қара X қара күзен, адам X тауық, ірі қара X атжалман т.с.с. гибридтік клеткаларды іn vitro жағдайында өсіруге болады.
Клетка инженериясының маңызы. Жаңадан түзілген гибридтік клеткаларда белгісіз себептермен митоздық бөлінудің алғашқы кезеңдеріне бір түрдің хромосомаларының жоғалуы байқалады. Адам мен тышқанның гибридтік клеткаларынан адамның хромосомалары жоғалады. Әдетте, 30 бөлінуден кейін мұндай клеткаларда тышқанның барлық хромосомалары және адамның орта есеппен жеті хромосомасы сақталады. Ірі дара X атжалман, шошқа X тышқан гибридтік клеткаларында алғашқы көрсетілген түрлердің хромосомаларының жоғалуы жиі байқалады. Бір түрдің хромосомаларының гибридтік клеткадан жоғалу өзгергіштігі хромосомалардың генетикалық картасын құрастыруға мүмкіндік береді. Егер гибридтік клетка өсетін ортаға енгізген өнімге байланысты, гибридтік клеткада қайсыбір хромосома сақталса, онда өнімнің гені осы хромосомада орналасқан деп есептелінді. Қазіргі кезде сома клеткаларды гибридизациялау әдісінің көмегімен адамның 2000-дай генінің хромосомалардағы орны табылды.
Клетка инженериясында гибридомаларды алу. Гибридомалар. Клетка инженериясының ең перспективалы бағыты гибридомалар алу. Гибридома дегеніміз лимфоцит және миелома (рак) клеткаларының қосылуы нәтижесінде түзілген гибридтік клетка. Организмнің иммундық жүйесінің негізін құрайтын лимфоциттер (Т — және В) арнайы қоректік орталарда көбейіп, өздері организмде синтездейтін иммуноглобулиндерді түзей алады. Дегенмен, олардың өсу уақыты жеткіліксіз. Осы мәселені 1975 ж. Д. Келлер және Ц. Милстейн (ГФР) гибридомалық клетка алу әдісі арқылы шеше алды. Олар миеломаны алдын ала антизатпен егілген көкбауыр клеткаларымен (лимфоциттермен) қосып, гибридтік клетка немесе гибридомалар ала алды. Гибридомалар рак клеткаларының шексіз көбеюге қабілеттілігін, ал көкбауыр клеткаларынан нақты антизаттарды синтездеу мүмкіндігін тұқым қуалау арқылы алады. Бұл ғылыми жұмыс медицина және ветеринария үшін маңызды жаңа клеткалық иммунобиотехнологияның пайда болуына әкелді.
Моноклонды антизаттар алу. Алдын ала белгілі бір антизатпен иньекцияланған В-лимфоцитті миелома клеткасымен полиэтиленгликоль көмегімен қосу арқылы В-гибридомдық клондар алады. Мұндай гибридтік клеткалар моноклонды антизаттар, яғни иммуноглобуллиндердің бір ғана типін синтездейді. Моноклонды антизаттарда антигеннің бір типімен ғана байланыса алатын рецепторлар бар. Моноклонды антизаттардың шығу көзі — гибридомаларды биотехнологиялық әдіс арқылы көбейтеді.
Сома клеткаларын гибридизациялау әдісі арқылы моноклонды антизаттар алу мынадай кезеңдерден тұрады: малды иммунизациялау, клеткаларды біріктіруге дайындау және оларды біріктіру, қажет антизатты синтездейтін клондарды сұрыптау, гибридомалық клеткалардың жеткілікті мөлшерін көбейту, антизаттар бар культура сұйықтығын алу және антизаттарды бөлу.
Организмнің иммундық жүйесі Т — лимфоциттерге де байланысты. Мысалы, олардың цитотоксиндік (цтТ — лимфоцит) популяциясы вирус және рак клеткаларын жойып жіберуге қабілетті. Осындай лимфоцитті миелома клеткасымен біріктіру арқылы алған гибридомаларды рак ауруына қарсы қолданудың маңызы зор.
Клетка инженериясы негізіндегі ең перспективалы биотехнологиялық бағыт моноклонды антизаттар алу. Моноклонды антизаттар өздерінің қасиеттері бойынша біркелкілікпен сипатталады және тек жалғыз ғана антигенмен байланыса алады. Осыған орай моноклонды антизаттардың вирустар, бактериялар, саңырауқұлақтар, токсиндер, аллергендер және қатерлі ісіктер қоздыратын ауруларды тану және емдеу үшін үлкен практикалық маңызы бар.
Гибридомалар технологиясы негізінде моноклонды антизаттар алу үлгісі төменде көрсетілген. Одан моноклонды антизаттар алу сома клеткалардың гибридизациясына негізделгенін байқау қиын емес.
Моноклонды антизаттарды әр түрлі ауруларды диагностикалау үшін қолданады. Әр түрлі рак, ҚИЖС, гепатит, оба т.б. көптеген ауруларға диагноз қоюда моноклонды антизаттар кең практикалық қолдану алуда.
Гибридомалар технологиясының ветеринария үшін маңызы ұлғая түсуде. Мысалы, ірі қараның р24 лейкемия вирусы белогына қарсы моноклонды антизаттар синтездейтін клеткалар культурасы алынды. Қазіргі кезде моноклонды антизаттар алу технологиясымен 500-ден астам компаниялар айналысады. Олар құны 5 млрд. долларға жуық биотехнологиялық өнім – моноклонды антизаттар өндіреді.
Аллофенді жануарлар алу. Аллофендер туралы түсінік. Аллофенді жануарлар алу. Әр түрге жататын жануарлардың эмбриондық ұлпаларын (бластула клеткаларын) араластыру арқылы алған химерлі организмдер аллофендер деп аталады. Аллофенді жануарлар алу организм деңгейіндегі генетикалық инженерияның мысалы болып саналады. Жалпы аллофендерді алуда генетикалық инженерияның клетка және организм деңгейлері бір-бірімен тығыз байланысқан.
Эукариоттардың эмбриондық дамуының алғашқы кезеңінде — 16 клетка түзілгенге дейін — гендердің басым көпшілігі өз функцияларын іске асырмайды. Б. Минтц 8 бластомераларға (клеткаға) жеткен эмбриондарды араластыру арқылы аллофенді тышқандар ала алды. Келесі тәжірибелерде Минтц үлгісіне сәйкес басқа белгілері (көздің түсті қабығы, құлақтың ұзындығы т.б.) бойынша анық айырмашылығы бар тышқандардың бластомераларын біріктіріп, аллофенді организмдер алынды. Аллофенді ұрпақ алу үшін алдын ала ұрықтанған және қарама-қарсы белгілері бар тышқандардан 8 бластомера сатысына жеткен эмбриондарды алып, оларды іn vitro жағдайында профаза ферменті көмегімен жеке бластомераларға ажыратады. Осындай жолмен алынған екі немесе одан көп бластомераларды біріктіріп, арнайы қоректік ортада гаструла сатысына жеткен біртұтас эмбрион алады, ары қарай, оларды пробиркадан ұрғашы тышқанның жатырына микротүтікше көмегімен тасымалдайды. Туылған тышқандар аллофенді болып саналады, өйткені олардың клеткаларының генетикалық құрамы әр түрлі. Аллофенді тышқандарды үш, төрт және одан көп әр түрлі ата-аналық формалардың эмбриондың бластомераларын біріктіріп алуға да болады. Тіпті, гистосәйкес емес ата-аналардың клеткаларынан құралған аллофенді организмдер ешқандай иммундық бұзылусыз дамиды. Мұның өзі сүтқоректілерде иммундық жүйе эмбриондық дамудың соңғы кезеңінде қалыптасатынын және оны жануар генотипінің кәдімгі көрінісі емес, бүкіл жеттігудің жиыны екендігін көрсетеді.
рДНҚ негізіндегі ген инженерия жетістіктері. Генетикалық инженерияның жетістіктері биотехнологияның дамуында жаңа көрініс тапты, ол дәстүрлі емес биотехнологияның пайда болуын паш етті. Осыған орай, кейде, генетикалық инженерияны ғылымдағы кезекті революция ретінде қарайтын ойлар айтылып жүр. Шынында, генетикалық инженерия тек нәзік технология болып қана саналады және тұқым қуалаушылық ұғымының жалпы принциптерін теріске шығарған жоқ, қайта оларды дәлелдеп, жаңа ғылыми мәліметтермен толықтырды.
Ген инженериясының арқасында эукариоттар геномының экзон-интрондық құрылымы ашылды. Эукариоттар генінің осындай ерекшелігі «бактерияда қандай болса, піл үшін де сондай» деген пікірдің сенімді емес екендігін ескертеді. Бұл ашылудың өзі рекомбинантты ДНҚ құрастырудың жаңа жолдарын іздеуге мәжбүр етті, өйткені зерттеушілер үшін эукариоттар генінің клонын бактериялық клеткада алу қиынға соғады. Ген инженериясының қарқындап дамуы геномның жылжымалы элементтерінің (бактериялардың транспозондары мен эукариоттардың МДГ элементтері) табиғатын терең түсінуге мүмкіндік берді. Сонымен қатар эукариоттар ДНҚ тізбектерінің әр қилы болуы және ген активтілігінің онтогенез барысында өзгеруі де генетикалық инженерияның әдістерін қолдану арқылы айқын болды.
Жоғарыда аталған жаңалықтарды жинақтай келіп, генетикалық инженерия, молекулалық генетиканың көпшілік мақұлдаған қағидаларына негізделгенімен, ол біздің тұқым қуалаушылыққа деген көзқарасымызды елеулі түрде өзгертетін кең зерттеулерді ашқанын қорытындылауға болады. Генетикалық инженерия қолданбалы ғылым ретінде молекулалық биологияны технологияға айналдыра бастады.
Бұл арада, жетпісінші жылдардың орта шенінде, рРНҚ-ны алудың алғашқы тәжірибелерінен кейін ғалымдар арасында микроорганизмдер ген инженериясының қауіптілігі туралы сөз болғанын да атай өту керек. Ол кезде, жұртшылықта Е. СоІі және басқа бактериялардың ген инженерлік құрастыру барысында зерттеушілердің бақылауынан шығып кетіп, «генетикалық монстрларға» айналады да, өте қауіпті аурулар таралып кетуі мүмкін деген абыржулар болды. Тіпті, 1974 жылы арнайы комиссия генинженерлік жұмыстарды уақытша тоқтату туралы шешім қабылдады. Алайда, бір жылға жетпей бұл тыйым өз күшін жоғалтты: 1975 ж. көктемінде Асиломар қаласында (АҚШ) рекомбинантты ДНҚ бойынша өткен алғашқы халықаралық конференция рДНҚ-мен трансформацияланған организмдермен жұмыс істеу ережесін қабылдады. Қазіргі кезде генетикалық инженерияның ешқандай қауіптілігі жоқ екендігі көпшілікке айқын. Алғашқы рекомбинантты ДНҚ құрастырылғаннан бері міне 20 жылдай астам уақыт өтті, бірақ осы кезеңге шейін оның ешқандай да зиянды әсері байқалған жоқ және мүмкін емес те. Алайда, генетикалық инженерия әдістері арқылы үрейлі бактериялық қару шығару мүмкіндігін де түсіну керек. Мұндай қауіп генетикалық инженерияға емес, ең алдымен империализмдік қоғамға байланысты. Бүгінгі таңда бактериялық қарулары бар елдердің оны қолданбауы және зерттеу жұмыстарын тоқтатуы туралы шешімдердің маңызы өте зор. Рекомбинантты ДНҚ негізндегі ген инженериясы әдістерінің табыстары және клетка инженериясының әдістері эксперименттік биологияға болашақта зор мүмкіндіктер ашты. Бұл әдістердің қуаты алғашқы кезде зерттеушілердің өзін абыржытып тоқтады, мысалы, ДНҚ-ны зерттеген, атақты ғалым Э. Чаргафф 1973 ж.: «Біз бірнеше ғалымдардың әуесқойлығын қанағаттандыру үшін миллиондаған жылдардың эволюциялық даналығының мәнін жоятындай етіп, сұғанақтық жасауымызға хұқымыз бар ма?»— деп сауал қойған болатын. Алғашқы кездегі таңдану және абыржу кезеңдері өтті. Енді, ген және клетка инженериясы кәдімгі ғылыми тәжірибе болып қалыптасты. Бұл әдістердің дамуы жаңа сала — биотехиологияның пайда болуына әкелді.
11-дәрістің тақырыбы: Ген инженериясы негізінде биотехнологиялық өнімдер алу.
рДНҚ-ны қолдану барысында қол жеткізген жетістіктер. Қазіргі биотехнология адамның практикалық әрекетінің барлық жақтарына үлкен әсер етуде. Қазіргі кезде оның көмегімен ондаған аса бағалы биологиялық активті заттар — гормондар, ферменттер, витаминдер, антибиотиктер, кейбір дәрі-дәрмектер алынады. Биотехнология ауыл шаруашылығында орасан рөл атқарады. Биотехнологияның жетістіктері, ең алдымен, оның іргелі ғалымдармен тығыз байланысының арқасында пайда болды, мұның нәтижесінде биотехнологияның жаңа салалары мен әдістері — генетикалық, клеткалық және белоктық инженерия, энзимология инженериясы, жануарлар, өсімдіктер.