ГИ-2
.docxБұдан басқа бұл әдістің күрделілігі бар: рестриктаза танитын нүктелер эксперимент үшін ыңғайлы бөлікте орналаспауы мүмкін, мысалы, олар қажет геннің ішіне локализацияланады. ДНҚ-ның кез келген ұшын плазмидамен рекомбинациялау үшін пайдалануға мүмкіндік туғызатын басқа әдістер де бар.
Гомополимерлі ұштар әдісінде немесе конекторлық симметрия өсімен үзетін рестриказа арқылы алынған ДНҚ фрагменттерінің «доғал» ұштарына (шығыңқы бір тізбекті бөлігі жоқ) терминалдық трансфераза ферментінің көмегімен гомонуклеотидтер, мысалы ДНҚ-ның 3'— ұштарына поли (Т) немесе поли (Ц), ал векторлық ДНҚ-ның 3'— ұштарына поли (А) немесе поли (Г) жалғанады.
Гомополимерлі ұштардан құралған ДНҚ фрагменттерін (бөтен ДНҚ және вектор) бір ортаға қосса, олар комплементарлы жұп негіздерін түзеп, оңай бір молекулаға бірігеді. Немесе ДНҚ фрагментіне де, вектордың ұшына да синтетикалық қос тізбек (линкер) жалғайды. Сонан соң линкерді танитын және оны жабысқақ етіп рестриктазамен үзеді. Осылайша бұл жолмен де жабысқақ ұштар алынады. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың бұл әдісі Лобан-Берг идеясына сүйенеді.
Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың ыңғайлы әдісі — доғал ұштарды жалғау (тігу). Оның, негізіне Т4 фагынан бөлінген ДНҚ-лигаза ферментінің доғал ұшты екі ДНҚ молекуласын жалғау қабілеттілігі жатады. Бұл әдістің артықшылығы оның кез келген соңғы нуклеотидтер тізбегін жалғай алатындығынан тұрады. Егер белгілі екі тізбекті араларына ендірмеусіз жалғау керек болса, онда бұл әдісті пайдалану өте ыңғайлы.
Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың қаралған үш әдісінің бірнеше модификациялары (өзгешеліктері) бар және де ген мен векторлық молекуланың ерекшелігіне байланысты методологиясы әртүрлі болуы мүмкін. Көпшілік жағдайда линкер технологиясы қолданылады.
5-дәрістің тақырыбы: Рекомбинантты ДНҚ молекуласын клеткаға тасымалдау және ген клонын көбейту.
рДНҚ-ны клеткаға енгізу. Рекомбинантты ДНҚ-ны клеткаға енгізу. Гибридті молекулаларды клеткаға енгізу тәсілі векторға байланысты. Егер вектор ретінде плазмида қолданылса, онда енгізу трансформация типімен, егер фаг қолданылса, онда трансфекция (клетканың фаг ДНҚ-сы арқылы инфекциялануы) типімен өтеді.
Трансформация мен трансфекцияның жалпы жолы бактерия клеткасын кальций тұздарымен (Са С12) өңдегенде, олардың мембраналарының ДНҚ-ны өткізе алатындығына негізделеді. Экзогенді (бөтен) ДНҚ-ның клеткаға ену тиімділігі төмен. Алдын ала СаСІ2-мен өңделген клеткаға, мысалы, 1 мкг рВR322 плазмидасын қосса, онда әрбір 104-105 плазмиданың біреуі ғана клетканың ішіне енеді, яғни бактериялардың азғантай бөлігі ғана трансформациялана алады. Оларды басқалардан бөлу бактерия клондарын алу процесінде іске асады.
Әдетте, модификацияланбаған ДНҚ молекуласын (метилаза ферментімен метилденбеген) бактерия клеткасының рестрикциялық ферменттері ыдыратып жіберетінін біз білеміз. Ал, клеткаға рекомбинантты ДНҚ молекуласының көп мөлшерін енгізсе, онда оның рестриктазалары оларды ыдыратып үлгере алмайды. Бактериялық рестриктазалар кесіп үлгірмеген рДНҚ-ның біраз бөлігі рестриктаза танитын орындарда метилденіп — модификацияланып кетеді. Ғалымдар генетикалық инженерия тәжірибелерінде рестрикциялық ферменттері жоқ бактериялық клеткаларды жиі қолданады. Мұндай рестрикцияланбайтын клеткаларда әдетте модификациялаушы ферменттер де жоқ болады.
Ген клонын көбейту. Белгілі концентрациялы бактериялық суспензияны қатты ет-пептондық қоректік ортаға, мысалы, қосымша қоректік заттар бар агарға егеді, сонда Петри шыны ыдысының 1 см2 бетіне 1-10 бактериялар келуі керек. Агардың үстіне түскен бактериялық клеткалар бөліне бастайды, соңында олардың әрқайсысының көптеген ұрпақтары сыртқы пішіні бойынша саңырауқұлақтың қалпақшасына ұқсас кішігірім шоғырлар түзейді. Әр шоғырда бастапқы бір бактериялық клеткадан түзілген және одан ешқандай айнымайтын көптеген клеткалар бар, оны клон деп атайды. Бастапқы суспензияның әрбір клеткасы да өз клонын түзейді (позитивтік колония).
Вектор ретінде бактериофагты қолданғанда генді бактерияға енгізу және соңғыны қоректік ортада өсіру жоғарыдағыдай плазмидалық вектор қолданғандағыдай өтеді. Фаг ДНҚ-сы (енбеген клеткалар) агарда көбейіп, көмескі тегіс «газон» түзейді. Ал, фаг ДНҚ-ы бар бактериялар түскен орындарда мөлдір дөңгелек ойыстар түзіледі, оларды негативтік шоғыр деп атайды. Негативтік шоғырдың түзілуі клеткада фаг ДНҚ-ның репликациялануына және жетілген фагтардың пайда болуына байланысты. Бұдан кейін фагтар басқа клеткаларға еніп, оларлы ыдыратады, нәтижесінде әрбір ойыс бір ғана ДНҚ-сы клеткаға енген ДНҚ-ның копиясы бар фаг ұрпақтарынан тұрады.
М13 фагы клетканы лизиске әкелмегендіктен негативтік шоғыр түзбейді. Бірақ олар көбейген орындарда бактериялық клетканың бөлінуі бәсеңдейді, сондықтан жалпы көмескі газонда мөлдірлеу ойыстар пайда болады. Соңғы газонда қажет рДНҚ молекулалары енген бактериофагтардың көбеюі өтеді.
Қазіргі кезде ген инженериясында ген клонын көбейтудің екі әдісі кең қолданылуда: геномның жеке фрагментін (кДНҚ-ны қажет геннің иРНҚ молекуласынан кері транскриптаза ферменті көмегімен алу) және барлық геном клонын көбейту.
Комплементарлы ДНҚ (кДНҚ) клонын көбейту әдісін организмнің қайсы клеткаларында қажет белок синтезделетінін білгенде ғана алуға болады. Оның үстіне белоктың синтезделуі анағұрлым көп мөлшерде өтуі керек, тек сонда ғана клеткада қажет белоктың иРНҚ-ның көшірмелері көп болады және осыған сәйкес көптеген негативтік шоғырларда іздеп отырған геннің 0 көшірмелері бар деп есептелінеді.
Бірқатар жағдайларда белок синтезделетін клеткаларды табу мүмкін болмайды, ал кейде қажет белоктың синтезделуі мардымсыз өтеді. Осыларға байланысты геномның қажет фрагментін (генін) синтездеу іске аспайды, өйткені матрицалық иРНҚ-ны клеткадан бөлу өте қиынға соғады. Мұндай жағдайда ген клонын көбейтудің екінші — геномның барлық ДНҚ-сының клонын көбейту әдісі колданылады. Барлық геномның клондарын көбейту. (ДНҚ-ның жеке фрагментінің клонын көбейтуге қарама-қарсы) шотган-эксперимент (ағыл. shotgun — бытыра мылтық: бірнеше бытыраның бірі нысанаға тиеді, яғни көптеген гендерден қажет біреуін сұрыптап алуға болады) деп аталады. Бұл әдістің мәні - кез келген организмнің жоғары молекулалы ДНҚ-сын механикалық түрде (мысалы, гидродинамикалы әдіспен немесе ультрадыбыстың әсерімен) немесе рестриктазалармен әр түрлі фрагменттерге ұсақтайды.
Соңғы кезде рестриктазалар жиі қолданылады. Мұнда кажет геннің құрылымы белгісіз болғандықтан, алдын ала рестриктаза таңдау мүмкін емес, сондықтан тәжірибеде бірнеше ерекше рестриктазалар қолданылады және олардың бірі организмнің басқа гендерімен қатар қажет генді де үзе алады деп есептелінеді. Басқаша айтқанда бұл әдіс арқылы табиғи генді бөліп алуға болады. Ары қарай бөлінген көптеген әр түрлі ДНҚ фрагменттері векторларға жалғанады. Міне, осындай организмнің барлық геномын сипаттайтын рДНҚ-лар жинақтамасы генотека немесе гендер жинағы деп аталады. Гендерді генотекада плазмидалық рДНҚ-түрінде (этил спиртінің тұнбасында), әсіресе рекомбинантты лямбда фаг суспензиясы түрінде (температурасы 0°С тең антисептиктер бар ортада) сақтау өте ыңғайлы. Басқа жағдайда рекомбинантты фагтарды бактериялар клондарында да сақтауға болады. Мұндай клондарды оқтын-оқтын жаңа қоректік орталарға ауыстыру қажет. Аталған жұмыстардың көмегімен кез келген организмнің гендер жинағын алуға болады. Бұл қызықтыратын жұмыстың қиындықтары көп, олардың түрлі зерттеушілер әр қилы әдістерді қолданып жеңуде. Қазір әлемнің жүздеген зертханаларында гендер жинағы құрастырылды. Гендер жинағы ғылыми эксперименттік жұмыстарда және биотехнологиялық бағытта қолдану тапты. Олар кез келген генді немесе бірден бірнеше генді бөліп алу көзі және молекулалық генетиканың әдістемелік құралының ажырамайтын бөлігі болып саналады.
Кері транскрипцияның ашылуы құрылымды гендердің жинағын құрастыруға мүмкіндік берді. Оларды гендерге сәйкестендіріп, комплементарлы ДНҚ генотекасы деп атайды, өйткені кДНҚ еш уақытта қажет генге толық сәйкес келмейді, сонымен қатар онда қосымша тізбектер де бар.
Белгілі бір организмнің толық геномы клонын көбейту үшін қажет гендер жинағының мөлшерін геномның - молекулалық массасы -(М) мен фрагменттің орта мөлшерін біліп және дәлдік деңгейді (Р) таңдап, анықтауға болады: N =M (n x 1n) - 1-P
Қоянның барлық геномын сипаттайтын гендер жинағын құрастыру үшін жоғары дәлдік деңгейде 920 мың клондар қажет. Ген инженериясының классикалық объектісі — Е. Соlі бактериясының гендер жинағын дайындау үшін анағұрлым аз клондар саны қажет - 1,4 мың. Сүтқоректілердің геномы үшін ең долбарлы есеп бойынша 800 мың - 1 млн. клондар санынан құралған гендер жинағы қажет. Эукариоттық организмдердің гендер жинағын алу үшін олардың барлық ДНҚ жиынтығын гидродинамикалық әдіс арқылы фрагменттерге бөліп, вирустарға енгізеді.
6-дәрістің тақырыбы: Скрининг
Ген скринингі туралы түсінік. Қажет генді барлық бактериялар массасынан алу үшін оларды қатты қоректік ортаға егеді, мұнда бактерияның әрбір жеке клеткасы жеке ұрпақ береді, яғни бактериялық шоғыр түзіледі. Енді гендер жинағын, яғни әр түрлі клондар арасынан бізге қажет генді табу қерек. Бұл процесс скрининг деп аталады. Гендер жинағы аз болған сайын одан қажет генді табу оңай. Комплементарлы ДНҚ клонын көбейту әдісі гендер жинағы мөлшерін азайтуға әкеледі, дегенмен мұның өзінде де қажет генді табу үшін арнайы әдістер қолданылады. Кең тараған әдістің бірі шоғырларды гибридизациялау деп аталады. Ол үшін Петри шынысындағы негативтік шоғырларға (рДНҚ-сы бар бактериялар) нитроцеллюлозалы сүзгіні беттестіреді, бұның нәтижесінде ДНҚ молекулалары сүзгіге жабысады. Сүзгінің газонга сәйкес орны үлкен дәлдікпен мұқият белгіленуі қажет, мысалы, сүзгі мен оның астындағы газоны бар агарды бірнеше жерден инемен шаншиды. Бұдан кейін сүзгіні тез арада 0,5 М NаОН-пен өңдейді, онан соң бейтараптайды. Бұның нәтижесінде қос тізбекті ДНҚ молекулалары денатурацияланып жеке тізбектерге ажырап, интроцеллюлозамен байланысады. ДНҚ молекуласын нитроцеллюлозалы сүзгіде берік бекіту үшін оларды 80°С температурада қыздырады.
Ген скринингінің кезеңдері. Ген скринингісінің келесі жауапты кезеңі сүзгіні радиоактивті зондпен өңдеу. Зонд (сүңгі) дегеніміз іздеп жатқан ген бөлігінің азоттық негіздеріне комплементарлы кішігірім ДНҚ немесе РНҚ тізбегі. Сүзгі әр уақытта радиоактивті изотоппен белгіленеді. Сүзгіні синтездеу үшін геннің немесе белоктың ең болмағанда кішігірім бөлігінің нуклеотидтер тізбегі белгілі болуы керек. Олардың амин қышқылдар тізбегі бойынша және генетикалық кодтың көмегімен геннің бөлігін коделейтін нуклеотидтор тізбегін оңай алуға болады. Алайда, кодтың туылмалы (синонимділігін) екендігін ескеру қажет, сондықтан белоктың белгілі тізбегінен метионин және триптофан амин қышқылдары (олардың бірден ғана кодондары бар) болатын бөліктерінен синтетикалық олигонуклеотид — синтезделеді. Генетикалық кодтың туылмалығына байланысты ерекше жалғыз сүңгі синтездеу мүмкін болмаса (мысалы, гендегі сер-сер-про-ала амин қышқылдар қатары әр түрлі оқылуы мүмкін — АГЦАГАГГАЦГА немесе АГТТЦГГГГЦГЦ) синтетикалық сүңгілер сериясын немесе табиғи синтездеу қажет. Табиғи сүңгі ретінде қажет геннің функциясы жоғары өтетіні белгілі клеткадан әр түрлі жолдар арқылы алынған РНҚ-ны пайдалануға болады. Көпшілік жағдайда осындай РНҚ-дан кері транскрипция процесі арқылы алынған олигонуклеотидтік кДНҚ сүңгі ретінде жиі қолдану алды.
Сүңгі алынғаннан кейін рекомбинантты векторды талдауға кіріседі. Гендер жинағын бүкіл геномдық немесе комплементарлық ДНҚ-ның) ДНҚ (РНҚ) — сүңгімен тексереді. Сүңгі тек өзіне комплементарлы генмен ғана гибридизацияланады (байланысады). Бұның негізінде ДНҚ-РНҚ-сүңгі гибридтерінің құрылуы жатады. Сондықтан сүңгі бір тізбекті болуы және гибридизация қолайлы жағдайда өтуі қажет: жоғары температура (бірақ тым көтеріңкі емес, өйткені түзілген гибридтер қайтадан ыдырап кетеді), ұзақ уақыт (сүңгі өзінің ДНҚ-сын тауып үлгіруі үшін). Гибридизация процедурасы аяқталғаннан кейін сүзгіні жуып артық сүңгілерден тазалайды, өйткені сүзгіге жабысқан артық сүңгілер күшті радиоактивтік орта түзеп, гибридизация нәтижесін бұзады. Енді қажет ген бар ДНҚ тізбегі сүңгімен байланысып, радиоактивті изотоп (фосфор немесе иод) түрінде таңбаланады. Оның орнын табу салыстырмалы қарапайым: сүзгіні кәдімгі рентген фотопленкасының үстіне басады, қажет экспозициядан соң (оның уақыты радиактивтіліктің күшімен анықталады) фотопленканы шығарады. Сүзгідегі радиоактивті ДНҚ бар орын фотопленкада кішігірім қара дақ түрінде көрінеді. Осындай фотопленкада радиоактивті изотоппен таңбаланған генді жарықта түсірілген ізі арқылы табу әдісі радио-аутография деп аталады. Сүзгідегі дақтың орнына қарай отырып, газоннан қажет рДНҚ енген негативтік шоғырды табуға болады.
Генді бөлу әдістері. Саузерн және Нозерн блотинг әдістері. Сонымен біз қажет гені бар ДНҚ фрагментін бөліп алдық, алайда, ол әлі де болса геннің өзінен ұзындығы бойынша бірнеше есе үлкен. Фагтық вектордың ішіне орта есеппен 15-20 мың н.ж. сиятындай етіп құрастырылатыны естеріңізде болар, ал геннің орташа ұзындығы — 1-2 мың н. ж. Міне сондықтан да жеке генді бөлу жұмысы осымен аяқталмайды. Гендер жинағынан бөлінген ДНҚ сегментін қайтадан әр түрлі рестриктазалармен үзеді, осының нәтижесінде ұзындығы бойынша әр түрлі рестриктер немесе ДНҚ үзінділері алынады. Алынған үзінділерді электрофорезден өткізеді, мұның нәтижесінде олар агарозалық гельде ұзындығына сәйкес таралады: үзінді қысқа болған сайын, ол электр өрісінің әсерінен агарозалық гельде жылдам қозғалады. Осындай гельді бром этидиімен бояп, оның суреті бойынша рестрикттердің ұзындығын анықтайды. Бұдан кейін жауапты кезең — ДНҚ-ны денатурациялау арқылы жалғыз тізбекті үзінділер алып, оларды нитроцеллюлозалы сузгіге ауыстыру басталады. Ол үшін электрофорез аяқтала салысымен агарозалық гельді тұздың қанықтырылған ерітіндісіне батырып, сүзгі қағаздың үстіне орналастырады. Гельді нитроцеллюлозамен жабады, ал олардың үстіне бірнешн құрғақ сүзгі қағаздарын салып престейді. Тұз ерітіндісі құрғақ сүзгі қағазына сіңеді, ол үшін ерітінді гельден, онан соң нитроцеллюлозалы сүзгіден өтуі керек. Гельдегі ДНҚ үзінділері ерітіндімен бірге тасымалданады, бірақ нитроцеллюлозалы сүзгіде тұтылып бекінеді. ДНҚ үзінділерінің нитроцеллюлозалы сүзгідегі орындары электрофорез пластинкасындағы орналасу тәртібіне дәлме-дәл келеді. Сонымен электрофорездегі рестриктер таңбасы нитроцеллюлозалы сүзгіде алынды. Бұл әдісті Саузерн Э. ұсынды, сондықтан ол Саузерн блотинг (ағыл. to blot— қағазға сорылу) деп аталады. Саузерн бойынша блотинг әдісінің маңызы жалпы геномнан жеке гендерді бөлуде арта түседі. Бұл молекулалық деңгейдегі күрделі жұмыс үлкен мұқияттылықты керек етеді. Мысалы, сүтқоректілер клеткасының геномы 109 н.ж. құралған болса, онда ұзындығы тіпті 5000 н. ж. тең жалғыз ген геномның бар болғаны ядролық ДНҚ-ының 0,00005 %-ін ғана құрайды.
Әдісті РНҚ үшін де қолдануға болады. Мұнда гибридизация өткізу үшін бірқатар өзгерістер енеді. Бұл әдіс Нозерн блотинг деп аталады (Саузерн — оңтүстік деген мағынаны білдірсе, керісінше Нозерн-солтүстік әдісі де-ген атау пайда болды). Қалған операциялар генотеканың скринингісіндей өтеді: нитроцеллюлозалы сүзгіде ДНҚ денатурацияланып, радиоактивті сүңгімен гибридизацияланады және қажет ген орналасқан ДНҚ үзінділері радиоаутографияның көмегімен табылады.
Рекомбинантты ДНҚ технологиясында шоғырларды гибридизациялау әдісінен басқа қажет генді тауып анықтаудың тағы фенотиптік және иммунологиялық екі әдісі белгілі.
Фенотиптік әдіс. Фенотиптік әдісі ізделіп отырған геннің клетканың фенотипін шұғыл өзгертетініне негізделген. Мұндай клетка ізделіп отырған ген енбеген клеткалардан қоректік ортада өсу қабілеттілігі бойынша көзге түреді. Рекомбинантты ДНҚ-ны фенотиптік сұрыптау әдісінің бір мысалын жоғарыда рВR322 плазмидасын вектор ретінде таңбалауынан байқауға болады: қажет гені бар рДНҚ тек ампицилинді ортада ғана өсе алады, ал векторға енбеген ДНҚ-ның басқа үзінділер мұндай ортада жойылып кетеді.
Плазмидалық векторды β — галактозидаза ферментінің гені арқылы таңбалап, қажет бактериялық клонды фенотипі бойынша іріктеуге болады. Бұл ферменттің дисахарид лактозаны және оның аналогтарын ажырататынын білеміз. Аналог ретінде 5-бром —4-хлор —3-индолил — р — галактозид қосылысын алуға болады, оны генетиктер Х-гал деп атайды. β— галактозидаза одан ашық көгілдір түсті бояу — бромхлориндолды ажыратады. Плазмидаға β — галактозидазаның генін енгізіп, рДНҚ құрастыруға болады. Осы ферменттің гені жоқ Е. Соlі немесе басқа бактерияларға аталған ген бар векторды енгізіп, олар өсіп жатқан ортаға Х-гал қосса, онда ген бойынша рекомбинантты клеткалар көгілдір түсті, ал бастапқы клеткалар түссіз шоғырлар түзейді. Енді, тәжірибеде β— галактозидаза генінің арасын арнайы рестриктазаның көмегімен үзіп, орнына қажет ДНҚ үзіндісін жалғайды, мұның нәтижесінде β — галактозидаза гені активтілігін жоғалтады. Осындай рекомбинантты ДНҚ-мен трансформацияланған клеткалар қатты ортада түссіз шоғырлар түзейді, оларды бастапқы векторы бар клеткалардан (көгілдір) оңай ажыратуға болады.
Иммунологиялық әдіс геннің өнімі – белок құрамымәлім болса қолданылады. Бұл әдіс белокқа антизаттар синтездей алу мүмкіндігіне сүйенеді. Алдымен рекомбинантты молекулалар бар клетка шоғырын агардың үстінде лизиске ұшырайды. Онан соң поливинил пластинкасына антизаттарды бекітіп, антиген (геннің өнімі)— антизат байланысу реакциясын жүргізеді. Антизаттар тек өзіне сәйкес белоктармен ғана байланысады. Петри шынысындағы белоктың яғни қажет геннің орнын радиоактивті элементпен (J125 т. б.) белгіленген антизаттар арқылы табады. Полимерлі пластинкада радиоактивті бөліктердің орналасу тәртібі бойынша активті гендері бар бактериялардың шоғырын табуға болады.
7-дәрістің тақырыбы: Бөтен гендердің микроорганизмде жұмыс істеуі. (Бөгде геннің бактериялық клеткада жұмыс істеуі).
Күшті промотрды таңдау. Прокариоттар гендері жұмыс істеуінің немесе экспрессиясының механизмі бүгінгі күні жақсы зерттелген және Е. СоІі бактериясы мен кейбір оның фагтарын көпжылдық іргелі молекулалық-биологиялық зерттеулер арқасында түсінікті бола бастады. Алдымен, прокариоттық геннің экспрессиясы деп осы генде иРНҚ синтезделуін (транскрипция кезеңі) және иРНҚ-ның рибосомадағы трансляциясын (белок синтезін) түсінетінін еске түсірейік. Белок синтезінің бірінші кезеңі — трапскрипцияның инициация процесінде РНҚ-полимераза ферменті промотор деп аталатын ДНҚ-ның ерекше бөлігін тануы керек, тек сонда ғана ДНҚ-ның қос тізбегі ажырап, иРНҚ синтсзделуі бастала алады. Демек, адам немесе жануар генінің бактерия клеткасында жұмыс істеп, қажет биотехнологиялық өнім (белок) түзуі үшін, ең алдымен, оның алдында бактериялық РНҚ-полимераза байланыса алатын прокариоттық күшті промотор болуы керек.
Транскрипцияның жоғары деңгейі плазмидалық репликацияның тұрақсыздығына әкелетін атап өту керек. РНҚ-ның ғана емес, әсіресе көптеген белоктардың мөлшерден тыс синтезделуі клетканың жойылуына әкелуі мүмкін. Осындай жағдай болмас үшін пәрменді транскрипцияланатын геннің соңында трапскрипцияны тиімді терминациялайтын (тежейтін) нүктелер болуы керек. Практикалық мақсат үшін реттелетін транскрипцияны қолдану ыңғайлы.
Ген инженериясында бірнеше күшті промоторлар белгілі: Е. СоІі оперондарының промоторлары — LacUY5 (лактоза), trp (триптофан) және гибридтік промотор tас (trp — Lас); лямбда фаг промоторлары — РR мен РL; т 5, т 7, Х 174 және т. б. фагтардың промоторлары.
Эукариоттық құрылымды бактериялық геномға енгізу. Ген жұмысының аяқталуы үшін иРНҚ-ның белокқа трансляциялануы қажет. Прокариоттық және эукариоттық клеткалардың молекулалық-генетикалық құрылымының айырмашылықтарына орай трансляция процесі өтуі үшін де белгілі қиындықтарды жеңуі керек. Бұл айырмашылықтар, атап айтқанда, рибосоманың, әсіресе, белоктың амин қышқылдар тізбегін коделейтін иРНҚ-ның молекулалық-генетикалық құрылымына байланысты. Прокариоттық иРНҚ-ның инициалаушы кодонының (АУГ) алдында (3-12 нуклеотид бұрын) Шайн-Делгарно (SD) тізбегі деп аталатын, 3-9 нуклеотидтерден құралған ерекше бөлігі бар. Бұл тізбек рибосомалық 163 РНҚ-ның 3'— ұшына комплементарлы болғандықтан иРНҢ-ның рибосомамен байланысуын қамтамасыз етеді.
Сонымен эукариоттық геннің реттеуші бөліктері бактериядан үлкен айырмашылығы бар және оларды бактериялық РНҚ-полимераза мен рибосомалар тани алмайды. Осыған орай, бөтен ген өз қызметін бактерия клетканың ішінде іске асыруы үшін екі жағдайды керек етеді: 1) геннің алдында бактериялық РНҚ-полимераза тани алатын күшті промоторды; 2) иРНҚ трансляциясының инициациясы үшін SD — тізбегі керек.
Қазіргі кезде эукариоттық геннің реттеуші бөлігін бактериялық реттеуші бөліктерімен (промотор және SD — тізбекпен) алмастыруды мүмкін ететін бірнеше әдістер белгілі. Бөтен геннің клеткадағы жұмысын іске асырудың екінші жолы — өзінің реттеуші бөліктері жоқ эукариоттық құрылымды ген функциясы жоғары бактериялық геномның арасына енгізу. Мұнда коделенетін құрылымды ген бактериялық промотормен, SD — тізбегімен және АТГ инициациялаушы кодонмен жалғанады, нәтижесінде шамалы ғана өзгерген қажет белок бірден синтезделеді.
Бөтен геннің активтілігін клеткада қамтамасыз ету үшін оны бактериялық геннің бірімен (реттеуші бөліктері бар) жалғауға болады. Осындай жолмен 1977 ж. Бойер мен Итакура лактоза промоторын қолданып, сүтқоректілердің соматостатин гормонын Е. Соlі клеткасында синтездей алды. Бұл гормон гипоталамуста өте аз мөлшерде түзіледі және қанға инсулин мен өсу гормонының (соматотропиннің) түсуін реттейді. Оның молекуласы күрделі емес, бар болғаны 14 амин қышқылдарынан құралған, сондықтан соматостатиннің гені өте ұсақ. Осыған байланысты, алдымен, ұзындығы 42 нуклеотидке тең ДНҚ молекулаласын химиялық жолмен синтездейді (гормонның амин қышқылдар қатары белгілі және оның әрқайсысының триплетін генетикалық код арқылы табады). Осы синтетикалық генді рВR322 плазмидасына және E. Соlі геномының — галактозидаза геннің соңына біріктіру үшін қосымша қысқа линкер тізбектерін (рестриктазалық жабысқақ ұштар) жалғады. Нәтижесінде синтетикалық қос тізбектің ұзындығы 52 жұп нуклеотидке тең болды: геннің N — ұшында метионинді коделейтін АТГ кодоны және ЕсоR1 рестриктазасы жабысқақ ұштар етіп, үзе алатын ААТТ тізбегі бар, ал С — ұшында екі стоп-кодон орналасты. ДНҚ-ның осы бөлігін промоторы және операторы бар — галактозидаза генінің бөлігіне жалғап, олардың барлығын вектор — рВR322 плазмидасына біріктірді. Осындай біріктірудің нәтижесінде гибридті ген алынды, мұнда — галактозидаза гені бөлігінің С — ұшы соматостатин генімен ауыстырылды. Бактериялык — галактозидаза гені мен соматостатин генінің арасында метионин кодоны орналасқан. Бұл гибридтің транскрипциясы мен трансляциясы — галактозидазаның реттеуші элементтерінің арқасында іске асты. Осындай — галактозидазаның рекомбинантты гені өзінің Е. Соlі клеткасына трансформацияланғаннан кейін өз жұмысын тамаша іске асыра алады. Нәтижесінде гибридті белок синтезделді, мұнда соматостатин — галактозидазалық бөліктен метионин арқылы жекеленеді. Жай химиялық қосылыс — бромциан (ВrСN)—белоктарды метионин бойынша ажыратады. Соматостатиннің өзінде метионин қалдығы жоқ болғандықтан, оны таза күйінде жеке фракцияға бөлуге болады.
Көпшілік жағдайда, белок цитоплазмада түзілгеннен соң клетканың мембранасы арқылы оның сыртына тасымалдануы керек. Бұл үшін геннің N— ұшында клеткалық мембранаға жақындығы бар ерекше тізбек орналасуы қажет. Бұдан басқа эукариоттардың бірқатар белоктары синтезделу аяқталғаннан кейін полиглюколизденеді: белокқа полисахаридтің қысқа тізбегі жалғанады, бұл оның активтілігіне және клетка ішінде тасымалдануына әсер етеді. Қазіргі кезде бактериялық клеткада белоктарды глюкозалау өте қиын. Бір тәуірі, көптеген белоктар (интерферон және т. б.) полисахаридтік жалғану болмаса да активтілігін жоғалтпайды. Егер мұндай модификациялық өзгеріс қажет болса, онда генді эукариоттар клеткасына енгізуге тура келеді. Бұдан бөлек, бактериялық клеткада эукариоттық геннің интрон бөліктерін үзе алатын ферменттік жүйе жоқ. Осыған орай прокариоттар ген инженериясында сплайсингтен өткен эукариоттық иРНҚ ғана пайдаланылады. Эукариоттық генді эукариоттық клеткаларға немесе организмге енгізіп, оның өнімін алу биотехнологияның болшақтағы маңызды мақсаты болып саналады.
8-дәрістің тақырыбы: Эукариоттар клеткасында ген клонын көбейту.
Ген инженериясында эукариот-ашытқылардың қызметі. Осы уақытқа дейін біз эукариоттың ген клонын бактерия клеткасында көбеюін қарастырдық. Рекомбинантты ДНҚ молекулаларын тікелей эукариоттар, әсіресе сүтқоректі жануарлар клеткаларына енгізіп, оның өнімін алудың болашақтағы маңызы өте зор.
Эукариоттар клеткаларында ген клонын көбейтудің басты проблемаларының бірі — векторлық молекулалар. Генді эукариоттық векторға енгізу техникасының негізі бактериялық клеткадағыдай. Алайда, эукариоттық векторлардың өзі бактериялық векторлардан айырмашылықтары бар. Әлбетте, мұндай векторлардың рестриктазалар үзетін ыңғайлы бөліктері және таңбаланған гендері бар. Бірақ, оларды эукариоттардың плазмидасы мен вирустарының генотипі негізінде құрастырады: векторлар эукариоттық клеткаға еніп, сонда репликацияла алуы керек. Бұдан бөлек, эукариоттық клетканың ішіне түскен ген клетканың хромосомасымен байланысып, оның белгілі бөлігіне енуі қажет. Онда эукариоттық векторға осындай енуді қамтамасыз ететін элементтерді жалғау қажет болады.
Эукариоттар ген инженериясында қарапайым эукариот-ашытқының елеулі маңызы бар. Ашытқылар бір клеткалы болғанымен оларда эукариоттарды сипаттайтын барлық қасиеттер бар: цитоплазмадан ядро қабығы арқылы оқшауланған ядросы бар және ДНҚ-ның репликация, транскрипция және трапсляциясының ферменттік аппараты (оның ішінде сплайсинг ферменттері) басқа эукариоттардағыдай.
Ашытқылармен генетикалық жұмыс жүргізу өте жеңіл: бактериялар сияқты сұйық ортада өсе алады, қатты ортада шоғыр түзеді, тіпті парафин, метил спирті сияқты субстраттарда да тез көбейе алады. Бұдан басқа ашытқылар геномының мөлшері үлкен емес — 1,7-107 н.ж. Ең бастысы, ашытқылар генетикалык тұрғыдан жақсы зерттелген. Ген инженериясында ашытқылар ішінен Sассhаrоmyces сerevisiae штамы ең көп қолданылады.
Рекомбинантты молекулалар құрастыру үшін штамм ұзындығы 2 мкм (6300 н.ж.) тең Seр 1 плазмидасы тәжірибеге алынады. Осы плазмиданың негізінде көптеген векторлар алынды. Вектор ретінде осы плазмиданың Е. Соlі бактериясының плазмидасымен гибриді қолданылады. Мұндай ген тасығыштар өтпелі векторлар деп аталады, өйткені олар эукариоттық (мұнда ашытқы) клеткада да, прокариоттық (бактериялық) клеткада да репликациялана алады. Мұндағы бактериялық плазмиданың бөлігі векторды таңбалау үшін маңызы бар (мысалы, антибиотиктерге төзімділік гендері бойынша). Осындай векторлардың көмегімен бактериялық клеткада құрастырылған рДНҚ-ны эукариоттық — ашытқы клеткасына тасымалдауға болады және керісінше.
Ашытқылар эукариоттық организм болғандықтан, олардың клеткаларында сүтқоректілердің гендері қалыпты жұмыс істей алуын күту керек еді. Алайда, бұл олай емес. Мысалы, ашытқы клеткаларында қоянның 8-глобин генінің экспрессиясы, оның транскрипциясы мен иРНҚ сплайсингісі дұрыс өтпеуіне байланысты байқалмады. Осындай қиындықтарға қарамастан қазіргі кезде ірімшік өндіру үшін қажет химозинді, адамның интерфероны мен инсулинін және т.б. қажет белоктарды синтездейтін ашытқылар алынды.