Литература / Руководство БХ

Биохимия белков

Структура и функции белков

Белки – высокомолекулярные азотсодержащие полимерные органические соединения, обладающие амфотерными свойствами. Мономерными единицами, из которых построены белки, являются α-аминокислоты (производные карбоновых кислот, имеющих в α-положении аминогруппу).

Определенным образом соединяясь между собой, аминокислоты образуют полипептидные цепи. Связь, возникающая между карбоксильной и аминогруппами, называется пептидной. Белки делятся на простые и сложные. Молекулы простых белков построены лишь из 20 качественно отличающихся друг от друга аминокислот. Сложные белки, помимо аминокислот, имеют в своем составе небелковые компоненты (простетические группы) – нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, пигменты, ионы металлов, остатки фосфорной кислоты.

Белки выполняют множество разнообразных функций, главные из которых - каталитическая (все ферменты являются белками), питательная, транспортная, защитная, сократительная, структурная, гормональная.

Различают четыре уровня организации белковых молекул, называемых первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурами.

Под первичной структурой подразумевают порядок, последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи, соединенных пептидной связью. Установление первичной структуры белков включает два основных этапа:

1.Определение аминокислотного состава белка;

2.Определение аминокислотной последовательности в белке.

Под вторичной структурой белка подразумевают конфигурацию полипептидной цепи, т.е. способ свертывания, скручивания полипептидной цепи в спираль или в какую-либо другую конформацию. Этот процесс протекает не хаотично, а в соответствии с программой заложенной в первичной структуре. Вторичная структура белка возникает за счет образования водородной связи между атомами водорода NH-групп и атомами кислорода CO-групп основной цепи. В результате образуется гибкая полипептидная цепь со спиральной (α-структура) или складчатой структурой (β-структура).

Под третичной структурой белка подразумевают пространственную ориентацию полипептидной спирали или способ укладки полипептидной цепи в определенном объеме. Основной движущей силой возникновения трехмерной структуры является взаимодействие радикалов аминокислот с молекулами воды. При этом неполярные гидрофобные радикалы амнокислот погружаются внутрь белковой молекулы, образуя там сухие зоны, а полярные радикалы ориентируются в сторону воды. Возникает термодинамически наиболее выгодная стабильная конформация молекулы. Эта структура стабилизируется за счет дисульфидных, ионных, эфирных, солевых связей и ван-дер-ваальсовых сил, возникающих в результате взаимодействия между боковыми радикалами аминокислотных остатков полипептидной цепи.

Под четвертичной структурой подразумевают способ укладки в пространстве отдельных полипептидных цепей, обладающих одинаковой (или разной) первичной, вторичной или третичной структурой, и формирование единого в структурном и функциональном отношениях макромолекулярного образования. Многие функциональные белки состоят из нескольких полипептидных цепей (протомеров), соединенных нековалентными связями. Примером белка, имеющего четвертичную структуру является молекула гемоглобина, состоящая из четырех полипептидных цепей (две α- и две β-цепи).

Обнаружение, идентификацию и определение количества аминокислот, входящих в состав определенного белка, можно осуществить различными способами.

Обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях, растворах и установить аминокислотный состав белков позволяют цветные реакции. Существуют универсальные реакции для определения белков - биуретовая (на все белки) и нингидриновая (на белки и все α-

2

аминокислоты). Нингидриновая реакция со спиртовым раствором нингидрина (или с ацетоном) широко используется для определения аминокислот в хроматографических методах для открытия отдельных аминокислот и определения их количества. Отдельные определенные аминокислоты как в молекуле белка, так и в растворах отдельных аминокислот можно определить специфическими реакциями, например, реакция Милона (на тирозин), реакция Сакогучи (на аргинин).

Для исследования аминокислотного состава сыворотки крови и других биологических жидкостей широко используют метод хроматографического разделения аминокислот, нередко изменяющийся при ряде заболеваний. Например, при повреждениях паренхимы печени в плазме крови и моче увеличивается содержание метионина, серина, цистина; при фенилкетонурии повышается уровень фенилаланина; при печеночной коме наблюдается повышенное выделение с мочой глутамина; при рахите у больных в крови увеличивается концентрация глицина, глутамина, серина и аланина.

Ксантопротеиновая реакция. Основана на способности ароматических аминокислот (тирозина, триптофана, фенилаланина) вступать в реакцию с азотной кислотой с образованием нитросоединений, имеющих в щелочной среде оранжевую окраску.

Ход определения: К 0,5 мл раствора белка добавляют 0,5 мл концентрированной HNO3 и нагревают на спиртовке до кипения. Охлаждают и добавляют 5-6 капель 20 % раствора NaOH.

Реакция Миллона. Эта реакция специфична для тирозина, который с реактивом Миллона при кипячении образует кирпично-красный осадок ртутной соли динитротирозина. К раствору белка не следует добавлять избыток реактива Миллона, так как он содержит азотную кислоту, которая при взаимодействии с белком может дать желтое окрашивание (ксантопротеиновая реакция), маскирующее реакцию Миллона.

Ход определения: к 0,5 мл раствора белка добавляют 5 капель реактива Миллона и нагревают на спиртовке до кипения.

Реакция Паули. При взаимодействии в щелочной среде диазобензолсульфоновой кислоты с гистидином и тирозином наблюдается вишнево-красное окрашивание.

Ход определения: К 0,5 мл раствора белка добавляют 2-4 капли 10 % раствора Na2SO4 и несколько кристалликов диазобензолсульфоновой кислоты.

Реакция Адамкевича. Химическая основа реакции заключается в способности триптофана вступать в реакцию с альдегидами с образованием соединения, окрашенного в фиолетовый цвет.

Ход определения: К 0,5 мл раствора белка добавляют 0,5 мл ледяной уксусной кислоты. Перемешивают, осторожно наслаивают по стенке пробирки 2 мл концентрированной H2SO4 и ставят в кипящую водяную баню на 10 минут.

Реакция Сакагучи. При взаимодействии в щелочной среде аргинина с -нафтолом и гипобромитом в щелочной среде развивается розово-красное окрашивание, обусловленное присутствием в аргинине гуанидиновой группы.

Ход определения: К 0,5 мл раствора белка добавляют 0,5 мл 5 % раствора NaOH, 1-2 капли -нафтола и 1 каплю 1 % раствора гипобромита, перемешивают.

Реакция Фоля. Ион серы (S2-), образующийся из цистеина в щелочной среде, открывают

спомощью нитропруссидной реакции.

К10 каплям раствора белка добавляют 10 капель 20 % раствора NaOH. Нагревают на спиртовке до кипения и охлаждают. Добавляют 6-7 капель 5 % раствора нитропруссида натрия.

Биуретовая реакция. Биуретовая реакция открывает пептидную связь в белке. При проведении биуретовой реакции с белком развивается интенсивное сине-фиолетовое окрашивание, с продуктами неполного гидролиза белка (пептоны) – розовое, с аминокислотами окраска биуретового реактива не изменяется. Биуретовую реакцию способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. Биуретовая реакция обусловлена образованием биуретового комплекса в результате соединения меди (II) с пептидной группировкой белка. Степень окраски биуретового комплекса зависит от концентрации белка и от количества мед-

3

ной соли в растворе. Эта реакция применяется как для качественного, так и для количественного определения белка.

Ход определения: В сухую пробирку насыпают щепотку мочевины и нагревают на спиртовке. При этом мочевина превращается в биурет, который растворяют в 1,0 мл воды. Далее в четыре пробирки помещают соответственно по 3 капли растворов белка, пептона, аминокислот и биурета. Затем в каждую пробирку добавляют по 5 капель 10 % NaOH и по 2 капли 1 % сернокислой меди.

Наблюдать за развитием окраски. Почему растворы в пробирках имеют разную окраску? Биуретовая реакция широко используется для обнаружения белка в растворах и биологи-

ческих жидкостях, определения степени гидролиза белков. Эта же реакция лежит в основе унифицированного клинико-биохимического метода определения концентрации общего белка в сыворотке крови.

Определение свободных аминокислот важно для изучения обмена белков в организме. В норме с мочой выделяется до 0,5 г аминокислот. В плазме крови содержится около 21,42 ммоль/л аминокислот. Изменения в содержании аминокислот в моче и сыворотке крови наблюдаются при недостаточной функции печени (усиленном распаде белков, нарушении дезаминирования и переаминирования), а также при нарушении выделительной функции почек. Недостаток аминокислот сказывается в первую очередь на сердечной мышце.

Радиальная хроматография аминокислот. В основе хроматографического анализа аминокислот на бумаге лежит их различная растворимость в двух частично смешивающихся жидкостях, одна из которых является полярной (вода, содержащаяся в порах бумаги – неподвижный растворитель), а другая – неполярной (органический подвижный растворитель). В зависимости от степени гидрофобности различные аминокислоты перемещаются по бумаге с неодинаковой скоростью, что приводит к разделению смеси аминокислот.

Ход определения. В центре диска из хроматической бумаги делают круглое отверстие около 1 см в диаметре. Простым карандашом диск делят на 4 равные части, в отверстие вставляют трубочку из фильтровальной бумаги высотой 2 см. Отступив от центра на 1 см, в каждом секторе карандашом ставят точки и обозначают их цифрами. Затем на точки 1-3 секторов наносят капилляром небольшое количество растворов известных аминокислот. В 4-ый сектор наносят исследуемую смесь аминокислот. На дно чашки Петри наливают 10 мл водонасыщенного фенола и помещают туда диск так, чтобы бумажная трубочка была погружена в фенол. Чашку Петри накрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Когда фронт растворителя дойдет до края диска, его вынимают и высушивают при t=90100 oC в течение 5 минут. Далее диск смачивают 0,2 % раствором нингидрина и вновь помещают в сушильный шкаф на 5 минут. При этом аминокислоты проявляются в виде отдельных окрашенных полос в 4-ом секторе с расположением полос известных аминокислот (1-3 секторы), делают вывод об аминокислотном составе смеси.

Физико-химические свойства белков и методы их фракционирования

Белки обладают достаточно схожими физико-химическими свойствами, знание которых значительно облегчает представление о функционировании различных классов белков и молекул. Наибольшее значение имеют такие физико-химические свойства, как суммарный заряд белковой молекулы, соотношение полярных и неполярных групп на поверхности нативной молекулы белка, растворимость белков, молекулярная масса и форма молекул, электрофоретическая подвижность белков в постоянном электрическом поле, степень устойчивости к воздействию денатурирующих агентов.

Молекулярная масса белков варьирует от 5-10 тыс. до 1 млн. D и более. Молекулы белкового происхождения до 5000 D называются пептидами. Молекулярная масса зависит от количества аминокислотных остатков в белке и от количества протомеров в молекуле белка.

Суммарный заряд белковой молекулы определяется степенью ионизации функциональных групп, входящих в радикал аминокислот. В зависимости от соотношения ионизированных

4

ионных радикалов глутамата и аспартата, и катионных радикалов лизина, аргинина и гистидина формируется суммарный заряд белковой молекулы. Степень ионизации этих групп зависит от рН среды. При рН раствора около 7,0 все ионогенные группы белка находятся в ионизированном состоянии. Значение рН, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю, называется изоэлектрической точкой белка. Наличие суммарного заряда белков определяет растворимость белков, а также движение белков в электрическом поле.

Нарушение уникальной нативной конформации белка, приводящее к потере характерных для белка свойств, называется денатурацией.

Задача, с которой биохимикам постоянно приходится сталкиваться при исследовании биологических соединений, - это их выделение и очистка. Одним из наиболее удобных методов разделения является хроматографический метод, с помощью которого можно разделять как большие (несколько граммов), так и малые (пикограммы) количества материала.

Хроматографические методы применяют для сорбционно-динамического разделения смеси аминокислот, белков, углеводов, липидов и их метаболитов.

В зависимости от природы адсорбента и механизма разделения веществ хроматографические методы подразделяют на несколько видов: адсорбционная хроматография, распределительная хроматография, противоточное распределение, ионообменная хроматография, гельфильтрация, аффинная хроматография, распределение веществ с помощью мембран и полых волокон (диализ, ультрафильтрация, электродиализ).

Адсорбционная хроматография впервые была использована Цветом для разделения окрашенных веществ. В общепринятом смысле адсорбент – это твердое вещество, способное удерживать на своей поверхности молекулы. Сорбция веществ может быть специфической, что позволяет избирательно адсорбировать одно вещество из смеси. В основе разделения методом адсорбционной хроматографии лежат различия в степени адсорбции данных веществ адсорбентом и растворимости их в соответствующем растворителе. Эти свойства определяются в основном молекулярной структурой соединения.

Колонка для адсорбционной хроматографии представляет собой стеклянную трубку, заполненную адсорбентом. На колонку наносят подлежащую разделению смесь веществ, а затем пропускают через нее растворитель (или смесь растворителей). Разделение основано на том, что вещества с более высоким эффективным коэффициентом распределения продвигаются по колонке с большей скоростью, отделяясь таким образом от веществ с более низким коэффициентом.

Весь выходящий из колонки материал собирают в виде фракций, а затем анализируют их. В большинстве случаев вымывание осуществляется за счет увеличения полярности растворителя.

Для разделения очень малых количеств материала применяется метод тонкослойной хроматографии (ТСХ). При ТСХ слой адсорбента наносят на стеклянные пластинки. В отличии от колоночной хроматографии применяемые в ТСХ адсорбенты содержат связывающие агенты, например сернокислый кальций, что способствует лучшей фиксации их на стеклянной пластинке.

Эффективность разделения можно повысить с помощью двухмерной хроматографии. В этом случае пробу наносят в виде отдельного пятна в нижний угол пластинки и проводят разделение в одном направлении. Затем пластинку вынимают из камеры и высушивают, после чего хроматографируют в другой системе растворителей в направлении, перпендикулярном первому.

Метод распределительной хроматографии основан на распределении соединения между двумя жидкими фазами. Хроматографическая бумага обладает свойством поглощать воду из атмосферы и задерживать ее между своими целлюлозными волокнами. Эту воду можно рассматривать как один из растворителей; она представляет собой неподвижную фазу. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответ-

5

ствии с их коэффициентом распределения. Чем выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по бумаге вместе с растворителем, и наоборот.

При распределительной хроматографии на колонке в качестве носителя обычно применяют целлюлозу, крахмал, кремниевую кислоту или какие-либо другие соединения; неподвижная фаза, как правило, является водной. Чтобы разделение было успешным, носитель должен содержать определенное количество воды, некоторые из них – до 50 % (вес/объем).

Противоточное распределение основано на распределении соединений между двумя жидкими несмешивающимися фазами. Метод широко применяется для разделения различных видов нуклеиновых кислот, в частности для очистки некоторых видов РНК и стероидных гормонов. Применение метода для разделения аминокислот и пептидов обычно ограничивается препаративными целями, поскольку для аналитических целей существуют лучшие методы. Метод используется также для препаративного выделения антител пептидной и непептидной природы.

Вид ионообменной хроматографии основан на притяжении между противоположно заряженными частицами. В основе разделения многих биологических соединений, таких, как аминокислоты и белки, лежит тот факт, что эти соединения содержат способные к ионизации группы, которые обуславливают суммарный положительный или отрицательный заряд соединения; величина заряда зависит от рН и изоионной точки.

Разделение молекул по размерам и форме основано на свойствах молекулярного сита, которыми обладают многие пористые материалы. Наиболее часто для этой цели применяют органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой, придающей им свойства гелей. Разделение веществ при помощи гелей, основанное на различиях в размере молекул, называется гель-фильтрацией.

К материалам для гель-фильтрации относятся гели, в том числе и декстраны с поперечными сшивками (торговое название сефадекс), агарозные гели (сефароза, биогель А, сагавак), полиакриламидный гель (биогель Р), полиакрилоилморфин (энзокрил-гель) и полистиролы (БиоБидз S). Применяются также пористые стеклянные шарики (гранулы), известные под названием биоглас, и пористый кварц – порасил.

Очистка высокомолекулярных биологических соединений методом аффинной хроматографии основана на уникальном свойстве макромолекул – их биологической специфичности. Именно благодаря этой особенности с помощью аффинной хроматографии теоретически можно получить абсолютно чистые вещества в отличие от таких методов разделения, как проникающая хроматография и электрофорез, основанных на физико-химических свойствах макромолекул (которые у отдельных молекул могут быть практически одинаковыми).

До настоящего времени аффинная хроматография применялась в основном для очистки белков, но ее в равной степени можно использовать и для очистки антигенов и антител, витаминов и гормонов, белков, связывающих лекарственные вещества, рецепторы лекарственных веществ, транспортных белков, полирибосомальных и полиферментных комплексов и репрессоров.

В биохимической практике часто возникает необходимость сконцентрировать водные растворы макромолекул и удалить из них мелкие неорганические ионы. Иногда для этих целей применяют сухой гель, например сефадекс G-25, однако самый распространенный способ концентрирования веществ – использование специальных мембран.

Разность давлений по обе стороны мембраны создается путем повышения давления со стороны фильтруемого раствора или понижения его в ультрафильтрате. Ультрафильтрацию можно проводить непрерывно и фильтровать большие объемы.

Метод электродиализа сходен с электрофорезом, с той лишь разницей, что движение макромолекул ограничивается мембраной. Существует целый ряд приборов для электродиализа, различающихся расположением электродов и типом применяемых мембран.

Многие важные в биологическом отношении молекулы, такие, как аминокислоты, пептиды, белки и нуклеиновые кислоты, содержат ионизирующиеся группы, поэтому в растворе они могут существовать в заряженной форме, в виде катионов (+), либо анионов (-). Кроме того,

6

молекулы с близкими по величине зарядами, но различающимися молекулярными весами отличаются друг от друга отношением заряда к массе. На всех этих различиях основано разделение ионов при движении их в растворе под действием электрического поля; в этом и состоит принцип электрофореза.

Очистка белков с помощью диализа. Чтобы удалить из исследуемого раствора молекулы растворенного вещества, его помещают в целлюлозный мешочек и погружают в чистый растворитель (воду или буферный раствор). Малые молекулы будут выходить из мешочка в растворитель до тех пор, пока их концентрации по обе стороны мембраны не выравняются.

В основу метода положена неспособность белков проходить через полупроницаемую мембрану.

Ход определения. В мешочек из целлофана вносят 2 мл раствора белка и 2 мл 10% раствора глюкозы. Мешочек погружают в стакан с дистиллированной водой. Через30 мин вносят в пробирку 3 капли воды из стаканчика и проводят биуретовую реакцию на белок (см. занятие «Структура и функции белков»). При нагревании пробирки над пламенем спиртовки до кипения (реакция Фелинга) в случае присутствия в растворе глюкозы образуется жёлто-красный осадок. На основании полученных результатов делают вывод о проницаемости мембраны для белков и низкомолекулярных соединений.

Диализ используют для очистки белковых препаратов от низкомолекулярных соединений. Этот метод положен в основу работы аппарата «Искусственная почка».

Определение изоэлектрической точки казеиногена. Казеиноген обладает свойствами кислоты и в молоке находится в виде анионов, растворимых в воде (кальцинат казеиногена).

В основу метода положено свойство белков выпадать в осадок в буферном растворе, pH которого соответствует изоэлектрической точке исследуемого белка.

Ход определения. В 5 пробирок вносят по 2,5 мл буферных растворов с pH 3,7; 4,1; 4,7; 5,3; 5,6. Во все пробирки добавляют по 0,5 мл 0,4 % раствора казеиногена и перемешивают. На основании полученного результата делают вывод об изоэлектрической точке казеиногена.

Чем можно объяснить свертывание молока в результате выпадения в осадок казеиногена при подкислении молока до рН 4,7.

Высаливание белков. Высаливание – обратимая реакция осаждения белков из растворов с помощью больших концентраций нейтральных солей: NaCl, (NH4)2SO4, MgSO4.

При высаливании происходят дегидратация макромолекул белка и устранение заряда. На процесс высаливания влияет ряд факторов: гидрофильность белка, его относительная молекулярная масса, заряд, в связи с чем для высаливания различных белков требуется разная концентрация одних и тех же солей. Альбумины осаждаются в растворе (NH4)2SO4, а глобулины – в полунасыщенном растворе (NH4)2SO4, так как у глобулинов бόльшая относительная масса, чем у альбуминов.

Высаливание белков является обратимой реакцией, так как осадок белка может вновь растворяться после уменьшения концентрации солей путем диализа или разведением водой. Хлорид натрия осаждает белки слабее, чем сульфат аммония, вследствие меньшей дегидрадирующей способности, которая характеризуется положением ионов в ряду Гофмейстера:

SO42- > Cl- > Br- > NO3- > I- > CNS-

Ca2+ > Li+ > Na+ > K+ > Rb+ > Cs+

Ход определения. В пробирку вносят 1 мл раствора белка и 1 мл насыщенного раствора сернокислого аммония, перемешивают. К образовавшемуся осадку добавляют 5 мл дистиллированной воды. На основании полученных результатов делают вывод о процессе высаливания белков.

Метод высаливания широко используется для фракционирования смесей различных белков. Глобулины, например, осаждаются в полунасыщенном растворе сернокислого аммония, а альбумины - в насыщенном растворе этой соли. Метод фракционного высаливания используют для разделения более сложных белковых смесей - сыворотки крови, экстрактов печени, мышц, почек и др.

7

Денатурация белков. Денатурация белка (необратимое осаждение) сводится к разрушению структуры белка и потере им биологических свойств. При необратимых реакциях осаждения белки претерпевают глубокие изменения и не могут быть растворимы в первоначальном растворителе. К необратимым реакциям относят осаждение белка солями тяжелых металлов, минеральными и органическими кислотами, алкалоидными реактивами и осаждение при кипячении.

Осаждение белков солями тяжелых металлов в отличие от высаливания происходит при небольших концентрациях солей. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя солеобразные и комплексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исключением солей AgNO3, HgCl2), но не растворимые в воде. Растворение осадка в избытке солей называется адсорбционной пептизацией. Данное явление происходит вследствие возникновения одноименного положительного заряда на частицах белка. Способность белка прочно связывать ионы тяжелого металла в виде нерастворимых осадков в воде используется как противоядие при отравлениях солями ртути, меди, свинца и др. Сразу после отравления обычно применяют белки молока или яиц, пока еще эти соли находятся в желудке и не успели всосаться.

Качественная реакция с концентрированной азотной кислотой лежит в основе количественного определения белка в моче по методу Робертса – Стольникова – Брендберга.

Ход определения. В 4 пробирки вносят по 1 мл раствора белка, после чего добавляют соответственно по 3 капли 5 % раствора уксуснокислого свинца, концентрированной азотной кислоты, 10 % раствора трихлоруксусной кислоты и 20 % раствора сульфосалициловой кислоты. Пробирки встряхивают и добавляют по 2 мл дистиллированной воды. На основании полученных результатов делают вывод о процессе денатурации.

Денатурацию широко используют в клинической практике для качественного и количественного обнаружения белка в моче и цереброспинальной жидкости. Чаще всего для этих целей применяют трихлоруксусную, сульфосалициловую и азотную кислоты.

Фракционирование смеси декстрана, гемоглобина и бромфенолового синего методом гель-фильтрации. В основу метода положена разная способность веществ, в зависимости от их молекулярной массы, проходить через слой сефадекса. Скорость прохождения исследуемых веществ находится в пропорциональной зависимости от величины их молекулярной массы.

Ход определения. Для работы используют хроматографическую колонку, заполненную набухшим в физиологическом растворе сефрадексом G-100. Нижний зажим на колонке открывают и сливают слой физиологического раствора над гелем. Зажим закрывают, а на по-

верхность геля наслаивают 0,5 мл смеси ?голубого декстрана (не доливают, т.к. маленькие пробирки)?, гемоглобина и бромфенолового синего. Открывают зажим и после того, как смесь войдёт в гель, его снова закрывают и осторожно по стенке заполняют всю колонку над сефрадексом физиологическим раствором. Открыв зажим, наблюдают разделение нанесённых веществ и делают вывод об относительных величинах их молекулярных масс.

Биохимия простых и сложных белков

Белки – важнейший класс биологически активных веществ. Они играют ключевую роль в клетке, присутствуют в виде главных компонентов в любых формах живой материи, будь то микроорганизмы, животные или растения. Белки чрезвычайно разнообразны по структуре и выполняют многочисленные биологические функции. По составу белки делятся на простые, состоящие только из аминокислотных остатков, и сложные.

По физико-химическим свойствам просты белки можно разделить на протамины и гистоны – белки с небольшой молекулярной массой(5-12 тыс. Д), проламины и глютелины – белки, растовярющиеся в 60-80%-ном растворе этанола, альбумины и глобулины – белки, животного происхождения. Альбумины и глобулины присутствуют в плазме крови, и отличаются по растворимости в растворах сульфата аммония (NH4)2SO4. В полунасыщенном растворе

8

сульфата аммония глобулины нерастворимы, а альбумины раствояются. Различие по растворимости широко используется в клинической практике для их фракционирования и количественного определения.

Сложные белки могут включать ионы металла (металлопротеины), пигмент (хромопротеины), образовывать прочные комплексы с липидами (липопротеины), нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеины), а также ковалентно связывать остаток фосфорной кислоты (фосфопротеины), углевода (гликопротеины) или нуклеиновой кислоты (геномы некоторых вирусов).

К группе хромопротеинов относятся гемопротеины, магнийпорфирины и флавопротеины. Хромопротеины играют важную роль в окислительно-восстановительных реакциях и в дыхательной цепи. К хромопротеинам относится гемоглобин крови, миоглобин мышц, некоторые ферменты (каталаза, пероксидаза, цитохромы). Молекула гемоглобина состоит из белка

– глобина и пигментной части – гема. По химической природе гем - соединение протофорфирина с двухвалентным атомом железа, способным при определенных условиях переходит в трехвалентное, например, метгемоглобин. Видовая специфичность гемоглобина зависит от белковой части глобина, а гем имеет одинаковое строение во всех гемоглобинах. Молекула гемоглобина взрослого человека состоит из двух пар полипептидных цепей, обозначаемых как α- и β-цепи. Каждая пептидная цепь имеет гемовый карман, где помещается гем. Поэтому в каждой молекуле гемоглобина содержит четыре молекулы гема и четыре атома железа. Таким образом, гемоглобин имеет четвертичную структуру.

Нуклеопротеины являются комплексом нуклеиновых кислот с белками. Нуклеопротеины бывают двух типов – дезоксирибонуклеопротеины и рибонуклеопротеины. ДНК и РНК – биополимеры с высокой молекулярной массой, построены из большого количества мононуклеотидов, соединенных друг с другом 3,5 – фософодиэфироной связью. Мононуклеотид в свою очередь, состоит из пуринового или пиримидинового основания, углевода (рибоза или дезоксирибоза) и фосфорной кислоты. Биологическая роль нуклеопротеинов огромна. Они являются структурными элементами клетки, её ядра и цитоплазмы, и выполняют специфические функции в живом организме. Деление клеток, передача наследственной информации, а так же биосинтез белков связаны с нуклеопротеинами.

Качественная проба на пуриновые основания. Пуриновые основания в реакции с ионами меди образуют соединения желто-зеленого цвета.

Ход определения. К 1,0 мл гидролизата дрожжей прибавляют 5-6 капель 10 % раствора уксусной кислоты до покраснения синей лакмусовой бумаги. Нагревают на спиртовке и доливают 0,5 мл 10 % раствора СиSO4 и 6 капель насыщенного раствора бисульфита натрия, перемешивают и снова нагревают.

Качественная проба на фосфорную кислоту. При взаимодействии фосфорной кислоты с молибденовокислым аммонием в кислой среде образуется фосфорномолибденовокислый аммоний, в реакции которого с эйконогеном развивается синие окрашивание.

Ход определения. К 0,5 мл гидролизата дрожжей прибавляют 1,5 мл 2,5 % раствора (NН4)2МoO4, 2 капли концентрированной НNОз и нагревают на спиртовке до кипения. Охлаждают и добавляют 3 капли 1 % раствора эйконогена.

Качественная проба на гемоглобин. Реакция основана на способности гемоглобина катализировать окисление бензидина перекисью водорода в соединение, окрашенное в синий цвет. Эта реакция очень чувствительна и служит для обнаружения минимальных количеств крови в биологических жидкостях. Она имеет широкое применение в судебной медицине.

Ход определения. К 0,5 мл разбавленной крови добавляют 5 капель 0,2 % раствора бензидина и 5 капель 3 % Н2О2.

Количественное определение гемоглобина крови гемиглобинцианидным методом.

Гемоглобин при взаимодействии с железосинеродиродистым калием окисляется в метгемоглобин, образующий с ацетонциангидрином гемиглобинцианид. Интенсивность окраски пропорциональна количеству гемоглобина.

9

Ход определения. В пробирку наливают 0,02 мл крови, прибавляют 5,0 мл трансформирующего раствора, содержащего железосинеродистый калий и ацетонциангидрин, перемешивают. Через 10 мин опытную пробу и стандартный раствор метгемоглобинцианида, входящий в состав набора для определения, фотометрируют на ФЭКе против трансформирующего раствора с зеленым светофильтром (540 нм) в кювете с толщиной оптического слоя 10 мм.

Расчет. Содержание гемоглобина в цельной крови вычисляют по формуле:

Íb , ã/ ë Åîï . 0.6 251 Åîï . 150,6

Åñò . Åñò .

где Eоп и Ест – экстинции опыта и стандарта;

0,6 - концентрация метгемоглобинцианида в стандартном растворе, г/л; 251 - разведение крови.

Норма содержания гемоглобина в цельной крови составляет: ?у мужчин – 135-180 г/л,

у женщин – 120-160 г/л (в Руков-ве другие значения)?. Определение концентрации гемоглобина в крови является одним из основных лабораторных исследований для оценки анемических состояний, при которых отмечается понижение его уровня.

Определение концентрации неорганического фосфора в сыворотке крови спек-

трофотометрическим методом. Метод основан на способности фосфатионов образовывать с молибдатом аммония фосфорно-молибдатный комплекс, оптическая плотность которого при длине волны 340 нм пропорциональна концентрации неорганического фосфора в исследуемом образце.

Исследуемый материал. Негемолизированная, нелипемичная сыворотка или плазма (гепарин, ЭДТА) крови. Моча, разбавленная в 10 раз дистиллированной водой; результат умножить на разведение.

Проба может храниться 8 часов при комнатной температуре, 24 часа при 2-8 0С.

Состав набора

Реагент № 1 – молибденовый реагент: кислота серная – 0,38 М, натрий хлористый – 0,15 М, аммоний молибденовокислый – 1,9 мМ (200 мл).

Реагент № 2 – детергент (2,5 мл).

Калибратор – 1,615 ммоль/л (5 мг/100 мг), (2 мл).

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность. Невскрытые реагенты №1 и № 2 стабильны в течение 12 месяцев при комнатной температуре. Дата изготовления, серия и номер по каталогу указаны на упаковке.

Для приготовления рабочего реагента необходимо смешать количество реагента № 1 и № 2 в соотношении 100:1. Рабочий реагент стабилен при температуре 18-25 0С в темном месте в течение двух недель.

Калибратор готов к применению, стабилен в течение 12 месяцев при температуре 1825 0С. Необходимо плотно закрывать флаконы после каждого использования реагентов.

Процедура анализа

Пробы перемешивают и инкубируют в течение 5 минут при температуре 18-25 0С. Измеряют оптическую плотность калибровочной и опытной проб против контрольной пробы при длине волны 340 нм. Величина оптической плотности стабильна в течение часа.

Расчет

10