Литература / Руководство БХ

нуклеиновые кислоты, липиды. Поскольку при окислительном стрессе повреждение клеток во многом объясняется нарушением мембранных процессов, основу структуры которых составляют липиды, отдельно рассматривается понятие перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Принцип метода основан на колориметрическом определении концентрации гемоглобина, освобождающегося из эритроцитов вследствие повреждения их мембран при генерации образования свободных радикалов в системе Fe-аскорбат-эргокальциферол. Интенсивность окраски проб пропорциональна степени разрушения эритроцитов и тем меньше, чем лучше функционирует система антиоксидантной защиты клеток. Для количественного определения степени разрушения эритроцитов проба с перекисным гемолизом сравнивается с пробой, где создаются условия для 100% го распада эритроцитов. Большой интерес представляет и определение степени спонтанного гемолиза эритроцитов,находящихся в удовлетворительных для жизнедеятельности условиях (физиологический раствор).

Ход определения

Пробы осторожно перемешивают и инкубируют в термостате при 37 C в течение 30 мин. После инкубации пробы, в которых исследовался перекисный и спонтанный гемолиз, центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об./мин. Надосадочную жидкость этих проб и пробу со 100 % гемолизом фотометрируют против дистиллированной воды на ФЭКе с зеленым светофильтром (500 560 нм) в кювете с толщиной оптического слоя 5 мм, определяя экстинкции проб с гемолизом: E1 - перекисным, E2 - спонтанным, E3 - 100%ным. При слишком высоких значениях экстинкции все пробы разводят в соотношении 1:1 с дистиллированной водой и измерения повторяются.

Расчет результатов

X1 - перекисный гемолиз эритроцитов, %; X2 - спонтанный гемолиз эритроцитов, %:

Нормальные величины спонтанного гемолиза не превышают 1 2 %. Величина перекисного гемолиза эритроцитов ∆Х здорового человека составляет 30 50 %, что свидетельствует о нормальном функционировании про- и антиоксидантной систем в клетках. Величина перекисного гемолиза более 50 % является признаком поражения мембран эритроцитов, что наблюдается при развитии лучевой болезни (действие ионизирующей радиации) и некоторых отравлениях (боевыми ОВ, гемолитическими ядами и т.д.).

Биосинтез липидов

31

Биосинтез липидов активно протекает в абсорбтивный период в жировой ткани и печени. В печени осуществляется синтез триглицеридов, фосфолипидов, синтез липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП), высокой плотности (ЛПВП), синтез холестерина и его эфиров, синтез желчных кислот из холестерина, синтез жирных кислот и кетоновых тел, окисление жирных кислот (β-окисление), в результате которого в кровь поступают молекулы ацетоуксусной кислоты, используемые другими тканями.

Непосредственными субстратами в синтезе жиров являются ацетил-КоА (из которого синтезируется жирные кислоты) и глицерол – фосфат. Главным источником ацетил-КоА является глюкоза, однако возможны и другие предшественники, например аминокислоты.

Важно отметить, что биосинтез жиров в печени и жировой ткани стимулируется инсулином, который обеспечивает поступление глюкозы в соответствующие клетки и ее окисление по пути гликолиза. В печени идет синтез жирных кислот из продуктов гликолиза. В ней часть углеводов, поступающих с пищей, превращаются в жиры, которые секретируются в кровь в виде липопротеидов очень низкой плотности. А в жировой ткани для синтеза жиров используются в основном уже готовые жирные кислоты, освободившиеся при гидролизе липопротеидов очень низкой плотности и триглицеридов хиломитрон, а также идет синтез жирных кислот из продуктов распада глюкозы.

Биосинтез жирных кислот протекает в цитоплазме. Первая стадия – карбоксилирование ацетил-КоА с образованием малонилКоА – катализируется ацетилкоэнзимкарбоксилазой. Это ключевой фермент биосинтеза жирных кислот. Биосинтез длинноцепочечных жирных кислот осуществляется мультиферментным комплексим – синтазой жирных кислот. Под действием этого комплекса ферментов цепь удлиняется путем добавления малланильных групп и отщепления СО2 (процесс включает 7 реакций) с образованием пальметиновой кислоты. В результате каждой реакции молекула удлиняется на 2 углеродных атома. В качестве восстановителей используется НАДФ Н2, образующийся в основном в пентозофосфатном пути.

Биосинтез 3-ацилглицеролов идет через образование промежуточного продукта - фосфатидной кислоты. Предшественник фосфатидной кислоты – глицерол-3-фосфат, который в свою очередь образуется в жировой ткани восстановлением дигидроксиацетонфосфата (ДАФ, метаболит гликолиза), а в клетках печени еще и фосфорилированием свободного глицерола ферментом глицеролкиназой по реакции:

глицеролкиназа

глицерин + АТФ глицерол-3-фосфат.

С участием активированных жирных кислот и 3-фосфоглицерола образуется фосфатидная кислота. После гидролитического отщепления фосфатной группы (образуется диацилглицерин) и последующего присоединения еще одной молекулы активной формы жирной кислоты образуются триацилглицериды (жиры).

Из фосфатидных кислот также через промежуточные образования триацилглицериды синтезируются фосфолипиды. Для биосинтеза фосфотидилхолина холин фосфорилируется АТФ в холинфосфат, который с отщеплением от ЦТД дифосфата переходит в ЦДФ-холин. Из ЦДФ-холина холинфосфат переносится на диацилглицерил с образованием фосфотидилхолина. По аналогичной реакции диацилглицерина и ЦДФ-этаноламина образуется фосфатидилэтаноламин.

Биосинтез холестерина начинается с ацетил-КоА. Его можно разделить на 4 этапа:

1)из трех молекул ацетил-КоА образуется мелалоновая кислота (С6);

2)мелалоновая кислота превращается в изопентилпирофосфат (активный изопрен);

3)6 молекул изопрена полимеризуются с образованием сквалена (С30);

4)Сквален циклизуется с отщеплением 3 атомов углерода и превращанется в холесте-

рин (С27).

Восстановителем при образовании мелалоновой кислоты, сквалена, а также на последних стадиях биосинтеза холестерина является НАДФ Н2.

Таким образом, холестерин синтезируется из 18 молекул СН3―С~КоА, 14 мол НАДФ·Н2 и 18 молекул АТФ.

32

Биосинтез холестерина локализован в гладком эндоплазматическом ретикулуме. Ключевым ферментом биосинтеза холестерина является 3-ГМГ-КоА-редуктаза, образующая мелалоновую кислоту. Путем подавления биосинтеза этого фермента холестерина (гидроксистеринами), а также за счет фосфорилирования и дефосфорилирования фермента некоторыми гормонами осуществляется регуляция биосинтеза холестерина.

Холестерин и его эфиры встречаются в крови и различных тканях животных: в головном мозге, кожном сале, желчи. Особенно много синтезируется холестерина в печени, почках, надпочечниках, артериальной стенке.

Холестерин используется в синтезе желчных кислот, стероидных гормонов, встраивается в клеточные мембраны. Эндогенный холестерин синтезируется в организме в количестве 0,8-2 г в сутки, кроме того холестерин поступает с пищей (экзогенный) в количестве 0,3-0,5 г.

Повышение уровня фосфолипидов в сыворотке крови наблюдается при тяжелой форме сахарного диабета, нефрозах, хронических нефритах, эссенциальной гиперлипемии, а также при застойной желтухе, печеночной коме, постгеморрагических анемиях. Снижение уровня фосфолипидов отмечается при атеросклерозе, малокровии, острых лихорадочных состояниях, алиментарной дистрофии, истощении.

При нарушении жирового обмена холестерин может накапливаться в крови. Увеличение содержания холестерина в крови (гиперхолестеринемия) наблюдается при атеросклерозе, сахарном диабете, механической желтухе, нефрите, нефрозе (особенно при липоидных нефрозах), гипотиреозе. Понижение холестерина в крови (гипохолестеринемия) наблюдается при анемиях, голодании, туберкулезе, гипертиреозе, раковой кахексии, паренхиматозной желтухе, поражении центральной нервной системы, лихорадочных состояниях, при введении инсулина.

Увеличение β-липопротеидов наблюдается при атеросклерозе, механической желтухе, острых гепатитах, хронических заболеваниях печени, диабете, гликогеновой болезни, ксантоматозе и ожирении. Уменьшение β-липопротеиновой фракции описано при β2-плазмоцитоме.

Определение содержания общего холестерина в сыворотке крови. Реактив, содер-

жащий 2,5-диметилбензолсульфоновую кислоту, взаимодействует с холестерином с образованием сине-зеленого окрашивания, которое измеряют фотометрически.

Ход определения.

Быстро перемешивают и пробирку оставляют стоять еще 10 мин. Потом раствор переливают в сухую кювету и измеряют оптическую плотность эталона и пробы против раствора сравнения в 1 см кювете при 610 нм

Расчет результатов

По оптической плотности пробы (А) и эталона (Б) рассчитывают содержание холестерина х в моль/л сыворотки по формуле:

х = А/В•5,17

Нормальные величины и воспроизводимость метода

У взрослых (4,65 – 6,46) моль/л У детей несколько ниже, чем у взрослых Воспроизводимость метода около ±4%

Определение содержания фосфолипидов в сыворотке крови по методу Зиль-

версмита и Дэвиса. Фосфолипиды - группа сложных липидов, содержащих в своем составе

33

остаток фосфорной кислоты. В отличие от триглицеридов, фосфолипиды никогда не запасаются в больших количествах и являются структурными компонентами мембран всех клеток.

Об общей концентрации фосфолипидов (ФЛ) судят по содержанию в них липидного фосфора (ЛФ), на долю которого в среднем приходится 4 % от молекулярной массы всех фосфолипидов. Липидный фосфор определяют после осаждения белков сыворотки крови трихлоруксусной кислотой (ТХУ), когда вместе с белками осаждаются и фосфолипиды. Содержание фосфора в полученном осадке (минерализате) определяют фотометрически.

Ход определения.

Минерализат получают следующим образом. 0,2 мл сыворотки крови больного смешивают с 1,8 мл 3 % трихлоруксусной кислоты, пробирку тщательно встряхивают, центрифугируют 10 мин при 3000об/мин, надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют с

2 мл 0,9 % раствора NaCl . ?можно не писать,т.к.дают готовый

Пробы перемешивают и помещают в термостат при температуре 37 0С на 15 минут. Затем опытную и стандартную пробу фотометрируют на ФЭКе против воды с красным светофильтром (610 нм) в кювете с толщиной оптического слоя 10 мм.

Расчет.

где Eоп и Eст - экстинкции опыта и стандарта;

0,02 - количество фосфора, содержащееся в 2 мл стандартного раствора, мг; 0,2 - количество сыворотки, соответствующее 2 мл минерализата, мл; 1000 - расчет на 1 л сыворотки; 31 - молекулярная масса фосфора.

Содержание общих фосфолипидов в сыворотке рассчитывается по формуле:

где 25 – коэффициент пересчета липидного фосфора на содержание фосфолипидов; 1000 – (в знаменателе) – пересчет в граммы.

У здоровых взрослых людей нормальные величины липидного фосфора составляют 25 ммоль/л, общих фосфолипидов - 1,5-3,5 г/л. Повышение уровня фосфолипидов в сыворотке крови наблюдается при тяжелых формах сахарного диабета, нефрозе, хроническом нефрите, эссенциальной гиперлипемии, желтухах, постгеморрагической анемии, печеночной коме и др. заболеваниях. Снижение уровня фосфолипидов отмечается при атеросклерозе, острых лихорадочных состояниях, алиментарной дистрофии, острых гепатитах, портальном циррозе и жировой дегенерации печени, острой лучевой болезни, тяжелых формах ожогов, длительно незаживающих ранах.

Взаимосвязь углеводного и пептидного обменов. (Семинар)

34

Вопросы для самоподготовки.

1.Какова роль углеводов и липидов в организме? Суточный рацион.

2.Какой биохимический процесс является конечным путем для окисления общего промежуточного метаболита углеводного и липидного обменов?

3.На какое звено в углеводном и липидном обмене действует адреналин?

4.Объясните механизм действия инсулина на обмен углеводов и липидов.

5.На какие звенья углеводного и липидного обменов влияют глюкокортикоиды?

6.Из каких метаболитов липидного обмена может синтезироваться глюкоза и как это происходит?

7.Определите суммарный выход АТФ при полном аэробном окислении триглицерида, включающего пальминовую (R1), олеиновую(R2) и стеариновую кислоты(R3).

8.Определите суммарный выход АТФ (с учетом затрат) при окислении шести атомов углерода жирной кислоты и шести атомов углерода глюкозы при их аэробном окислении.

9.Напишите схемы превращений глицерина и жирных кислот.

10.Какова причина кетонемии и кетонурии? Пути синтеза и использования в организме кетоновых тел.

11.Напишите реакции превращений двух молекул лактата и двух молекул глицерина в остаток глюкозы и введите их в состав гликогена.

12.Напишите уравнения биосинтеза трипальмитина из глюкозы. Назовите витамины и гормоны, регулирующие этот процесс.

13.Напишите уравнения и подсчитайте количество молекул макроэргов, необходимых для биосинтеза одной молекулы дипальмитилфосфатидилхолина из глицерина, серина и метионина.

14.Напишите уравнения биосинтеза холестерина из ацетилКоА. Сколько АТФ необходимо для образования одной молекулы холестерина? Как регулируется этот процесс? Ключевой фермент синтеза холестерина?

15.Напишите процесс образования глюкозы (гексозы) и синтеза жирной кислоты с шестью углеродными атомами из пировиноградной кислоты. В каких компартаментах клетки протекают эти процессы?

16.Сколько молекул АТФ образуется при полном окислении до СО2 и Н2О следующих соединений: а) фосфоенолпирувата; б) глицерина; в) глицеральдегид-3-фосфата. Напишите соответствующие реакции.

17.Напишите уравнения биосинтеза пальмитолеиновой кислоты из: а) пирувата; б) глюкозы; в) глицерина. В каком компартаменте клетки протекает этот процесс?

18.Напишите уравнение биосинтеза дипальмитилфосфатидилсерина из глюкозы и сери-

на.

19.Какие тесты лабораторной диагностики позволяют выявить различные формы сахарного диабета?

20.Составьте схему нарушений метаболизма углеводов и липидов при сахарном диабете.

21.Состав липопротеинов и их концентрация в крови? Назовите функции ЛПНП и ЛПВП. Гипер- и дислипопротеинемии.

22.Регуляция уровня холестерина с учетом рациона питания. Регуляция ключевого фермента синтеза холестерина. Роль лецитинхолестеролацилтрансферазы (ЛХАТ).

23.Факторы и этапы развития атеросклероза. Молекулярные механизмы.

24.На каждую незаконченную фразу выберите одно или несколько верных завершений. В цепи превращений: 2-ацетил-КоА → ацетоацетил-КоА → Х → мевалоновая кислота →

3-фосфо, 5-пирофосфомевалоновая кислота → изопентенилпирофосфат → Y → геранилпирофосфат → Z → сквален → ланостерин → холестерин. Х, Y, Z представляют собой: а) фарнезилпирофосфат; б) β-гидрокси-β-метилглутарил-КоА; в) 3,3-диметилаллилпирофосфат.

25. Переход от 3-фосфоглицериновой кислоты к высшим жирным кислотам и стеролам осуществляется через: а) ацетил-КоА; б) α-глицерофосфат; в) 1,3-дифосфоглицерат; г) 3- фосфоглицериновый альдегид; д) диоксиацетонфосфат.

35

26.В цепи превращений: высшая жирная кислота → ацетил-КоА → яблочная кислота →

Х→ аспартат, Х представляет собой: а) фумарат; б) α-кетоглутарат; в) сукцинат; г) пируват; д) оксалоацетат.

27.В цепи превращений: глицерин → α-глицерофосфат → Х → 3-фосфоглицериновый альдегид, Х представляет собой: а) диоксиацетонфосфат; б) 3-фосфоглицерат; в) 2- фосфоглицерат; г) 1,3-дифосфоглицерат; д) пируват. Написать подробно реакции.

28.метаболизм глюкозо-6-фосфата в клетке.

29.метаболизм пировиноградной кислоты в организме.

30.Метаболизм ацетил-КоА в клетке.

Обмен белков

Обмен белков и аминокислот

Белковый обмен имеет особое значение в многообразных превращениях веществ. В тканях наблюдается высокая скорость обновления белков, свидетельствующая о том, что в организме происходит постоянное смешивание аминокислот, образованных при катаболизме белков, и белков, поступающих с пищей. Наблюдается в клетках и обмен аминокислот, который можно условно разделить на общий обмен и индивидуальное превращение аминокислот.

Общими для аминокислот являются реакции трансаминирования, декарбоксилирования, дезаминирования (окислительного и неокислительного), биосинтеза и рацемизации.

Реакции трансаминирования играют в обмене веществ важную разнообразную роль. От них зависят такие процессы, как биосинтез аминокислот – трансаминированием завершается синтез не менее 11 аминокислот, распад аминокислот, объединение путей углеводного и аминокислотного обменов, распад некоторых специфических соединений, в том числе мочевины и γ-аминомасляной кислоты.

Ферменты, принимающие участие в реакциях трансаминирования, называются трансаминазами. Определение активности двух ферментов этого класса в сыворотке крови: аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы – приобрело важное клиническое значение. Они являются индикаторными ферментами и служат маркерами поражения клеток определенных органов, в первую очередь печени и миокарда, при различных патологических процессах.

Определение активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови методом Райтмана-Френкеля.

Принцип метода

Под действием фермента аланинаминотрансферазы (АЛТ) в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аланина на α-кетоглутарат. Активность АЛТ пропорциональна количеству образовавшихся динитрофенилгидразонов пирувата в щелочной среде, которое определяется фотометрически.

Схема реакции

АЛТ

L-аланин + α-кетоглутарат пируват + L-глутамат

Исследуемый материал

Свежая сыворотка без следов гемолиза. Активность фермента в сыворотке снижается после 3-х дней хранения при температуре 2-8 0С на 10 %, при температуре 18-25 0С на 17 %.

Состав набора

Реагент № 1 – буфер-субстратный раствор. Реагент № 2 – раствор 2,4 – ДНФГ. Реагент № 3 – натр едкий.

Калибратор (раствор пирувата натрия) – 1,0 ммоль/л.

36

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность

Реагенты №№ 1,2 и калибратор готовы к применению. Калибратор после вскрытия флакона стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 0С. Содержимое флакона № 3 (или аликвоту) следует развести бидистиллированной водой в 10 раз; хранить в полиэтиленовой таре.

Срок хранения набора – 12 месяцев при температуре 18-25 0С. Дата изготовления, серия и номер набора по каталогу указаны на упаковке.

Необходимо тщательно закрывать флаконы непосредственно после каждого использования реагентов.

Процедура анализа

Пробы перемешивают и инкубируют 20 минут при комнатной температуре (18-25 0С). Затем в пробирки вносят по 2,5 мл разведенного реагента № 3, перемешивают реакционную смесь и через 10 минут (18-25 0С) измеряют оптические плотности опытных и соответствующих контрольных проб против дистиллированной воды при длине волны 537 нм (500-560 нм).

Расчет

Активность аланинаминотрансферазы выражается в единицах, которые определяются количеством образовавшегося пирувата (моль или мкмоль) за единицу времени (час или секунда) в единице объема (литр) биологической жидкости.

Расчет активности (А) фермента проводится по формуле:

А = (Еопыт - Еконтр) х К

где: Еопыт – оптическая плотность опытной пробы, Еконтр – оптическая плотность соответствующей контрольной пробы,

К– коэффициент, рассчитанный по калибровочному графику.

При активности фермента, превышающей 4 ммоль/(ч х л) или 1,112 мкмоль (с х л),

сыворотку крови рекомендуется развести физиологическим раствором и учесть степень разведения при расчете.

Построение калибровочного графика

Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Инкубируют при комнатной температуре (18-25 0С). Затем во все пробирки вносят по 5,0 мл разведенного реагента № 3, перемешивают реакционную смесь и через 10 минут (18-25 0С) измеряют оптические плотности калибровочных растворов против контроля при длине волны 537 нм (500-560 нм).

37

Строят график зависимости оптической плотности от активности фермента. По калибпровочному графику рассчитывают коэффициент К = А/Е, где А –активность фермента, взятая из таблицы, Е – экстинция соответствующей калибровочной пробы.

Нормальные показатели

АЛТ – до 0,19 мкмоль (с х л)или до 0,68 ммоль/(ч х л).

Аналитическая характеристика набора

Линейность – до 1,688 мкмоль (с х л) или 6,0 ммоль (ч х л). Воспроизводимость – коэффициент вариации не более 10 %.

Определение активности аспартатаминотрансферазы (АСТ) в сыворотке крови методом Райтмана-Френкеля.

переаминирования происходит перенос аминогруппы с аспартата на α-кетоглутарат. Активность АСТ пропорциональна количеству образовавшихся динитрофенилгидразонов пирувата и оксалоацетата в щелочной среде, которое определяется фотометрически.

Схема реакции

АСТ

L-аспартат + α-кетоглутарат оксалоацетат + L-глутамат

Исследуемый материал

Свежая сыворотка без следов гемолиза. Активность фермента в сыворотке снижается после 3-х дней хранения при температуре 2-8 0С на 10 %, при температуре 18-25 0С на 17 %.

Состав набора

Реагент № 1 – буфер-субстратный раствор. Реагент № 2 – раствор 2,4 – ДНФГ. Реагент № 3 – натр едкий.

Калибратор (раствор пирувата натрия) – 1,0 ммоль/л.

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность

Реагенты №№ 1,2 и калибратор готовы к применению. Калибратор готов к применению. Калибратор после вскрытия флакона стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 0С. Содержимое флакона № 3 (или аликвоту) следует развести бидистиллированной водой в 10 раз; хранить в полиэтиленовой таре. Необходимо тщательно закрывать флаконы непосредственно после каждого использования реагентов.

Срок хранения набора – 12 месяцев при температуре 18-25 0С. Дата изготовления, серия и номер набора по каталогу указаны на упаковке.

Процедура анализа

Пробы перемешивают и инкубируют 20 минут при комнатной температуре (18-25 0С). Затем в пробирки вносят по 2,5 мл разведенного реагента № 3, перемешивают реакционную смесь и через 10 минут (18-25 0С) измеряют оптические плотности опытных и соответствующих контрольных проб против дистиллированной воды при длине волны 537 нм (500-560 нм).

Расчет

Активность аспартатаминотрансферазы выражается в единицах, которые определяются количеством образовавшегося пирувата (моль или мкмоль) за единицу времени (час или секунда) в единице объема (литр) биологической жидкости.

38

Расчет активности (А) фермента проводится по формуле:

А = (Еопыт - Еконтр) х К

где: Еопыт – оптическая плотность опытной пробы, Еконтр – оптическая плотность соответствующей контрольной пробы,

К– коэффициент, рассчитанный по калибровочному графику.

При активности фермента, превышающей 4 ммоль/(ч х л) или 1,112 мкмоль (с х л),

сыворотку крови рекомендуется развести физиологическим раствором и учесть степень разведения при расчете.

Построение калибровочного графика

Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Инкубируют при комнатной температуре (18-25 0С). Затем во все пробирки вносят по 5,0 мл разведенного реагента № 3, перемешивают реакционную смесь и через 10 минут (18-25 0С) измеряют оптические плотности калибровочных растворов против контроля при длине волны 537 нм (500-560 нм).

Строят график зависимости оптической плотности от активности фермента. По калибпровочному графику рассчитывают коэффициент К = А/Е, где А –активность фермента, взятая из таблицы, Е – экстинция соответствующей калибровочной пробы.

Нормальные показатели

АСТ – до 0,19 мкмоль (с х л)или до 0,68 ммоль/(ч х л).

Аналитическая характеристика набора

Линейность – до 4 мкмоль (с х л) или 1,112 ммоль (ч х л). Воспроизводимость – коэффициент вариации не более 10 %.

Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет важное значение для диагностики инфаркта миокарда и дифференциальной диагностики болезней печени. Через 4-6 часов после возникновения инфаркта миокарда наблюдается повышение активности АсАТ, через 24-36 часов оно четко выражено и лишь на 3-7 день активность снижается до нормы. Активность аминотрансфераз увеличивается при инфекционном гепатите. Особенно важное значение для диагностики имеет увеличение активности АлАТ при безжелтушных формах болезни Боткина, в инкубационном и преджелтушном периоде гепатитов. Кроме того, повышение активности АлАТ наблюдается при инфаркте легких, прогрессирующей мышечной дистрофии, ожоговой болезни, отравлениях хлороформом и четыреххлористым углеродом; АлАТ - при подагре, алкогольной интоксикации, после оперативных вмешательств на брюшной полости, при прогрессирующей мышечной дистрофии, остром панкреатите, отравлениях хлороформом и четыреххлористым углеродом.

Обмен простых белков

В организме человека подвергается распаду около 70 г аминокислот в сутки. В результате распада азотсодержащих органических соединений образуется мочевина, креатинин, аммонийные соли и ряд других соединений. В количественном отношении основным из них является мочевина, синтезируемая в печени и выводимая, как и все конечные продукты азоти-

39

стого обмена, почками. Таким образом, содержание мочевины в крови зависит от соотношения процессов мочевинообразования и выведения, а концентрация ее характеризует функционирование двух жизненно важных органов – печени и почек.

Креатинин неферментативно образуется в мышечной ткани из фосфокреатинина. Для каждого человека суточное образование креатинина – величина постоянная, зависящая только от его мышечной массы. Эффективность очищения крови от креатинина зависит от состояния выделительной функции почек. Накопление его в крови параллельно с накоплением мочевины наблюдается при всех формах почечной недостаточности.

Аммиак, образующийся в процессах дезаминирования аминокислот и ряда других соединений, выводится из организма с мочой в виде аммонийных солей. Содержание последних определяет интенсивность процессов аммониогенеза, т.е. участия почек в регуляции кислотноосновного состояния.

Определение концентрации аммиака в моче. При взаимодействии формальдегида с аммонийными солями образуются уротропин и соляная кислота, количество которой эквивалентно содержанию аммонийных солей.

Ход определения. В колбу прибавляют 10 мл мочи, 3 капли фенолфталеина и несколько капель 0,1 N NаОН до появления розового окрашивания. Затем добавляют 5 мл формола, перемешивают и оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Титруют 0,1 N NаОН до красного цвета, который не исчезает в течение 30 с. Расчет содержания аммиака производится в суточном объеме мочи (1500 мл), учитывая, что 1 мл 0,1 N NаОН соответствует 0,1 ммоль аммиака.

В норме выведение аммиака составляет 35,7-71,4 ммоль/сут. Содержание аммиака в моче является одним из показателей кислотно-основного равновесия. Количество аммиака в моче повышается при респираторном и метаболическом ацидозах, гиперфункции коры надпочечников, лихорадочных состояниях. Выделение аммиака понижается при алкалозах, гипофункции коры надпочечников.

пропорциональна концентрации мочевины.

Исследуемый материал

Сыворотка крови.

Моча, разведенная водой в 25-100 раз (в конце исследования результат анализа умножается на разведение).

Состав набора

Реагент № 1 – раствор диацетилмонооксима – 40 мМ. Реагент № 2- раствор серной кислоты -7,2 М.

Реагент № 3 – раствор тиосемикарбазида гидрохлорида – 38,4 мМ. Реагент № 4 – Железо хлорное – 5 мМ.

Калибратор – раствор мочевины – 8,33 ммоль/л.

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность

Для приготовления рабочего раствора смешайте реагенты в следующей последовательности: № 1 – 10 мл, № 2 – 10 мл, № 3 – 2 мл и № 4 – 0,4 мл; немедленно добавьте 58 мл воды и перемешайте. Рабочий реагент стабилен в течение рабочего дня.

Можно смешивать кратные объемы реагентов, не меняя их соотношения. Невскрытые реагенты и калибратор стабильны в течение года при комнатной температуре в темноте. Дата изготовления, серия и номер по каталогу указаны на упаковке.

Процедура анализа

40