Литература / Руководство БХ

Пробы тщательно перемешивают, закрывают пробирки колпачками из фольги или стеклянными каплями и инкубируют точно 10 минут на кипящей водяной бане.

После инкубации пробы охлаждают под проточной водой и измеряют оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы при длине волны 540 нм. Окраска стабильна 15 минут после окончания инкубации.

Расчет

Расчет концентрации (С) мочевины в исследуемом образце производят по формуле: 1. Сыворотка крови:

Eпробы

где Епробы – оптическая плотность опытной пробы, Екалибр – оптическая плотность калибровочной пробы, К – коэффициент разведения мочи = 25 – 100

V – суточный диурез, л.

Нормальные показатели

Сыворотка крови – 2,5-8,3 ммоль/л. Моча – 330-580 моль/сутки.

Обратите внимание!

1.Водяная баня должна быть интенсивно кипящей.

2.Не нарушайте последовательность смешивания реагентов при приготовлении рабочего реагента; воду необходимо добавлять немедленно; рабочий реагент не должен иметь желтоватой окраски.

3.При определении мочевины в липимичных или гемолизированных сыворотках пробу можно депротеинизировать 5 % раствором трихлоруксусной кислоты; 0,1 мл сы-

воротки + 1,0 мл ТХУ и центрифугировать;так же готовить калибратор. Для анализа использовать 0,1 мл надосадочной жидкости.

Аналитические характеристики

Линейность – до 20 ммоль/л (120 мг / 100 мл). Значение коэффициента вариации – не более 5 %.

Количество мочевины в крови увеличивается при острой и хронической почечной недостаточности (при этом резко снижается выделение мочевины с мочой), а также при ишемической болезни сердца, нефритах, лихорадочных состояниях, сепсисе, туберкулезе почек. Пониженный уровень мочевины в крови и моче отмечается при паренхиматозном гепатите, циррозе печени, отравлениях фосфором, мышьяком, во время беременности и при диете с пониженным содержанием белка.

Количественное определение креатинина в биологических жидкостях методом Яффе с депротеинизацией. Креатинин в щелочной среде образует с пикриновой кислотой окрашенный комплекс. Интенсивность окраски комплекса пропорциональна концентрации креатинина в пробе.

41

Исследуемый материал

Сыворотка или плазма крови. Липимичная или гемолизированная сыворотка и плазма крови для анализа непригодна. Возможно хранение образцов при 2-8 0С в течение суток.

Свежая моча, разведенная дистиллированной водой в 100 раз (например 0,01 мл мочи и 0,99 мл дистиллированной воды).

Состав набора

Реагент № 1 – пикриновая кислота. Реагент № 2 – натр едкий.

Реагент № 3 – депротеинизатор.

Калибратор – раствор креатинина 177 мкмоль/л, согласно процедуре анализа.

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность

Реагенты № 1, № 2, № 3 стабильны при комнатной температуре в течение года, реагент № 1 – в темноте.

Калибратор готов к применению. После вскрытия флакона калибратор стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 0С.

Невскрытые реагенты и калибратор стабильны не менее года при хранении в защищенном от света месте при температуре 18-25 0С. Необходимо плотно закрывать наборы непосредственно после каждого использования. Дата изготовления, серия и номер по каталогу указаны на упаковке.

Процедура анализа 1. Подготовка образцов к анализу

Содержимое пробирок опытных проб тщательно перемешивают и через 10 минут центрифугируют при 900 g в течение 15 минут. Для дальнейшего анализа используют прозрачную надосадочную жидкость (супернатант). Содержимое пробирки контрольной пробы перемешивают, центрифугировать необязательно.

Калибратор в данной процедуре не нуждается, так как она уже была произведена на предприятии-изготовителе.

2. Проведение анализа

Содержимое пробирок опытных проб тщательно перемешивают после добавления каждого реагента и инкубируют при температуре 18-25 0С ровно 20 минут. Измеряют оптические плотности опытной (Епробы) и калибровочной (Екалибр.) проб против контрольной пробы при длине волны 505 нм (490 – 520 нм).

Расчет

Расчет концентрации (С) креатинина производят по формуле:

1. Креатинин сыворотки/плазмы крови:

Eпробы

42

2. Креатинин мочи:

Или

Eкалибр

где Епробы – оптическая плотность опытной пробы, Екалибр – оптическая плотность калибровочной пробы,

177 мкмоль/л – концентрация креатинина в калибраторе, 100 – разведение мочи, 1000 – перевод мкмоль в моль,

V – объем суточной мочи, л.

Нормальные показатели

Сыворотка/плазма крови:

женщины – 53-97 мкмоль/л, мужчины – 61-115 мкмоль/л. Моча – 4,4-17,7 ммоль/сутки.

Аналитические характеристики

Линейность – до 440 мкмоль/л.

Воспроизводимость – коэффициент вариации не более 5 %.

Повышенное содержание креатинина в моче отмечается при приеме мясной пищи (за счет экзогенного креатинина), тяжелой мышечной работе, лихорадочных состояниях, пневмонии. Пониженное содержание - при острой и хронической почечной недостаточности, мышечных атрофиях, лейкемии, в старческом возрасте.

Обмен гемосодержащих протеинов

Гемопротеины, флавопротеины и магний-порфирины, объединенные в группу хромопротеинов, наделены рядом уникальных биологических функций: осуществляют перенос кислорода кровью (гемоглобин), транспорт кислорода в мышщах (миоглобин), дыхание клеток и окислительные процессы в них (цитохромы), свето- и цветовосприятие и др. Нарушения обмена гемопротеинов является основой многих заболеваний. Различные анемии, желтухи (гипербилирубинемии), Порфирии, гемоглобинопатии, талассемии – далеко не исчерпывающий перечень заболеваний, связанных с нарушениями обмена гемопротеинов. Действие многих ядов направлено на повреждение механизмов функционирования в организме гемопротеинов. Большое диагностическое значение имеет определение промежуточных и конечных продуктов метаболизма гемма (его синтеза и распада), а также содержания гемоглобина и железа в крови. В клинической практике большое внимание уделяется определению содержания в крови билирубина.

Определение концентрации билирубина в сыворотке крови. Прямой (связанный конъюгированный с глюкуроновой кислотой) билирубин непосредственно реагирует с диазотированной сульфаниловой кислотой, а общий билирубин - в присутствии кофеинового реагента с образованием окрашенного азосоединения. Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна концентрации билирубина и измеряется фотометрически при длине волны 535 (500 – 560) нм.

Исследуемый материал

Сыворотка крови без следов гемолиза. Пробы стабильны 2 часа при комнатной температуре в защищенном от света месте. Хранить исследуемый материал при температуре 2-8 0С в защищенном от света месте не более 5 дней.

43

Состав набора

Реагент № 1 –кофеиновый реагент (200 мл). Реагент № 2 –сульфаниловая кислота (55 мл). Реагент № 3 –натрия нитрит (2 мл).

Реагент № 4 – физиологический раствор (250 мл). Калибратор –85,5 мкмоль/л (в 2 мл дистил. воды) – 1 флакон.

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность

Для исследования готовится диазореагент: смешиваются необходимые количества реагентов № 2 и № 3 в соотношении 100:2,5. Диазореагент стабилен не менее 10 дней при температуре 2-8 0С в плотно закрытой посуде из темного стекла.

Содержимое флакона с калибратором растворяют в 2 мл дистиллированной воды. После полного растворения концентрация билирубина составляет 85,5 мкмоль/л. Растворенный калибратор стабилен при температуре 2-8 0С в защищенном от света месте.

Срок хранения всех реагентов – 1 год при комнатной температуре. Реагент № 3 и калибратор светочувствительны, хранить в защищенном от света месте. Дата изготовления, серия и номер по каталогу указаны на упаковке.

Ход определения.

Пробы тщательно перемешать.

Для определения прямого билирубина точно! через 5 мин (комнатная температура) измерить величину экстинкции опытной пробы против соответствующей контрольной пробы при длине волны 535 нм (500 -560нм).

Для определения общего билирубина через 20 мин (комнатная температура) измерить величину экстинкции опытной пробы против соответствующей контрольной пробы при длине волны 535 нм (500 -560 нм).

Экстинкцию калибратора измерить против дистиллированной воды через 20 мин (комнатная температура) при длине волны 535 нм (500 -560 нм).

Расчет концентрации билирубина в пробе (С):

Е пробы

Екалибр.

Епробы – экстинкция опытной пробы

Екалибр – экстинкция калибровочной пробы

85,5 – концентрация билирубина в калибраторе, мкмоль/л

Нормальные значения

Общий билирубин - 8,5 – 20,5 мкмоль/л Прямой билирубин – до 4,0 мкмоль/л

Аналитические характеристики

Линейность – до 220 мкмоль/л.

Значение коэффициента вариации - не более 5 %.

44

Определение концентрации содержания железа в сыворотке крови. В кислой среде комплексы белка с железом диссоциируют, и железо переходит под действием восстановителя в F++. Ионы двухвалентного железа связываются с хромогеном (FERENE-S), образуя окрашенный комплекс, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию железа в пробе.

Исследуемый материал

Сыворотка крови без следов гемолиза и выраженной липемии. Сыворотку необходимо отделить от форменных элементов не позднее чем через 1 час после забора крови. Пробы стабильны в течение 3-х дней при температуре 2-8 0С.

Состав набора

Реагент № 1 – восстанавливающий буфер. Реагент № 2 – хромоген.

Калибратор –17,9 мкмоль/л (100 мкг /100мл).

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность

Для исследования необходимо приготовить рабочий реагент – необходимое количество реагентов № 1 и № 2 в соотношении 20:1. Рабочий реагент стабилен при хранении в защищенном от света месте при температуре 2-8 0С не более 14 дней. Перед работой выдержите рабочий реагент до комнатной температуры.

Калибратор готов к применению. После вскрытия флакона калибратор стабилен не менее 6 месяцев.

Необходимо плотно закрывать флаконы после каждого использования реагентов. Невскрытые реагенты стабильны не менее года при хранении в защищенном от света месте при температуре 2-8 0С. Дата изготовления, серия и номер по каталогу указаны на упаковке.

Процедура анализа

* - контроль опытной пробы исключает влияние окраски сыворотки.

Пробы тщательно перемешивают и инкубируют 10 мин при 37 0С или 30 мин при комнатной температуре. Измеряют оптические плотности опытной (Еоп) и калибровочной (Екалибр.) проб против контрольной пробы (Еоп/Еконтр) против дистиллированной воды при длине волны 595 нм (570-620 нм). Интенсивность окраски стабильна не менее часа.

Расчет

Расчет концентрации (С) железа в исследуемом образце производят по формулам:

Екалибр

где Епробы – оптическая плотность опытной пробы, Екалибр – оптическая плотность калибровочной пробы,

Еоп/Еконтр – оптическая плотность контроля опытной пробы, 17,9 мкмоль/л и 100 мкг/100 мл – концентрация железа в калибраторе.

45

Нормальные показатели

Мужчины: 10,8 – 28,6 мкмоль/л (60 – 160 мкг/100 мл). Женщины: 7,1 – 26,0 мкмоль/л (40 – 145 мкг/100 мл).

Обратите внимание!

1. Недостаточно чистая посуда является источником грубых ошибок.

Стеклянную посуду необходимо промыть хромовой смесью или 4 моль/л HCl и тщательно сполоснуть бидистиллированной водой. Рекомендуется использование одноразовой пластиковой посуды.

2. Реагент № 2 светочувствителен. Необходимо избегать воздействия света!

Аналитические характеристики

Линейность – до 179 мкмоль/л (1000 мкг/100 мл).. Значение коэффициента вариации - не более 5 %.

Обмен нуклеопротеинов

Нарушения метаболизма нуклеиновых кислот, в первую очередь одной из составляющих - пуриновых оснований, лежат в основе многих врожденных и приобретенных заболеваний. Пуриновые и нуклеотиды подвергаются в организме человека ферментативному распаду до образования конечного продукта - мочевой кислоты, которая выводится почками. Наиболее частым лабораторно-диагностическим признаком заболеваний, связанных с нарушением пуринового обмена, является повышение уровня мочевой кислоты в крови. При ряде приобретенных заболеваний, таких как ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет ,острые гепатиты, содержание данного соединения является даже метаболическим показателем степени тяжести. Избыточный синтез мочевой кислоты при сниженном выделении ее почками приводит к развитию подагры. Это распространенное заболевание характеризуется отложением в хрящах кристаллов мочекислого натрия и сопровождается сложным нарушением трофики суставов и выраженным болевым синдромом.

Определение концентрации мочевой кислоты в биологических жидкостях.

Принцип метода

уриказа

мочевая кислота + 2 Н2О + О2 аллантоин + СО2 + Н2О2

пероксидаза

2 Н2О2 + 3,5-дихлоро-2-фенолсульфонат + 4-аминоантипирин хинонимин + + 4 Н2О

Исследуемый материал

Сыворотка или плазма крови. Не использовать ЭДТА и фторид в качестве антикоагулянтов!

Мочу развести в 10 раз 0,9 % раствором NaCl, добавить NaОН до щелочной реакции. Пробы можно хранить при температуре 2 – 8 0С в течение 5 дней.

Состав набора

Реагент № 1 – 0,15 М фосфатный буфер, рН 7,7; 3,5-дихлоро-2-фенолсульфонат – 2,5 мМ. Реагент № 2 –лиофилизат. Концентрация после растворения: 4-аминоантипирин – 0,25 мМ; уриказа – 300 Ед/л; аскорбатоксидаза – 250 Ед/л; пероксидаза – 250 Ед/л.

Калибратор – раствор мочевой кислоты – 357 мкмоль/л (6 мг/100 мл).

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность

Рабочий реагент: растворить содержимое флакона № 2 в одном флаконе № 1. Для получения оптимальных результатов рекомендуется выдержать рабочий реагент после полного растворения лиофилизата при комнатной температуре не мене 60 минут. Раствор стабилен не менее 3 недель при температуре 2-8 0С в темноте. Розоватая окраска рабочего реагента не является признаком его непригодности.

Необходимо плотно закрывать флаконы непосредственно после каждого использова-

ния.

Калибратор готов к использованию.

46

Хранить при температуре 2-8 0С. Невскрытые реагенты стабильны не менее 6 месяцев при хранении в защищенном от света месте. Дата изготовления, серия и номер по каталогу указаны на упаковке.

Процедура анализа

Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют не менее 15 минут при температуре 18-25 0С или 10 минут при 37 0С. Измеряют оптические плотности опытной (Епробы) и калибровочной (Екалибр.) проб против контрольной пробы при длине волны 500 нм (490 – 520 нм). Окраска стабильна не менее 15 минут после окончания инкубации.

Расчет

Расчет концентрации (С) мочевой кислоты в исследуемом образце производят по формуле: 1. Сыворотка или плазма крови:

Eкалибр

где Епробы – оптическая плотность опытной пробы, Екалибр – оптическая плотность калибровочной пробы, V – суточный диурез, л,

6 мг/100 мл или 357 ммоль/л – концентрация мочевой кислоты в калибраторе, 100 и 10 – коэффициенты пересчета на 1 л мочи.

Нормальные показатели

Сыворотка/плазма крови:

женщины – 142-339 мкмоль/л (2,4-5,7 мг/100 мл), мужчины – 2,0-416 мкмоль/л (3,4-7,0 мг/100 мл),

Моча – 1,49-4,46 ммоль/сутки (250-750 мг/сутки).

Обратите внимание!

1.Билирубин до 137 мкмоль/л (8 мг/100 мл) не влияет на правильность определения мочевой кислоты.

2.Оптическая плотность контрольной пробы не должна превышать Е = 0,200 (кювета

– 1 см, против воды).

Аналитические характеристики

Линейность – до 25 мг/100 мл (1500 мкмоль/л). Значение коэффициента вариации – не более 5 %.

Гипоурикурия, т.е. уменьшение выделения мочевой кислоты с мочой, отмечается при пеллагре,нефрите, почечной недостаточности. Гиперурикурия, т.е. увеличение выделения мочевой кислоты с мочой, наблюдается при лейкемии, усиленном распаде нуклеопротеинов. У детей выделяется относительно больше мочевой кислоты, чем у взрослых.

47

При подагре соли мочевой кислоты (ураты) откладываются в хрящах, мышцах и слизистой сумке суставов. Содержание мочевой кислоты в крови таких больных может быть повышенно, но выделение с мочой меньше, чем в норме.

Биохимия витаминов и гормонов

Биохимия витаминов

Витамины - низкомолекулярные органические вещества продуктов питания, обеспечивающие нормальное протекание физиологических процессов в организме. Они присутствуют в пище в малых количествах и в организме, как правило, не синтезируются, не депонируются и не являются источником энергии.

Витамины входят в состав различных ферментных систем и тем самым обеспечивают нормальное течение биохимических процессов в организме. В настоящее время известно более 20 витаминов. Их можно обнаружить с помощью ряда качественных реакций. Количественно в медицинской практике определяют содержание в крови и моче витамина С.

Количественное определение витамина С в суточной моче. В основу метода поло-

жена окислительно-восстановительная реакция между витамином С и – дихлорфенолиндофенолом (краской Тильманса).

Ход определения. В плоскодонную колбу вносят 5 мл мочи, 4 мл Н2О, 1 мл 1 % НСl и титруют 0,001 N раствором краски Тильманса до розовой окраски, не исчезающей в течение

30 сек.

11,44 * 5 *176,13

где Vоп – объем краски Тильманса, пошедший на титрование, мл; 1500 – средний суточный диурез, мл;

11,44 – количество 0,001 N раствора краски Тильманса, эквивалентное 1 мг витамина С,

мл;

5 – объем исследуемой мочи, мл;

176,13 – мг-молекулярная масса витамина С.

Норма. 0,11 – 0,22 ммоль/сут. Количество витамина С, выводимого мочой, зависит, в основном, от его содержания в рационе. При недостаточном поступлении в организм человека витамина С, в том числе при цинге, его выведение с мочой снижается, при избыточном – возрастает.

Качественная реакция на витамин А. Витамин А при взаимодействии с треххлористой сурьмой образует нестойкое соединение синего цвета.

В сухую пробирку вносят 2-3 капли 20 % раствора рыбьего жира в хлороформе и 5 капель насыщенного раствора треххлористой сурьмы, перемешивают.

Качественные реакции на витамин В1.

1.Тиамин при взаимодействии с красной кровяной солью в щелочной среде образует тиохром, дающий голубую флуоресценцию в ультрафиолетовом свете.

К 1 мл 5 % раствора витамина В1 прибавляют 2-3 капли 10 % раствора NаОН. Затем до появления зеленовато-желтого окрашивания приливают 1 % раствор красной кровяной соли, встряхивают. Прибавляют 1 мл изобутилового спирта и снова встряхивают. Далее жидкости дают отстояться до разделения слоев. Облучают ультрафиолетовым светом.

2.Тиамин в щелочной среде с диазореактивом образует сложное комплексное соединение оранжевого цвета. Диазореактив готовят, наливая в пробирку по 5 капель 1 % раствора сульфаниловой кислоты и 5 % раствора Nа NО2. В ту же пробирку добавляют 5 капель 1 %

48

раствора витамина В1 и затем по стенке наклоненной пробирки осторожно добавляют 5-7 капель 10 % раствора бикарбоната натрия.

Качественная реакция на витамин В6. Пиридоксин реагирует с хлорным железом с образованием комплексной соли красного цвета.

В пробирке смешивают 5 капель 5 % водного раствора витамина В6 и каплю 5 % раствора хлорного железа, встряхивают.

Качественные реакции на витамины могут быть использованы для их обнаружения в пищевых продуктах и лечебных препаратах.

Биохимия гормонов

Контроль исходного уровня знаний обучаемых:

Контроль проводится в письменной форме в виде ответов на поставленные вопросы, что позволяет восстановить в памяти обучаемых необходимые для уяснения темы занятия базисные знания, а также определить исходный уровень знаний, достигнутый обучаемыми в результате изучения рекомендованной литературы и учебного материала на самоподготовке к данному занятию.

Билет 1

1.В задней доле гипофиза образуется:

1. гонадотропные гормоны 2. Вазопрессин 3. АКТГ 4. Глюкокортикоиды 5. глюкагон Ответ: 2 2.Внутриклеточным посредником действия гормонов может быть:

1. циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) 2. циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ)

3.кальций

4.фосфоинозитиды 5. все перечисленное верно * Ответ: 5 3.При дефиците инсулина:

1.снижается окисление глюкозы 2. повышается синтез длинноцепочечных жирных кислот (липогенез)

3.повышается поступление ионов калия и фосфора в клетки 4. сдерживается кетогенез

5.все перечисленное

* Ответ: 1 4.Глюкокортикоиды вызывают:

1. усиление глюконеогенеза 2. катаболизм белков в мышцах 3. подавление воспалительной реакции 4. иммуносупрессивный эффект 5. все перечисленное верно

* Ответ: 5 5.В синтезе адреналина участвуют следующие аминокислоты:

1. триптофан 2. Лейцин 3. Тирозин 4. Глицин 5. цистеин * Ответ: 3

Билет2

1.Гормоны могут быть:

1. гликопротеинами 2. Стероидами 3. Белками 4. Пептидами 5. любым из перечисленных веществ Ответ: 5

2.Гипергликемическим эффектом обладают:

1. инсулин 2. паратиреоидные гормоны 3. Андрогены 4. Глюкокортикоиды 5. эстрогены * Ответ: 4 3.На обмен углеводов влияет гормон:

1. катехоламины 2. Глюкокортикоиды 3. соматотропный гормон 4. АКТГ 5. все перечисленные

49

* Ответ: 5 4.Под влиянием АКТГ активируется:

1. катаболизм белка 2. Глюконеогенез 3. гликогеногенез в печени 4. Липогенез 5. все перечисленное * Ответ: 5

5.Глюкозу в крови можно определить:

1. глюкозооксидазным методом 2. ортотолуидиновым методом 3. электрохимическим методом

4. гексокиназным методом 5. всеми перечисленными методами * Ответ: 5

Билет3

1.Либерины и статины (рилизинг-факторы) образуются в:

1. гипофизе 2. Гипоталамусе 3. Надпочечниках 4. половых железах 5. лимфоузлах * Ответ: 2 2.К гипергликемии может привести повышение секреции:

1. паратгормона 2. Соматотропина 3. Эстрогенов 4. Альдостерона 5. инсулина * Ответ: 2 3.Гормоном, принимающим участие в регуляции липидного обмена, является:

1. адреналин 2. Глюкокортикоиды 3. Инсулин 4. Соматотропин 5. все перечисленные гормоны Ответ: 5 4.На кору надпочечников воздействуют:

1. тиреотропный гормон гипофиза 2. АКТГ 3. Паратгормон 4. Окситоцин 5. альдостерон Ответ: 2

5.Продуктом распада адреналина является:

1.дофамин 2. Простагландины 3. ванилил-миндальная кислота 4. циклические нуклеотиды 5. все перечисленные вещества Ответ: 3

Билет4

1.В передней доле гипофиза образуется:

1. вазопрессин 2. Тироксин 3. АКТГ 4. Адреналин 5. кортизол * Ответ: 3 2.Гипогликемический эффект осуществляет:

1. адреналин 2. Глюкокортикоиды 3. Инсулин 4. соматотропный гормон 5. все перечисленные гормоны * Ответ: 3

3.Глюконеогенез усиливается:

1. адреналином 2. Тироксином 3. Кортизолом 4. Инсулином 5. всеми перечисленными гормонами * Ответ: 3

4.К глюкокортикоидам относится:

1. кортизол 2. АКТГ 3. Кортиколиберин 4. Глюкагон 5. инсулин * Ответ: 1 5.Гормоны гипоталамуса оказывают прямое действие на:

1. щитовидную железу 2. поджелудочную железу 3. Гипофиз 4. Надпочечники 5. половые железы * Ответ: 3

Билет5

1.В щитовидной железе образуются:

а. трийодтиронин, тироксин б. тиреотропный гормон в. Тиреолиберин г. АКТГ д. меланин Ответ: а

50