Литература / Руководство БХ

Расчет концентрации (С) неорганического фосфора в исследуемом образце производят по формуле:

Eкалибр

где Епробы – оптическая плотность исследуемой пробы, Екалибр – оптическая плотность калибровочной пробы, V –объем суточной мочи,

5 мг/100 мл (1,615 ммоль/л) – концентрация неорганического фосфора в калибраторе, 10 – коэффициент разбавления.

Нормальные показатели

Сыворотка/плазма крови:

взрослые: 2,7 – 4,5 мг/100 мл (0,87 – 1,45 ммоль/л), новорожденные: 3,5 – 8,6 мг/100 мл (1,18 – 2,78 ммоль/л),

дети дошкольного возраста: 4,5 – 6,5 мг/100 мл (1,45 – 2,10 ммоль/л), дети школьного возраста: 4,5 – 5,5 мг/100 мл (1,45 – 1,78 ммоль/л).

Моча: 12,9 – 42,0 ммоль/сутки.

Обратите внимание!

Основным источником ошибок является загрязнение посуды и кювет. Рекомендуется использовать одноразовую пластиковую посуду. Стеклянную посуду перед использованием желательно на несколько часов замачивать в 1 N соляной кислоте, затем тщательно промыть бидистиллированной или деионизированной водой.

Аналитические характеристики

Линейность – до 6,46 ммоль/л (20 мг/100 мл). Значение коэффициента вариации – не более 5 %.

Биохимия ферментов. Биологическое окисление.

Общие свойства ферментов

Ферментами называют специфические белки, выполняющие в организме роль биологических катализаторов. Значение их необычайно велико, ибо в организме почти все биохимические реакции протекают с участием тех или иных ферментов. Ферменты являются чрезвычайно мощными катализаторами, как правило, намного превосходящими по своей эффективности катализаторы синтетические. Они специфичны по отношению к своим субстратам и ускоряют строго определенные биохимические реакции без образования побочных продуктов. Присутствуя в клетках в небольших количествах, ферменты не только осуществляют превращения веществ, но и делают это исключительно легко, при физиологических значениях температуры, рН и давления. Большое влияние на активность ферментов оказывает присутствие в среде активаторов и ингибиторов.

Некоторые болезни человека (так называемые энзимопатии) связаны с недостаточностью или полным отсутствием ферментов. Кроме того, при многих патологических состояниях в сыворотке крови изменяется (как правило, повышается) активность ферментов, что используется в диагностике заболеваний.

11

Определение активности каталазы крови по методу А.Н. Баха и С.Р. Зубковой,

влияние pH среды на ее активность. В основе количественного определения каталазы лежит определение количества перекиси водорода, разложенной ферментом за определенное промежуток времени, по следующему уравнению:

5H2O2 + 2KMnO4 + 4H2SO4 8H2O + 5O2 + 2KНSO4 + 2MnSO4

Активность выражают с помощью каталазного числа и показателя каталазы. Каталазным числом называют количество миллиграммов перекиси водорода, которое разлагается в 1 мкл крови. О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества KMnO4, израсходованного на титрование до и после действия каталазы.

Реактивы:

1.Перекись водорода, 1 % раствор.

2.Серная кислота, 10 % раствор.

3.Перманганат калия, 0,1 н. раствор.

4.Кровь, разведенная в 1000 раз (10 мл дистиллированной воды + 0,1 мл крови.

Ход определения:

Разведенную кровь (1:1000) взбалтывают, наливают по 1 мл в две колбы, приливают по 7 мл дистиллированной воды; в опытную пробу добавляют 2 мл 1 % Н2О2, а в контрольную – 5 мл 10 % раствора серной кислоты. Действие каталазы в кислой среде (в контрольной пробе) прекращается, так как она действует при рН 7,4.

Колбы оставляют при комнатной температуре на 30 минут.

Затем приливают в опытную коблу 5 мл 10 % раствора H2SO4, а в контрольную – 2 мл 1 % раствора Н2О2. Содержимое каждой пробы титруют 0,1 н. раствором KMnO4 до розовой окраски.

Рассчитывают каталазное число по формуле:

КЧ = (А – В) х 1,7,

где А – количество 0,1 н. раствора KMnO4, пошедшее на титрование контрольной пробы, мл; В - количество 0,1 н. раствора KMnO4, пошедшее на титрование опытной пробы, мл;

1,7 -

В норме каталазное число колеблется от 10 до 15 единиц.

Определение активности каталазы крови имеет значение для диагностики рака, анемии, туберкулеза. При этих заболеваниях содержание каталазы в крови снижается.

Определение субстратной специфичности уреазы. Уреаза катализирует гидролиз мо-

чевины с освобождением газообразного оксида углерода (IV) и аммиака. Последний, в свою очередь, вызывает сдвиг pH инкубационной среды в щелочную сторону, выявляемый по изменению окраски универсального индикатора фенолфталеина.

Ход определения.

Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37 C на 15 мин. В первой пробе содержимое окрашивается в малиновый цвет, во второй пробе окраска не развивается. Почему?

12

Влияние концентрации ацетилхолина на скорость ферментативной реакции хо-

линэстеразы сыворотки крови. Холинэстераза гидролизует ацетилхолин на холин и уксусную кислоту. Оставшийся негидролизованный ацетилхолин определяют по цветной реакции с гидроксиламином и хлорным железом. Интенсивность окраски обратно пропорциональна активности фермента.

Ход определения

2,5 мл 10 % раствора хлорного железа.

После добавления каждого реактива пробы тщательно перемешивают. Через 10 мин интенсивность окрашивания измеряют на ФЭКе с зеленым светофильтром против дистиллированной воды в кювете с толщиной оптического слоя 5 мм. Для каждой пробы вычисляют величину E: E1 = E1 E2; E2 = E1 E2; и т.д. и строят график зависимости E от количества (мл) ацетилхолина.

Активаторы и ингибиторы ферментов

Определение активности холинэстеразы сыворотки крови. Влияние прозерина на ак-

тивность холинэстеразы. Холинэстераза (ХЭ) расщепляет ацетилхолин на холин и уксусную кислоту. Оставшийся негидролизованный ацетилхолин определяют по цветной реакции с гидроксиламином и хлорным железом. Интенсивность окраски обратно пропорциональна активности фермента.

Ход определения

13

После добавления каждого реактива пробы тщательно перемешивают. Через 10 мин интенсивность окрашивания измеряют на ФЭКе с зеленым светофильтром против дистиллированной воды в кювете с толщиной оптического слоя 5 мм и рассчитывают активность ХЭ в обеих опытных пробах.

Расчет активности

Еоп * 5,5

Ест

Еоп и Ест – экстинкции опыта и стандарта; 5,5 – количество ацетилхолина в пробе до инкубации и стандарте, мкмоль.

Делают вывод о влиянии прозерина на активность ХЭ. Активность ХЭ в норме составляет 32 - 63 мккат/л. Значительное снижение активности ХЭ в сыворотке крови наблюдается в случае поражения организма фосоорганическими веществами, при паренхиматозных гепатитах, циррозах печени, гипотиреозе, бронхиальной астме, суставной форме ревматизма, инфаркте миокарда, ожогах, травматическом шоке, в послеоперационном периоде.

Влияние ионов меди, хлора и димедрола на активность амилазы слюны. Амилаза слюны катализирует гидролиз крахмала до декстринов и мальтозы. О степени расщепления крахмала можно судить по окраске, развивающейся в реакции продуктов гидролиза с раствором йода в растворе йодида калия (раствор Люголя). Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, декстрины в зависимости от размера молекулы имеют следующую окраску: амилодекстрины - фиолетовую, эритродекстрины - красно-бурую, мальтодекстрины - оранжевую, мальтоза не изменяет цвет раствора Люголя.

Для получения раствора амилазы (исходный раствор) рот прополаскивают дистиллированной водой в течение 1 мин. К 0,5 мл этой жидкости приливают 0,5 мл дистиллированной воды и 0,5 мл 1 % раствора крахмала, перемешивают и через 2 мин добавляют 1 кап. раствора Люголя. Если появляется красное или красно-фиолетовое окрашивание, раствор амилазы готов к работе; если желтое исходный раствор необходимо развести (разведение может быть в 220 раз) и повторить опыт. В случае синей окраски время гидролиза следует увеличить до 35 мин.

Ход определения

Содержимое пробирок встряхивают и добавляют по 0,5 мл 1% раствора крахмала. Перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 2 мин. Во все пробы добавляют по 1 капле раствора Люголя, перемешивают и по окраске проб делают вывод о характере влияния исследуемых веществ на активность амилазы.

Биологическое окисление

14

Биологическое окисление представляет собой совокупность реакций окисления, протекающих во всех живых клетках. Основной функцией этого процесса является обеспечение организма энергией в доступной для использования форме (прежде всего – в форме АТФ).

Существует четыре типа окислительных процессов, которые в свою очередь можно подразделить на две основные группы. Аэробное окисление – реакции дегидрирования катализируются аэробными дегидрогеназами, акцептором электронов служит кислород. Анаэробное окисление – акцептором служит другое вещество и процесс катализируется анаэробными дегидрогеназами.

Дыхание – основной процесс, снабжающий энергией живой организм. Тканевое дыхание – окисление органических веществ в тканях за счет поступления кислорода с выделением энергии и распадом органических веществ до конечных продуктов.

Дыхательный комплекс ферментов-переносчиков (дыхательная цепь) располагается в толще внутренней мембраны митохондрий, которая построена из фосфолипидов и белков. В каждой митохондрии имеется от 5000 до 10000 дыхательных цепей. Биологическая роль дыхательной цепи состоит в том, что избыточная энергия, образуемая миграцией электронов по этой цепи, трансформируется в энергию АТФ. Главный источник энергии среди пищевых продуктов – углеводы (1г = 17,09·103 Дж).

Окисление субстрата в процессе дыхания начинается с его дегидрирования – отнятия водорода; этот этап окисления катализируется ферментами дегидрогеназами, а в качестве конечного акцептора электронов используется кислород. Перемещение электронов к кислороду сопровождается выделением избыточной энергией электронов; при этом 50-60 % ее выделяются в виде тепла, а 40-50 % аккумулируются в связях АТФ. За счет этой энергии осуществляется работа механизмов клетки и возникает цикл АТФ – АДФ - работа:

Энергия

в виде тепла АДФ + Н3РО4 + ∆μН+

Работа АТФ + Н2О В полной дыхательной цепи можно выделить три основных участка ферментных си-

стем:

1)НАДН – ФП – дегидрогеназа включает НАДН, ФМН, негеминовое железо, КоQ, который не связан с белком, находится в липидном слое митохондрий и служит, с одной стороны, акцептором электронов от окисленного НАДН (Н+), с другой – донором электронов для цитохромной системы;

2)КоQ – цитохром с-редуктаза включает цитохромы b, с1 и с (геминовые ферменты);

3)цитохромоксидаза а-а3, или дыхательный фермент Варбурга (геминовый фермент, содержащий Cu), единственный из всех цитохромов, способный восстановить кислород.

В зависимости от первичной дегидрогеназы, действующей на субстрат в процессе окисления, различают три вида дыхательных цепей:

1. Полная дыхательная цепь содержит НАДН (Н+); в результате окислительного фосфорилирования образуется три молекулы АФТ в участках сопряжения:

15

Субстрат

окисленный

Вкачестве субстрата можно использовать субстраты цикла Кребса – янтарную кислоту,

атакже глицерофосфат, активные жирные кислоты.

3.Короткая дыхательная цепь содержит ФАД; окисление протекает не в митохондриях,

ав других органеллах; вся энергия выделяется в виде тепла:

Субстрат

окисленный

Перекиси разлагаются в пероксисомах, в основном под влиянием каталазы или пероксидазы.

В процессе миграции электронов возникает электрический мембранный потенциал ∆φ, который позволяет выбрасывать протоны водорода через непроницаемую для них мембрану митохондрий с последующим возвращением их по сопрягающему устройству. Таким образом, возникает круговорот протонов водорода, приводящий к возникновению градиента протонов водорода ∆рН. Электрохимический потенциал ∆μ-Н+, возникающий на мембране митохондрий, складывается из ∆φ и ∆рН; этот потенциал равен 0,2 В, эквивалентен ∆рН и служит основой для синтеза универсального макроэрга АТФ из АДФ + Н3РО4 + Е АТФ-синтетаза + G0′

(∆μ-Н+).

Процесс сопряжения окисления с синтезом АТФ (окислительное фосфорилирование) впервые был описан В.А. Энгельградтом (1931).

Определение поглощения неорганического фосфата в процессе окислительного фосфорилирования. Гомогенат печени, содержащий все ферменты биологического окисления, активно утилизирует кислород (тканевое дыхание). Сопряжено с этим идет процесс фосфорилирования:

фосфата, который переходит в органическую форму (АТФ). Убыль фосфата определяют методом Фиске и Суббароу.

Ход определения. Крысу декапитируют под хлороформным наркозом. Печень препарируют, обмывают охлажденным физиологическим раствором, обсушивают фильтровальной бумагой и взвешивают на весах. Навеску печени помещают в охлажденную ступку, приливают раствор для гомогенизации их расчета 1:4 и растирают пестиком. Состав раствора: 8,5 % сахароза (для сохранности митохондрий), 0,2 % NaF (для ингибирования гликолиза). Гомогенат фильтруют через салфетку и используют для работы.

16

Перемешивают, термостат при 37 0С, 10 минут. Пробы фотометрируют на ФЭКе против воды с красным светофильтром (610 нм) в кювете с толщиной оптического слоя 5 мм.

Убыль фосфора (на грамм ткани) = (Соп.1 - Соп.2)*20, где 20 – разведение гомогената;

0,1 – количество фосфора в 1 мл стандартного раствора, мг.

Аналогичный расчет проводят для 3-го опыта с динитрофенолом. Сопоставляют данные между убылью фосфора в опытных пробах и при воздействии динитрофенола и делают вывод о его влиянии на окислительное фосфорилирование.

В норме тканевое дыхание и окислительное фосфорилирование строго сопряжены. Однако при ряде патологических процессов происходит их разобщение, что ведет к недостаточному синтезу в тканях АТФ и нарушению функции клеток (тиреотоксикоз, лучевая патология, гипоксия и др.).

Определение активности цитохромоксидазы тканей. Цитохромоксидаза окисляет при участии кислорода воздуха диметилпарафенилендиамин и α-нафтол (реактив НАДИ) с образованием индофенолового голубого. Время развития окрашивания пропорционально активности фермента.

Ход определения. На срезы тканей печени, мышщы и мозга крысы (немедленно после вскрытия животного) наносят последовательно по 2-3 капли 1 % α-нафтола, 1 % парафенилендиамина и 1,5 % Na2CO3. Отмечают время появления синего окрашивания на срезах тканей. Почему время окрашивания неодинаково?

Определение активности цитохромоксидазы можно использовать при гистохимических исследованиях в экспериментальной работе по изучению интенсивности биоэнергетических процессов. Снижение активности цитохромоксидазы наблюдается при отравлении угарным газом, цианидами, а также при воздействии ряда других токсических агентов.

Биохимия белков и нуклеиновых кислот. Энзимология. Биологическое окисление. (Семинар)

Вопросы для самоподготовки.

1.Аминокислотный состав белков и методы его определения.

2.Формулы аминокислот и пептидов.

3.Структура белков (первичная, вторичная, третичная, четвертичная), функциональноактивные участки молекулы белков.

4.Методы определения структуры белков.

5.Физико-химические свойства белков:

-белки как амфотерные электоролиты,

-механизм образования заряда у белковой молекулы,

17

-изоэлектрическая точка белков и методы ее определения,

-молекулярная масса белков и методы ее определения,

-денатурация белков,

-растворимость белков,

-форма белковой молекулы,

-диализ белков.

6.Методы разделения белков:

-методы разделения белков по знаку и величине заряда (электрофорез, изоэлектряче-

ское фокусирование, ионообменная хроматография),

-методы разделения белков по величине молекулярной массы,

-методы разделения белков по их растворимости.

7.Понятие о нативном белке, биологическая роль белков.

8.Классификация белков, характеристика важнейших представителей простых белков.

9.Строение нуклеопротеидов и их роль в организме.

10.Структура и биологическая роль нуклеиновых кислот.

11.Генная инженерия и биотехнология.

12.Строение хромопротеинов, важнейшие представители и их биологическая роль.

13.Производные гемоглобина, физиологические и аномальные типы гемоглобинов гемоглобинопатии, талассемии.

14.строение фосфопротеинов, липопротеинов, металлопротеинов и их биологическая роль.

15.Химическая природа ферментов.

16.Функционально-активные участки молекул ферментов.

17.Современные представления о механизме ферментативного катализа.

18.Специфичность ферментов, виды специфичности.

19.Влияние рН, температуры, концентрации фермента и субстрата на скорость ферментативной реакции.

20.Активаторы ферментов, механизм их действия.

21.Ингибиторы ферментов, виды ингибирования.

22.Регуляцию активности ферментов.

23.Внутриклеточную локализацию ферментов.

24.Уровни структурной организации ферментов. Мономеры, олигомеры, мультиферментные комплексы, ферментные ансамбли.

25.Множественные молекулярные формы ферментов, их клинико-диагностическое значение (на примере ЛДГ и КК).

26.Классификация ферментов, номенклатура ферментов.

27.Применение ферментов в биологии в медицине.

28.Современные представления о биологическом окислении.

29.Роль отечественных учёных в развитии учения о тканевом дыхании и окислительном фосфорилировании.

30.Оксидазный путь биологического окисления, субстраты, ферменты, коферменты биологического окисления.

31.Окислительное фосфорилирование, хемиоосмотическая теория сопряжения окисления и фосфорилорования.

32.Влияние различных ядов на тканевое дыхание и окислительное фосфорилирование.

33.Оксигеназный путь биологического окисления, субстраты ферменты и коферменты.

34.Пероксидазный путь биологического окисления, субстраты ферменты и коферменты.

Обмен углеводов

Переваривание и анаэробный обмен углеводов

18

Анаэробный гликолиз и увеличение синтеза лактата служит показателем повышенной скорости деления клеток при недостаточной обеспеченности их системой кровеносных сосудов.

Уровень лактата в крови – результат равновесия между процессами его образования и утилизации. Кратковременный компенсированный лактоацидоз встречается довольно часто при интенсивной мышечной работе. Причинами накопления молочной кислоты и развития лактоацидоза могут быть активация анаэробного гликолиза вследствие тканевой гипоксии, поражение печени (токсическая дистрофия, цирроз), нарушение использования лактата вследствие наследственных дефектов ферментов глюконеогенеза, нарушение работы пируватдегидрогеназного комплекса вследствие дефектов ферментов или гиповитаминоза.

Качественная реакция на молочную кислоту (реакция Уффельманна). Комплексный фенолят железа фиолетового цвета в присутствии молочной кислоты превращается в молочнокислое железо желтовато-зеленого цвета.

Ход определения.

Содержимое пробирок перемешивают, сравнивают окраски и делают вывод о содержании молочной кислоты в гомогенате мышечной ткани.

Реакция Уффельманна применяется для обнаружения молочной кислоты в желудочном соке, где она появляется при снижении секреции соляной кислоты и резком усилении процесса молочнокислого брожения углеводов пищи под влиянием микроорганизмов.

Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке и плазме крови оптимизированным кинетическим методом.

Скорость окисления НАДН в НАД+ пропорциональна активности ЛДГ.

Исследуемый материал

Свежая сыворотка или плазма крови без следов гемолиза. Активность фермента в сыворотке снижается после 3 дней хранения при 4 0С – на 8 %, при 18–25 0С – на 2 %.

Состав набора

Реагент № 1 – 0,05 М фосфатный буфер, рН 7,5; пируват натрия – 0,06 М; стабилизаторы; детергенты.

Реагент № 2 – стартовый реагент: НАДН – 1 мМ/л.

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность

Невскрытые реагенты стабильны 12 месяцев при 2-8 0С.

Для приготовления рабочего реагента необходимо смешать требуемое количество реагентов № 1 и № 2 в соотношении 4:1. Рабочий реагент стабилен 24 часа при температуре 2-8 0С, 3 часа – при 18-25 0С.

Реагенты № 1 и № 2 после вскрытия флаконов стабильны не менее 6 месяцев при хранении при 2-8 0С.

Необходимо тщательно закрывать флаконы после каждого использования реактивов. Срок годности, серия и номер набора по каталогу указаны на упаковке.

Процедура анализа

Непосредственно в кювете фотометра с длиной оптического пути 1 см смешайте рабочий реагент и исследуемый материал в соотношении: 50:1 (если температура проведения исследования 25 0С или 30 0С) или 100:1 (если температура проведения исследования 37 0С).

20