Литература / Руководство БХ

Через 1 минуту измеряют исходную величину экстинции при длине волны 340 нм (334 или 365 нм) против воздуха. Повторяют измерение точно через 1, 2 и 3 мин. Вычисляют среднее изменение экстинции за 1 минуту (∆Е/мин).

Если активность ЛДГ в сыворотке превышает 1200 Ед/л, необходимо развести исследуемый материал 0,9 % раствором NaCl в 10 раз и повторить анализ; результат умножают на 10.

Расчет

Расчет активности фермента (Ед/л) проводят по формулам:

Аналитическая характеристика набора

Линейность – до 1200 Ед/л.

Воспроизводимость – коэффициент вариации не более 5 %.

Активность ЛДГ в сыворотке крови значительно возрастает у больных при инфаркте миокарда, лейкозах, ишемическом поражении почек, гепатите, панкреотите, гемолитической и серповидноклеточной анемии, прогрессирующей мышечной дистрофии, опухолях, что имеет важное диагностическое значение.

Обнаружение гликогена в печени крыс. Гликоген представляет собой белый порошок, хорошо растворимый в воде и, подобно белкам, способный высаливаться из раствора солями щелочных и щелочноземельных металлов, спиртами. На долю гликогена в печени приходится до 5 %, при голодании в течение суток почти весь запас гликогена расходуется.

Принцип метода:

Метод основан на том, что гликоген хорошо растворим в воде и достаточно устойчив в слабокислой среде. Выделение гликогена сводится к механическому разрушению ткани и экстракции гликогена 5 % раствором ТХУ (белки при этом денатурируют и легко удаляются фильтрованием).

Ход работы:

В опыте используют печень сытого и голодавшего животных, предварительно обработанную кипящим физраствором для инактивации фермента фосфорилазы.

1.Отвешивают на аптечных весах 0,5 кг печени, помещают в ступку, заливают 3 мл 5 % раствора ТХУ и растирают пестиком в течение 10 мин. Затем к экстракту прибавляют 3 мл дистиллированной воды, суспензию перемешивают и фильтруют через смоченный водой бумажный фильтр в чистую пробирку.

2.С полученными фильтратами выполняют качественные реакции на гликоген.

Берут 4 пробирки, в одну наливают 0,5 мл дистиллированной воды, во все остальные по 0,5 мл фильтрата, полученного из печени сытого животного. В первую и вторую пробирки добавляют по 2 капли раствора Люголя, в третью – 0,5 мл спирта, в четвертую насыпают порошок сульфата аммония до насыщения (т. е. до тех пор, пока на дне пробирки останутся не растворяющиеся кристаллы соли). Наблюдают результат.

Результаты оформляют в виде таблицы:

21

Печень сытого животного

Печень голодавшего животного

Выводы

Аэробный обмен углеводов

Катаболизм глюкозы – основной поставщик энергии для процессов жизнедеятельности организма. Аэробный распад глюкозы включает несколько стадий:

1.процесс окисления глюкозы с образованием 2 молекул пирувата;

2.превращение пирувата в ацетил-КоА и его дальнейшего окисления в цикле трикарбоновых кислот (цикл Кребса);

3.цепь переноса электронов на кислород, которая сопряжена с реакциями дегидрирования, происходящими в процессе распада глюкозы.

Первый этап аэробного гликолиза протекает в цитоплазме, второй и третий этап протекает в митохондриях.

Цикл трикарбоновых кислот Кребса, или цикл лимонной кислоты, представляет собой систему, осуществляющую распад продуктов метаболизма и вырабатывающую в ходе этого расщепления основную часть энергии, необходимую для организма. Ферменты цикла трикарбоновых кислот Кребса локализованы так же, как и ферменты клеточного окисления в митохондриях, но в матриксе.

Входе одного цикла Кребса окисляется одна молекула уксусной кислоты до СО2 и Н2О,

иресинтезируется новая молекула щавелевоуксусной кислоты (ЩУК). От окисляемого субстрата 2ē поступают в дыхательную цепь передачи электронов, где акцептором их служит кислород.

Из цикла следует: синтез лимонной кислоты и ее изомеризация в изолимонную кислоту; дегидрирование и декарбоксилирование изолимонной кислоты; окислительное декарбоксилирование α-кетоглутаровой кислоты; деацилирование сукцинил-КоА; дегидрирование яблочной кислоты до щавелевоуксусной кислоты.

Впроцессе аэробного распада глюкозы происходит 6 реакций дегидрирования, одна из них протекает в гликолизе и 5 – в цикле трикарбоновых кислот. Общее количество АТФ при окислении 1 моля глюкозы до СО2 и Н2О составляет 38 молекул АТФ.

Энергия выделяется в виде тепла и 12 молекул АТФ; из них 11 молекул АТФ образуются за счет окислительного фосфорилирования, а 1 – за счет субстратного фосфорилирования.

Регуляция цитратного цикла – аллостерическая регуляция – осуществляется за счет трех регуляторных ферментов: цитратсинтетазы (ингибируется АТФ и НАДН (Н+), активируется инсулином), изоцитратдегидрогеназы (ингибируется АТФ и НАДН (Н+)), сукцинатдегидрогеназы (ингибируется ЩУК, активируется Н3РО4).

Вцикле Кребса идет подготовка субстратов для дыхательной цепи в процессе распада уксусной кислоты. Кроме того, отдельные продукты этого цикла используются для анаболизма, например промежуточный продукт сукцинил-КоА может использоваться для синтеза гема.

Аэробный распад глюкозы происходит во многих тканях и органах и служит основным, но не единственным источником энергии. Некоторые ткани находятся в наибольшей зависимости от катаболизма глюкозы, как источника энергии (например, клетки мозга). Поэтому, недостаточное снабжение мозга глюкозой, или гипоксия, приводят к нарушениям функций мозга (головокружение, судороги, потеря сознания).

Ворганизме постоянный уровень сахара в крови поддерживается благодаря существованию регуляторных нейрогуморальных механизмов. Важнейшая роль в регуляции принадлежит гормонам. Инсулин понижает содержание глюкозы в крови, а глюкогон и адреналин повышают ее.

Концентрация глюкозы в артериальной крови в течение суток поддерживается на постоянном уровне – 3,3-6,2 ммоль/л. После приема углеводной пищи концентрация глюкозы может

22

возрастать в течение 1 часа до 8 ммоль/л (алиментарная гипергликемия), а затем возвращается к нормальному уровню (через 2 часа).

Основным показателем состоянием углеводного обмена служит определение концентрации глюкозы в крови и моче. Гипергликемия (повышение содержания глюкозы в крови) является довольно частым симптомом при различных заболеваниях, прежде всего с поражением эндокринной системы.

Наиболее часто гипергликемия связана с недостаточностью инсулина (сахарный диабет). При сахарном диабете кроме гипергликемии глюкоза появляется и в моче (глюкозурия), уменьшается содержание гликогена в печени, возрастает концентрация кетоновых тел в крови (кетонемия).

Гипергликемия может возникнуть не только при заболевании поджелудочной железы, но и при гипофизарных заболеваниях, опухолях коркового вещества надпочечников, гиперфункции щитовидной железы.

Определение содержания пировиноградной кислоты (ПВК) в сыворотке крови.

ПВК конденсируется с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием гидразона, который в щелочной среде приобретает коричнево-красный цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации ПВК.

Ход определения.

Перемешивают, через 5 минут опытную и стандартную пробы фотометрируют на ФЭКе против воды с синим светофильтром (длина волны 430 нм) в кювете с толщиной оптического слоя 5мм.

Расчет концентрации ПВК в сыворотке крови производят по формуле:

где Еоп и Ест - экстинция опыта и стандарта; 10 - содержание ПВК в стандарте, мкг/мл; 1000 - расчет на 1 л;

88- мкг-молекулярная масса ПВК.

Внорме в сыворотке крови содержится 34,1-102,2 мкмоль/л ПВК. Рост концентрации ПВК в крови наблюдается при авитаминозе и гиповитаминозе В1, при этом значительное повышение ее концентрации наблюдается и в других тканях, особенно в головном мозге. Повышенное содержание ПВК в крови отмечается также при гипоксиях, паренхиматозных заболеваниях печени, сахарном диабете, сердечной недостаточности, токсикозах, гиперфункции ги- пофизарно-адреналовой системы, после введения камфоры, стрихнина, адреналина. При наркозе содержание ПВК в крови снижается.

Обнаружение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в мышцах. Определение активности фермента основано на его способности катализировать реакцию дегидрирования янтарной кислоты с переносом атомов водорода на метиленовый синий, который при этом обесцвечивается.

Ход определения:

23

Пробы поставить в термостат.

Определить время обесцвечивания метиленовой сини.

Активность СДГ в крови, спинномозговой жидкости, околоплодных водах, биопсийном материале определяют при экспериментальных и клинических исследованиях, направленных на изучение биохимических механизмов действия ионизирующего и электромагнитного излучений, вибрации, токсических веществ на организм.

Методы определения концентрации глюкозы в крови

1. Глюкозо-оксидазный метод. β-D-глюкоза под действием фермента глюкозооксидазы окисляется до D-глюконолактона. Образующаяся в данной реакции перекись водорода при участии фермента пероксидазы способствует окислительному азосочетанию 4- аминоантипирина и фенола с образованием окрашенного соединения (хинониминовый краситель). Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна содержанию глюкозы в исследуемом материале и определяется фотометрически.

Схема реакции

глюкозооксидаза

β-D-глюкоза + О2 + Н2О глюконовая кислота + Н2О2

пероксидаза

2 Н2О2 + 4-ААР + фенол хинониминовый краситель + 4 Н2О

Исследуемый материал

Капиллярная или венозная кровь человека.

Для замедления гликолиза и предотвращения свертывания при заборе крови использовать пробирки, содержащие фторид натрия и антикоагулянт. Необходимое количество крови для исследования необходимо сразу после забора внести в пробирку с хлорной кислотой и тщательно перемешать.

Состав набора

Реагент № 1 – буфер. Реагент № 2 – лиофилизат.

Реагент № 3 – депротеинизатор. Калибратор – раствор глюкозы 10 ммоль/л.

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность

Содержимое одного флакона с реагентом № 2 растворить в содержимом одного флакона с реагентом № 1 при аккуратном перемешивании. Рабочий реагент готов к применению через 2 минуты после растворения.

Рабочий реагент стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 0С в защищенном от света месте. Необходимо тщательно закрывать флакон с рабочим реагентом после каждого использования.

Калибратор готов к использованию. После вскрытия флакона калибратор стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 0С

Невскрытые реагенты стабильны в течение года: реагенты № 1 и № 2 в защищенном от света месте; реагент № 2 и калибратор при температуре 2-8 0С, реагенты № 1 и № 3 при комнатной температуре. Срок годности, серия и номер набора по каталогу указаны на упаковке.

Подготовка образцов к анализу

24

Пробы тщательно перемешать и выдержать в течение 10 минут при комнатной температуре (18-25 0С), после чего опытные пробы центрифугировать с ускорением 900 g в течение 10 минут. Для дальнейшего анализа использовать прозрачную надосадочную жидкость. Надосадочную жидкость опытной пробы можно хранить в герметично закупоренном флаконе при температуре 2-8 0С не более 5 дней.

Процедура анализа

Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют не менее 20 минут при 37 0 С или 30 минут при комнатной температуре. После окончания инкубации измеряют оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы при длине волны 500 нм (490-540 нм). Окраска растворов стабильна в течение 1 часа после окончания инкубации при хранении проб в защищенном от света месте при комнатной температуре.

Расчет.

Расчет концентрации глюкозы в крови (С, моль/л) производят по формуле:

Епробы

С = х 10 ммоль/л,

Екалибр

где Епробы – оптическая плотность исследуемой пробы, Екалибр. – оптическая плотность калибровочной пробы, 10 ммоль/л - концентрация глюкозы в калибраторе.

Нормальные показатели

3,50 – 5,70 ммоль/л.

Аналитическая характеристика набора

Линейность – до 30 ммоль/л.

Значение коэффициента вариации - не более 5 %.

Обратите внимание: бледно-розовая окраска рабочего реагента с величиной оптической плотности до 0,250 А, измеренной против дистиллированной воды при длине волны 500 нм, не влияет на правильность определения глюкозы в исследуемом образце.

2. Гексокиназный метод. D-глюкоза под действием фермента гексокиназы при участии АТФ превращается в глюкозо-6-фосфат (Г-6-Ф). Образовавшийся в ходе данной реакции Г-6-Ф под действием фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-Ф-ДГ) и кофермента НАД превращается в 6-фосфоглюконолактон.

Количество образовавшегося НАДН2 в ходе реакции пропорционально количеству глюкозы в среде инкубации и может быть определено по изменению поглощения при 340 нм.

25

Свежая сыворотка крови или плазма (гепарин) крови без следов гемолиза, моча, цереброспинальная жидкость. Сыворотку и плазму крови отделить от форменных элементов как можно быстрее. Для замедления гликолиза и предотвращения свертывания при заборе крови использовать пробирки, содержащие фторид натрия и антикоагулянт.

Состав набора

Реагент № 1 – буфер.

Реагент № 2 – стабилизированный раствор ферментов. Калибратор – раствор глюкозы 5,55 ммоль/л.

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность

Для приготовления рабочего реагента необходимо смешать необходимое количество реагентов № 1 и № 2 в соотношении 100:1. Рабочий реагент стабилен не менее 3 месяцев при температуре 2-8 0С или 2 недели при комнатной температуре. Необходимо тщательно закрывать флаконы сразу после использования.

Калибратор готов к использованию. После вскрытия флакона калибратор стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 0С

Невскрытые флаконы стабильны в течение года при температуре 2-8 0С. Срок годности, серия и номер набора по каталогу указаны на упаковке.

Процедура анализа

Пробы тщательно перемешать и выдержать в течение 5 минут в термостате при температуре 37 0С или 10 минут при комнатной температуре (18-25 0С). После окончания инкубации измеряют оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы при длине волны 340 нм в кювете с длиной оптического пути 1,0 см. Величина оптической плотности раствора стабильна не менее 30 минут после окончания инкубации.

Расчет.

Расчет концентрации глюкозы в исследуемом образце (С, моль/л) производят по формуле:

Епробы

Екалибр

где Епробы – оптическая плотность исследуемой пробы, Екалибр. – оптическая плотность калибровочной пробы, 5,55 ммоль/л - концентрация глюкозы в калибраторе.

Нормальные показатели

Сыворотка/плазма - 3,9 – 5,8 ммоль/л. Цереброспинальная жидкость – 2,8 – 4,2 ммоль/л.

Аналитическая характеристика набора

Линейность – до 30 ммоль/л.

Значение коэффициента вариации - не более 5 %.

Обмен липидов

Переваривание и окисление липидов

Липиды – гетерогенная группа органических соединений, нерастворимых в воде, но растворимых в органических растворителях. К липидам относятся нейтральные жиры и жироподрбные вещества (липоиды). Липиды содержат в своем составе остатки жирных кислот, которые, взаимодействуя со

26

спиртом, образуют сложные эфиры. В качестве спирта в их состав чаще всего входит глицерин, но может входить и аминоспирт сфингозин. Биологическая роль липидов многообразна, но в основном они выполняют структурную функцию – построение мембран клетки и ее органелл. При окислении липидов высвобождается большое количество энергии (1 г – 38,94·103 Дж).

Нейтральные жиры – сложные эфиры глицерина и высших жирных кислот. Из насыщенных жирных кислот в состав жиров часто входят стеариновая кислота, пальминовая, а из ненасыщенных жирных кислот наиболее важные полинасыщенные: олеиновая, линолевая, линоленовая и арахидоновая кислоты.

Фосфолипиды и фосфатиды содержат, помимо глицерина, жирных кислот, еще фосфорную кислоту и азотистое основание. Фосфатиды можно рассматривать как производные фосфатидной кислоты, соединенной с различным азотистым основанием:

О

||

О СН2―О―С―R1

|||

СН2―О―Р―ОН ← азотистое основание

|

ОН

Фосфатидная кислота

Стерины (холестерин) представляют собой циклический одноатомный ненасыщенный спирт. Стероиды – сложный эфир холестерина с жирной кислотой. Холестерин (80 %) участвует в синтезе желчных кислот, витамина D3, гормонов коры надпочечников и половых, выполняет пластическую функцию.

Полинасыщенные жирные кислоты поддерживают жидкое состояние, присущее липидам клеточных мембран в норме, служат предшественниками тканевых гормоноподобных веществ, простагландинов, предотвращают отложение холестерина и других липидов в стенках кровеносных сосудов, что имеет первостепенное значение в патогенезе атеросклероза.

Жиры являются источником энергии для организма. При нормальном питании жиры дают 40 % энергии. В пищевых продуктах жиры распределены неравномерно: липиды содержатся в мозгах, икре, печени, желтке, нейтральные жиры – в сливочном масле, сале, полинасыщенные жирные кислоты или эссенциальные жирные кислоты (незаменимый фактор питания) – в растительных маслах.

Переваривание липидов происходит в основном в кишечнике под влиянием активной панкреатической липазы, так как в желудочном соке липаза малоактивна и действует только на эмульгированный жир молока. Чтобы подвергнуться действию липаз, липиды должны быть эмульгированы. Основным эмульгатором липидов являются желчные кислоты, вырабатываемые в печени (10-15 г в сутки). В переваривании липидов, помимо липазы, принимают участие фосфолипазы и холестеролэстераза. Эфиры холестерина под действием этого фермента гидролитически распадаются на холестерин и жирную кислоту.

К желчным кислотам относятся холевая, дезоксихолевая, хенодезоксихолевая и литохолевая, которые выделяются в виде парных желчных кислот в связанном виде с гликоколом или с таурином:

О

⁄⁄

NН2―СН2―СН2―S―ОН.

||

О

Эти парные желчные кислоты находятся в виде солей натрия.

Больше всего в организме содержится холевой кислоты в виде гликохолевой кислоты.

27

Желчные кислоты эмульгируют жиры, активируют панкреатическую липазу, активно участвуют во всасывании жирных кислот, образуя мицеллы.

Жирные кислоты всасываются только в комплексе с желчными кислотами. В стенках клетки кишечника этот комплекс распадается, желчные кислоты снова поступают в печень, а в стенке кишечника из глицерина и жирных кислот идет синтез специфического для данного организма нейтрального жира и фосфолипидов. Из клеток кишечника образовавшийся нейтральный жир переходит в лимфатическую систему и частично в кровь, а затем в печень и другие органы, подвергаясь разнообразным превращениям. Этот процесс осуществляется за счет хиломикронов, являющихся транспортной формой липидов. Они синтезируются в желудке, стенке кишечника и состоят из белковой оболочки (2 %) и липидного ядра (98 %). Хиломикроны разрушаются под влияниемфермента липопротеидлипазы, которая активируется гепарином. Липопротеидлипаза находится в крови и во всех тканях.

Жировое депо организма содержит большое количество жиров, которое способно мобилизоваться, т. е. подвергаться липолизу. Мобилизация жира происходит под влиянием клеточной липазы, которая активируется гормонами норадреналином и адреналином (сходство с мобилизацией гликогена). В клетке происходит распад липидов с освобождением энергии и синтез липидов (липогенез), который стимулируется инсулином. Распад глицерина и β-окисление жирных кислот к клетках играют важную роль при освобождении энергии. Проникновение жирных кислот из цитоплазмы внутрь митохондрий, где идет окисление жирных кислот, осуществляется под влиянием переносчика – карнитина.

К кетоновым телам относятся ацетон, β-оксимасляная кислота и ацетоуксусная кислота:

Биосинтез кетоновых тел происходит в печени при высокой концентрации в митохондриях ацетилКоА. У здорового человека в печени ацетоацетил-КоА конденсируется с ацетил-КоА с образованием β- окси-β-метилглутарила-КоА. В крови в норме они содержатся в очень небольшом количестве 13,4– 185,2 мкмоль/л (0,14-1,9 мг%). Если биосинтез кетоновых тел превышает потребности организма, они накапливаются в крови (кетонемия) и начинают выводиться с мочой (кетонурия). Это наблюдается при длительном голодании и при заболевании сахарным диабетом. Возрастание концентрации кетоновых тел в крови вызывает кетоацидоз. Кетоацидоз и кетонурия могут быстро привести к нарушению ионного гомеостаза и кетоацидозной коме. У здоровых людей после 1-2 недель голодания кетоновые тела начинают использоваться в качестве источника энергии некоторыми тканями (нервная ткань).

Полиненасыщенные жирные кислоты вступают при определенных условиях в реакции свободного радикального окисления, промежуточным продуктом таких реакций явдяется перекиси липидов. Поэтому такой процесс называется перекисным окислением липидов (ПОЛ). Реакции перекисного окисления липидов инициируются в живом организме активными формами кислорода, которые образуются в живых клетках в результате последовательного присоединения электронов к молекуле кислорода (до 4 электронов). К активной форме кислорода относят гидроксильный радикал (ОН*), супероксидный анион радикал (О2*-), пероксид водорода (Н2О2).

Активные формы кислорода легко окисляют, кроме полиненасыщенных жирных кислот, белки, азотистые основания, входящие в структуру ДНК, различные мембранные структуры клеток. В результате появления в гидрофобном слое мембран гидрофильных зон за счет перекисей жирных кислот в клетки могут проникать вода, ионы натрия, кальция, что приводит к набуханию клеток, органелл и их разрушению.

Активация ПОЛ характерна для многих заболеваний: дистрофии мышщ, болезни Паркинсона, при атеросклерозе, развитии опухолей. ПУЛ резко активируется при реоксигенации тканей, например, при спазме коронарных артерий и их последующем расширении.

Выделяют систему защиты клеток от активных форм кислорода, которая называется антиаксидантной системой. К ней относятся ферменты антиоксидазного действия – супероксид дисмутаза (СОД),

28

которая переводит супероксидные радикалы в перекись водорода, каталаза (разрушает перекись водородв до воды и молекулярного кислорода), система глутатиона. Система глутатиона включает фермент глутатионпероксидазу, которая разрушает перекиси органического происхождения с участием восстановленного глутатиона и глутатионредуктазу, которая в последующем восстанавливает глутатион.

Кроме того, существуют жирорастворимые антиоксиданты (витамин Е, β-каротин и др.) и водорастворимые антиоксиданты, такие как витамин С, мочевая кислота и др. соединения.

Антиоксиданые системы наряду с прооксидантными поддерживают низкий уровень перекисного окисления липидов в клетках, как нормально существующий процесс.

Как физиологическое явление увеличение содержания липидов в крови (гиперлипемия) наступает через 1-4 ч после принятия пищи. Концентрация липидов крови увеличивается (гиперлипемия) при диабете (до 10-20 г/л), липоидном нефрозе, циррозе печени, ожирении, атеросклерозе, ишемической болезни сердца, гипотиреозе, панкреотите.

Концентрация свободных неэстерифицированных жирных кислот в сыворотке крови увеличивается при сахарном диабете, после введения адреналина, при голодании, поскольку идет мобилизация жира из жирового депо, и свободные жирные кислоты транспортивуются в комплексе с альбуминами. Уменьшается содержание свободных жирных кислот в сыворотке крови после введения инсулина и глюкозы.

Качественная реакция (Петтенкофера) на желчные кислоты. При взаимодействии желч-

ных кислот с оксиметилфурфуролом, образующимся из сахарозы под действием концентрированной серной кислоты, появляется красно фиолетовое окрашивание.

Ход определения. В сухую чашку Петри, под которую подложен лист белой бумаги, наносят 2 капли желчи, 2 капли 20 % раствора сахарозы и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Затем приливают 7 капель концентрированной серной кислоты и снова перемешивают. Окрашивание пробы в красно фиолетовый цвет, определяемый на белом фоне, свидетельствует о наличии желчных кислот в данном биологическом материале.

Диагностическое значение имеет определение желчных кислот в моче, кале и дуоденальном содержимом. В норме моча человека содержит минимальное количество желчных кислот, не выявляемое данным методом. Их количество увеличивается при механической и паренхиматозной желтухах, но не изменяется при гемолитической. Выделение желчных кислот с калом наблюдается при усиленной перистальтике кишечника.

Определение концентрации триглицеридов в сыворотке и плазме крови энзиматическим методом. Липаза катализирует гидролиз липидов до глицерина и жирных кислот. Глицерин запускает ряд сопряженных ферментативных реакций с участием ферментов глицерокиназы в присутствии АТФ и глицеролфосфатоксидазы. Образующаяся в ходе данных реакций перекись водорода при участии фермента пероксидазы способствует окислительному азосочетанию 4-аминоантипирина и фенола с образованием окрашенного соединения (хинониминовый краситель). Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна содержанию триглицеридов в исследуемом материале и определяется фотометрически.

липаза

триглицериды глицерин + жирные кислоты,

глицерокиназа

глицеролфосфатоксидаза

глицерол-3-фосфат + О2 диоксиацетонфосфат + Н2О2

пероксидаза

2 Н2О + 4-ААР + фенол хинониминовый краситель + 4 Н2О

Исследуемый материал

Свежая сыворотка крови, гепаринизированная или ЭДТА-плазма крови без следов гемолиза. Забор крови желательно производить после 12-ти часового голодания. Исследуемый материал может храниться 3 дня при температуре 2 – 8 °С.

Состав набора

Монореагент.

29

Калибратор - 2,29 ммоль/л.

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность

Монореагент готов к применению. После вскрытия флакона монореагент стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 °С в защищенном от света месте. Необходимо тщательно закрывать флакон с монореагентом после каждого использования.

Бледно-розовая окраска монореагента с величиной оптической плотности до 0,250 А, измеренной против дистиллированной воды при длине волны 500 нм, не влияет на правильность определения триглицеридов в исследуемом образце. Необходимо избегайть контакта монореагента с источниками глицерина извне (мыла, крема и др.). Калибратор готов к применению. После вскрытия флакона калибратор стабилен не менее 6 месяцев при температуре 2-8 °С.

Невскрытые реагенты стабильны в течение года при температуре 2-8 °С, монореагент в защищенном от света месте. Дата изготовления, серия и номер по каталогу указаны на упаковке.

Процедура анализа

Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют не менее 15 минут при комнатной температуре (18-25 °С) или 10 минут при температуре 37 °С. После окончания инкубации измеряю оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной (холостой) пробы при длине волны 500 нм (490-540 нм).

Окраска растворов стабильна втечение 1 часа после окончания инкубации при хранении проб в защищенном от света месте при комнатной температуре. Объемы исследуемого образца и монореагента можно изменить, соблюдая соотношение 1:100.

Расчет

Расчет концентрации триглицеридов (С, ммоль/л) проведите по формуле:

Епробы

Е калибр.

где Епробы – единица оптической плотности исследуемой пробы, Екалибр. - единица оптической плотности калибровочной пробы, 2,29 ммоль/л -концентрация триглицеридов в калибраторе.

Нормальные показатели

0,15 - 1,71 ммоль/л или 13 - 160 мг/100 мл.

Группа риска: 1,71 - 2,29 ммоль/л или 160 - 200 мг/100 мл. Патологические показатели: >2,29 ммоль/л или 200 мг/100 мл.

Аналитические характеристики набора

Линейность - 0,1-11,4 ммоль/л. Коэффициент вариации - не более 5%.

Наибольшее клиническое значение имеет определение концентрации общих липидов при фенотипировании гиперлипидемий. Кроме того, повышение данного показателя наблюдается при нефротическом синдроме, массивных переломах трубчатых костей, гипотиреозе, хроническом алкоголизме, возможно и алиментарное происхождение.

Влияние активации перекисного окисления липидов на устойчивость эритроцитарной мембраны. Избыточная генерация свободных радикалов (O2-, OH-, HO2-, H2O2 и др.) играет ведущую роль в патогенезе повреждения клеток при целом ряде патологических состояний. Окислительный стресс нарушает структуру всех макромолекул и надмолекулярных комплексов: повреждаются белки,

30