Рожков Ю. И. Популяции, виды, эволюция

электрофоретическим разделением образовавшейся смеси фрагментов ДНК в гелевых пластинах. Используя специальные методы, на которых мы здесь не будем останавливаться (Botstein et al., 1980), после электрофореза можно «проявить» фрагменты, принадлежащие только конкретному гену. В результате обнаружится набор полос, в которых локализуются фрагменты различной длины, расфракционированные по своему размеру.

Есливпопуляцияхимеетсяполиморфизмпоналичию–отсутствиюсайтоврестрик- ции (участков двухцепочной ДНК, расщепляемых рестриктазами), то для разных аллельных вариантов будут выявляться разные наборы фрагментов ДНК с различающимися по подвижности фракциями. Гетерозиготы, естественно, будут характеризоваться их смесью. При этом интерпретация таких фореграмм во многом сходна с интерпретацией электрофореграмм белков. Во всяком случае, в простейшей ситуации общая картина разделения напоминает ту, что изображена на рисунке 72.1. Выявленную таким образом изменчивость именуют полиморфизмом длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ; англ. RFLP – restriction fragment length polymorphism).

Втех же случаях, когда на гелевых пластинах выявляют не один ген (локус), а их множество, получают картину, внешне сходную с разделением смеси различных белков. Как в том, так и в другом случае, эти картины крайне сложны и обычно не поддаются чёткой и однозначной расшифровке. Однако, мультилокусные картины разделения фрагментов ДНК (фингерпринты ДНК) в отличие от белковых «фингерпринтов» независимы от биохимии и физиологии организмов, «сигнализируют» только о генетике (с поправкой, конечно, на методические погрешности) и могут с успехом использоваться в соответствующих генетических исследованиях.

Некоторые ограничения касаются их применимости при популяционных исследованиях. Однако, при выявлении родства и происхождения они незаменимы, так как абсолютно специфичны для отдельных особей и дают информацию сразу по большому числу крайне полиморфных локусов (Jeffreys et al., 1988; Wright, 1993; Рысков, 1999).

Другой подход, позволяющий анализировать ничтожные количества материала – это выявление полиморфизма ДНК путём применения полимеразной цепной реакции (ПцР; англ. PCR) как мы уже отмечали в гл. 3. Метод основан на использовании пар специфических праймеров (коротких искусственно синтезированных нуклеотидных последовательностей – затравок реакции), комплементарно связывающихся in vitro

сучастками ДНК, расположенными с обоих концов исследуемого гена. После этого фрагмент, «зажатый» между праймерами, амплифицируется («размножается» путём каскадно идущей репликации ДНК) и доводит свою численность до 1–2 млн. копий. Полученный таким способом достаточный для анализа материал подвергается впоследствии, если это необходимо, дополнительной обработке рестриктазами, а далее, как обычно – электрофорезу (Saiki et al., 1988; Саики и др., 1990), после чего можно выявить тот же ПДРФ (рис. 78).

Введение в эту схему секвенирования (метода определения последовательности нуклеотидов) амплифицированного отрезка ДНК позволяет получить исчерпывающую информацию.

Внастоящее время создано множество частных методик, позволяющих выявлять различные типы полиморфизма ДНК, связанного как с «канатной», так и с «генной» частями генома. Наиболее важные типы полиморфизма охарактеризованы в таблице

14.

Вслучае проведения исследований по однонуклеотидному полиморфизму (SNP), могут быть применены различные методы. По-видимому, наиболее перспективен для сравнения массовых (полупроизводственных) анализов метод гибридизации (размноженных ПцР) полиморфных генов с олигонуклеотидной пробой. Последняя полно-

180

Рис. 78. Схемы разделения в агарозном геле фрагментов, расщепленных рестриктазами генов крупного рогатого скота (ПДРФ-ПцР-полиморфизм): 1 – разделение фрагментов гена каппа – казеина, расщеплённых рестриктазой Pst I: (1) – амплификат (нерасщеплённый ПцР-продукт,

(2) – генотип АА, (3) – генотип АВ, (4) – генотип BB, (М) – маркерная ДНК плазмиды pBR 322, расщепленная рестриктазой Alu I, выполняющая роль «измерительной линейки». 2 – разделение фрагментов гена соматотропина рестриктазой Alu I: (1) – амплификат, (2) – генотип LL, (3) – генотип LV, (4) – генотип VV, (М) – маркерная ДНК плазмиды pBR 322, расщепленная рестриктазой Alu I. цифры по бокам схем–фореграмм характеризуют длины рестрикционных фрагментов в числе пар нуклеотидов. Разделение фрагментов идет по молекулярной массе (чем она меньше, тем быстрее движется фрагмент). Не зачернены стартовые лунки в геле (Калашни-

кова и др., 2001).

стью комплементарна к тому участку ДНК, по которому различаются аллели. Аллельспецифичный олигонуклеотид, меченый флуорофором, заблокированным гасителем, при связывании с ДНК теряет гаситель и начинает светиться. По этому свечению и выявляют тот или иной аллель. Некоторые методы позволяют выявлять несколько SNP в одной пробирке (Кофиади, Ребрикова, 2006; Ребриков и др., 2009).

На рисунке 79 представлен тот же спектр генотипов гена каппа-казеина КРС, что

ина рисунке 78.1, но «в живую» (фото части геля с выделенными фрагментами в 777

и471 п.н.). Тот же полиморфизм с А и В аллелями и с примерно такой же картинкой выявляются и при непосредственном разделении самого каппа-казеина в крахмальном или полиакриламидном геле.

Того же рода и также легко интерпретируемый RFLP-PCR (рестрикционный) полиморфизм по гену НАДФН-оксидазы (CYBA) человека представлен на рисунке 80. Верхняя гелевая пластина – 4-й экзон гена (242 С>T), нижняя – 3’ – нетранслируемая область гена (640 А>G).

Совсем другого рода электрофоретические «картины» получают, используя RAPD (random amplified polymorphic DNA). Для этих целей применяют короткие праймеры (обычно не более 20 пар нуклеотидов) с произвольно выбранными последовательностями. С помощью них проводят ПцР, размножая участки ДНК, происходящие из разных частей генома. Полиморфизм выражается в наличии-отсутствии фрагментов соответствующей длины в геле и доминантном наследовании (на манер изображённого на рисунке 75 для белков, только со множеством локусов). На рисунке 81 в качестве примера даны фотографии гелей со спектрами амплифицированных после-

181

Рис. 79. Часть пластины агарозного геля с различными аллельными вариантами (фрагмент 777 и 471 п.н. – рис. 78.1) гена каппа-казеина крупного рогатого скота. М – маркёр (фото предоставлено Л.А. Калашниковой).

Рис. 80. Электрофоретическое разделение продуктов ПцР-рестрикции в агарозных гелях. а – генотипирование полиморфизма СYВА 242С>Т (2%-ный агарозный гель). Наличие гомозиготного мутантного генотипа 242ТТ (присутствует сайт узнавания для RsaI) характеризуется наличием двух фрагментов размерами 193 и 160 пн (на геле образцы 1, 5 и 12). Наличие гомозиготного генотипа дикого типа 242СС (потеря сайта узнавания для RsaI) характеризуется наличием фрагмента размером 353 пн (образцы 4, 6, 8, 10, 11, 14, 17, 18 и 20). Гетерозиготные генотипы характеризуются наличием всех трёх фрагментов 353, 193 и 160 пп (образцы 2, 3, 7, 9, 13, 15, 16 и 19); б – генотипирование полиморфизма СYВА 640А>G (3%-ный агарозный гель). Наличие гомозиготного генотипа дикого типа 640GG (потеря сайта узнавания для DraIII) характеризуется наличием фрагмента размером 227 пн (на геле образцы 3, 11 и 19). Наличие гомозиготного мутантного генотипа 640GG (потеря сайта узнавания для DraIII) характеризуется наличием фрагмента размером 258 пн (образцы 4, 5, 12, 13, 14, 18 и 20). Гетерозиготные генотипы характеризуются наличием двух фрагментов размерами 258 и 227 пн (образцы 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 16, и 17) (Иванов и др., 2008).

184

Рис. 81. RAPD – PCR спектры ДНК сибирской (Capreolus capreolus pygargus) и европейской косуль (C. с. capreolus), полученные с помощью праймера 5’-CCGGCCTTAC-3’, (Петросян и др., 2007).

довательностей ДНК сибирской (Capreolus capreolus pygargus) и европейской косуль (C. с. capreolus)17 c двумя разными праймерами. Популяционно-генетические параметры при этом рассчитываются с помощью специальных математических приёмов

(Zhivotovsky, 1999; Петросян и др., 2002; Петросян и др., 2007).

Другой аналогичный пример – это межмикросателитный полиморфизм (ISSR – Inter-Simple Sequence Repeats), являющийся по сути дела разновидностью RAPD. Различия только в том, что в качестве праймеров избираются повторы звеньев в несколько нуклеотидов. Соответственно размножается в ПцР и разгоняется в ходе электрофореза всё то, что лежит между используемыми повторами. На рисунке 82 представлен ISSRполиморфизм с праймерами на основе динуклеотидных повторов (AG – вверху, GA

– внизу). Интерпретация полос и методы расчёта генетических параметров, естественно, те же, что и для «истинного» RAPD-метода.18

Измножестваметодов,которыеиспользуютдлявыявленияоднолокусногополиморфизма (SNP), приведём в качестве примера один из «сложноустроенных». заключается он в использовании для ПцР четырёх праймеров: двух внутренних аллель-специфич- ных и двух наружных (обрамляющих ген) аллель-неспецифичных. После электрофо-

17Европейская и сибирская косули являются полувидами, поэтому одни авторы описывают их как подвиды, другие (Данилкин, 1999), как разные виды, т.е. C. capreolus и C. pygargus.

18Вообще же следует отметить, что различные модификации методов, отмеченных в таблице 14, часто имеют собственные «замысловатые» аббревиатуры, совершенно не схожие с «родительскими» аббревиатурами.

185

Рис. 82. Разделение продуктов ПцР амплификации в агарозном геле ДНК северного оленя Rangifer tarandus (ISSR-PCR анализ) при использовании праймера (AG)9C. М – маркер. (Кол, Лазеб-

ный, 2006).

реза продуктов амплификации получается набор полос, однозначно характеризующий каждый генотип. На рисунке 83 представлен соответствующий ДНК-анализ полиморфизма гена ацетилхолинэстеразы (ACAE) колорадского жука Leptionotarsa decemlineata с помощью метода ПцР-амплификации специфических аллелей (bi-PASA). Этим методом выявляется два аллеля (рис. 84), различающиеся длиной амплифицированных фрагментов в 206 и 126 пн.

** *

Внедалёком будущем нам обещают очередную революцию в методах прочтения нуклеотидного содержания генов.

Громоздкие секвенаторы, напоминающие тумбы (и даже внушительных размеров ящики), делающие своё дело часами, уйдут в прошлое. Обещано, что прочтение гена будет «делом секунд», а генома – «минутным делом». Материальные же затраты на проведение подобных аналитических работ, в отличие от нынешних, будут ничтожными. Да и сам прибор, «читающий генетический текст», разместится на ладони или в кармане и сможет, таким образом, сопровождать исследователя повсюду, а не только находиться в лаборатории.

Пока что мало известно о способе действия этого прибора. Но разработчики (Oxford Nanopore Technology) намекают, что всё дело в анализе индивидуальной молекулы ДНК, протягиваемой сквозь нанопору в кремниевом полупроводнике. От того, какой нуклеотид проходит сквозь отверстие, зависят считываемые электрические характеристики. Они и используются для последовательной идентификации нуклеотидов в ДНК. Понятно, что, так как весь процесс идёт на микроскопическом (точнее наноскопическом) уровне, он осуществляется в этих масштабах практически «мгновенно» в

186

Рис. 83. Идентификация аллелей гена AChE колорадского жука Leptionotarsa decemlineata: а – сравнение нуклеотидной и аминокислотной последовательностей. Верхняя последовательность

– S-тип, нижняя – R-тип. Вертикальной рамкой отмечен триплет (Leontieva et al., 2006). б – схема bi-PASA для детекции гена AChE (по Williamson et al., 1996). Пунктирные линии – нативные цепи ДНК, сплошные – продукты амплификации (указана их длина в пн). Стрелки с номерами: 1, 2 – аллель-специфичные, 3, 4 – аллель-неспецифичные праймеры с направлениями дальнейшей элонгации (Беньковская и др., 2008).

Рис. 84. Электрофореграмма результатов bi-PASA фрагмента гена AChE колорадского жука Leptionotarsa decemlineata. RR – гомозиготы (фрагмент длиной в 126 пн), SR – гетерозиготы (фрагменты длиной в 206 и 126 пн). Фрагмент длиной в 293 пн – продукт неспецифической ПцР с участием двух внешних праймеров (Беньковская и др., 2008).

187

отличие от стандартных способов расшифровки, связанных с длительным электрофоретическим разделением фракций и с другими процедурами.

К сожалению, пока метод не доведён до совершенства и даёт много ошибок. Однако, без сомнения, за ним большое будущее. Так что вполне возможно, многие из существующих ныне способов анализа ДНК (часть из которых мы обсуждали выше) со временем уйдут в прошлое. Впрочем, в фундаментальной науке всё это видимо не приведёт к каким-то уж особо кардинальным открытиям. Новый метод способен лишь резко ускорить, упростить и удешевить получение информации, которую «в замедленном темпе» и без того получали и получают «старыми» методами. Тем не менее, он, конечно, будет крайне полезен в исследованиях по ДНК-полиморфизму, в прикладной науке и в практике (медицина, сельское хозяйство).

188

ГЛАВА 18. МЕХАНИзМы ПОДДЕРжАНИЯ ПОЛИМОРФИзМА

Несмотря на исключительную разрешающую способность ДНК – методов, всё же следует отметить, что самые значительные результаты были получены ранее (50–80 гг. прошлого века) на основе белковых методик.

Именно с помощью их были «сняты сливки» и открыт невероятно огромный уровень генетической изменчивости. Для примера, в таблице 15 приводим данные тех лет, систематизированные в работе Айалы (1984).

Напомним, что для измерения уровня генетической изменчивости по электроморфам белков (ферментов), наблюдаемой в популяциях (а также и в других случаях), как правило, применяют два показателя. Это доля гетерозиготных особей и доля полиаллельных (полиморфных) локусов в общем числе всех исследованных локусов (полиморфные + мономорфные). Первый показатель вполне объективен – он увеличивается по мере возрастания в популяции числа аллелей по тому или иному локусу и выравнивания их частот. Второй показатель несколько субъективен, так как связан отчасти с искусственным введением критериев полиморфности (обычно используется 99 и 95% -й критерии, то есть в первом случае полиморфным считается локус, в котором частота

Таблица 15

Генетическая изменчивость (определённая по электроморфам белков) разных групп животных и растений по данным 70-х, 80-х и начала 90-х годов

(Айала, 1984 с добавлениями из Nevo (N) et al., 1984 и Ward (W) et al., 1992)

189