Задание 11. Обнаружение каталазы и пероксидазы в растительных объектах

Оборудование и реактивы: клубни картофеля, фарфоровая ступка с пестиком, 3% раствор H₂O₂, 1% раствор гидрохинона, воронки, пробирки, лезвия, пипетки, фильтровальная бумага.

Обнаружение каталазы

В растительных тканях в процессе окисления ряда веществ под действием оксидаз образуется перекись водорода:

AH₂ + O₂ A + H₂O₂

В значительных количествах перекись оказывает токсическое действие на цитоплазму клеток. Обезвреживание перекиси выполняет Fe-содержащий фермент – каталаза:

2H₂O₂ 2H₂O + O₂

Ход работы:

Кусочек очищенного клубня картофеля – 10-15г измельчить и растереть в фарфоровой ступке с 2-3 мл дистиллированной воды. Добавить еще 8-10 мл воды, перемешать смесь, отфильтровать в сухую пробирку. К 3 мл вытяжки добавить 2 мл 3% H₂O₂ , понаблюдать за появлением пузырьков кислорода. На основании визуальных наблюдений сформулировать выводы.

Обнаружение пероксидазы

Окислительно-восстановительный Fe-содержащий фермент – пероксидаза осуществляет окисление гидрохинона в хинон, этот процесс сопровождается изменением окраски раствора:

Ход работы

Вытяжку картофеля разливают поровну по трем пробиркам:

1) 2 мл вытяжки + 0,5 мл 3% H₂O₂;

2) 2 мл вытяжки;

3) 2 мл вытяжки прокипятить в течение 1 мин. + 0,5 мл 3% H₂O_2.

В каждую поровну добавляют по 5 капель раствора гидрохинона и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре. Сравнить окраску содержимого трех пробирок и записать выводы.

Задание 12. Определение активности тирозиназы

Оборудование и реактивы: 1) измельчитель; 2) пробирки; 3) пипетки; 4) термостат (водяная баня); 5) тирозин, 1% раствор.

Тирозиназа относится к классу оксидоредуктаз, к группе фенолоксидаз. Этот фермент, в отличие от других ферментов этой группы, обладает групповой (относительной) специфичностью и катализирует окисление не только монофенолов, но и полифенолов. Тирозиназа широко распространена в растительных организмах. По своей природе она является медьсодержащим протеидом.

За каталитическим действием можно наблюдать по реакции окисления тирозина кислородом воздуха в присутствии препарата тирозиназы. В процессе окисления из тирозина образуется красный пигмент гелохром, а затем пигмент-меланин.

Ход работы:

Клубень картофеля растирают и навеску 1-2 г растительной массы заливают 5 мл воды и тщательно перемешивают. Полученную взвесь фильтруют и фильтрат используют как препарат фермента.

В две пробирки наливают по 1 мл препарата фермента. Содержимое одной из них (для “холостого” определения) нагревают до кипения и кипятят 1-2 минуты, а затем охлаждают. В обе пробирки добавляют по 1 мл 1% раствора тирозина и при периодическом (через 3 минуты) перемешивании встряхиванием реакционную смесь инкубируют при температуре 40С.

За окислением жидкости наблюдают в пробирках. Жидкость в пробирке с активной вытяжкой из картофеля постепенно становится сначала розовой, а затем бурой и, наконец, черной. В “холостой” пробе с инактивированным ферментом цвет жидкости в пробирке не изменяется. Результаты наблюдения фиксируют в тетради и делают вывод о каталитическом действии тирозиназы.

Задание 13. Определение активности каталазы

Оборудование и реактивы. Весы технические, термостат, мерные колбы на 50 мл, бюретки, колбы конические на 100 мл, пипетки на 5 и 20 мл, воронки, бумажные фильтры, фарфоровые ступки, кварцевый песок, 1-% -ный раствор Н₂О₂ , 0,1 N раствор КМnО₄, 0,1 М фосфатный буфер, рН 6,8, 2N раствор серной кислоты.

Материалы: листья, лук, проростки.

Каталаза осуществляет превращение пероксида водорода в Н₂ О и О₂ по уравнению:

2H₂O₂ 2H₂O + O₂

Метод основан на учёте оставшейеся после действия каталазы перекиси водорода титрованием раствором KMnO ₄

Ход работы:

Растирают в ступке 5 г растительного материала с кварцевым песком и 5 мл фосфатного буфера. Содержимое ступки количественно переносят в мерную колбу, доводя объём до 50 мл. Смесь перемешивают и ставят в термостат при 37⁰ С на 15 мин, по истечении которых смесь фильтруют. В две конические колбы вносят по 20 мл фильтрата. В одну колбу - контроль вливают 5 мл 2 N раствора H₂SO₄ для инактивации фермента, затем в обе колбы приливают по 20 мл воды и по 3 мл раствора перекиси, перемешивают и оставляют в термостате при 37 ⁰С на 15 мин. По истечении указанного времени в опытную колбу добавляют 5 мл 2N раствора серной кислоты, перемешивают и титруют содержимое обеих колб 0,1N раствором KМnO₄ до слаборозовой окраски, не исчезающей в течении 30 сек. Активность каталазы (V, ед/г) рассчитывают по формуле;

А и В-количество KМnO₄ , пошедшее на титрование опытной и контрольной проб, мл.

К – поправка к титру 0,1н раствора KМnO₄

C -объём смеси, мл.

С₁- объём, взятый для титрования, мл.

n- навеска растительного материала,г.

t- время,час.

Подсчитывают результаты и делают вывод об активности каталазы.