Задание 9. Определение оптимальных значений pH для различных ферментов

Оборудование и реактивы: 1) 1% р-р клейстеризованного крахмала; 2) солод, разведенный водой в 10-20 раз и отфильтрованный; 3) 0,15 М р-р Na₂HPO₄ · 2H₂O; 4) 0,15 М р-р KH₂ PO₄; 5) р-р йода в йодистом калии в капельнице (4 г йодистого калия и 2 г йода в 100 мл воды); 6) пробирки в штативе; 7) пипетки мерные на 100 мл; 8) фильтры бумажные; 9) воронки.

Характерным свойством ферментов является их чувствительность к изменению реакции среды. Активность ферментов резко меняется в зависимости от величины pH. Объясняется это тем, что при изменении pH меняется величина или даже знак заряда молекулы фермента, а в некоторых случаях и заряд молекулы субстрата. Все это приводит к тому, что успешное образование фермент-субстратного комплекса происходит только при вполне определенном значении pH.

Для определения оптимального значения pH фермента готовится ряд буферных растворов с различной величиной pH. К каждому раствору добавляется фермент. Величина pH раствора, в котором количество продуктов реакции окажется наибольшим, является оптимальным для данного фермента.

Определение оптимума pH для -амилазы основано на том, что -амилаза катализирует гидролитическое расщепление крахмала с образованием, главным образом, декстринов и небольшого количества мальтозы. За ходом реакции удобно следить по реакции с йодом. Образующиеся при гидролизе декстрины дают с йодом различную окраску в зависимости от величины молекулы декстрина. Ход гидролиза схематически можно представить так: крахмал амилодекстрины эритродекстрины ахродекстрины мальтодекстрины

Окраска с йодом в ходе гидролиза меняется следующим образом: синяя фиолетовая вишневая светло-коричневая бесцветная. В качестве источника -амилазы можно использовать солод.

Ход работы:

Небольшое количество солода развести дистиллированной водой в 10-20 раз и профильтровать. Приготовить 8 растворов с различными значениями pH: от 5,3 до 8,8 путем смешивания 0,15 М Na₂HPO₄ •2H₂O и KH₂PO₄ в указанных соотношениях:

pH	Na2HPO4, мл	KH2PO4, мл	pH	Na2HPO4, мл	KH2PO4, мл
5.3	0.27	9,73	7,3	7,64	2,36
5.8	0.83	9,17	7,8	9,11	0,89
6.3	2.31	7,69	8,3	9,73	0,27
6.6	5.00	5,00	8,8	9,93	0,07

Все 8 пробирок заполняют буферными растворами с различными значениями pH (по 2,5 мл) с добавлением в каждую из них 5 мл раствора крахмала и 2,5 мл раствора солода. Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать и оставить на 15-20 мин. при комнатной температуре. Затем во все пробирки добавить по 2-3 капли раствора йода, пронаблюдать за развитием окраски и результаты занести в таблицу:

pH реакционной смеси	Получаемая окраска	pH реакционной смеси	Получаемая окраска
5,3		7,3
5,8		7,8
6,3		8,3
6,8		8,8

Определить, при каком значении pH гидролиз идет наиболее интенсивно и каково, следовательно, оптимальное значение pH для -амилазы, сравнить ферментативную активность солода в зависимости от рН реакционной смеси.

Задание 10. Влияние температуры на активность ферментов

Оборудование и реактивы: водяная баня, холодильник, весы, фарфоровые ступки, термометр, колбы на 100-200 мл, пипетки на 1, 2, 5, 10 мл, пробирки;

1–%-ный раствор сахарозы, фелингова жидкость, 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0.

Материалы: прессованные или сухие дрожжи.

На активность ферментов оказывает влияние температура: низкая температура снижает активность, а её повышение от минимальной до оптимальной увеличивает активность ферментов. Температура свыше 60⁰ С денатурирует белки, что сопровождается потерей ферментативной активности. Инвертаза вызывает гидролитическое расщепление сахарозы на глюкозу и фруктозу .

Ход работы

1.Выделение фермента: 2 г сухих дрожжей растирают в течении 5-10 мин с кварцевым песком и 5 мл фосфатного буфера, затем добавляют 20 мл буфера, нагретого до 60⁰ С и через 20 мин центрифугируют при 3000 об\мин в течении 10 мин.

2.Определение активности инвертазы. В каждую из четырёх пробирок наливают по 1 мл вытяжки дрожжей и пробирки помещают в разный температурный режим: 1 – в холодильник, 2 – при комнатной температуре, 3 – в водяную баню при температуре 40⁰5 С, 4 – кипятят. Добавляют во все пробирки по 5 мл раствора сахарозы, перемешивают и через 15 мин во все пробирки приливают по 5 мл фелинговой жидкости и нагревают в кипящей водяной бане. Выпадает красный осадок закиси меди, по количеству которого судят о влиянии температуры на активность инвертазы.