Задание 3. Определение триптофана в зерне сельскохозяйственных растений

Оборудование и реактивы: 2,5% р-р п-диметиламинобензальдегида в 10% р-ре HCI (хранится в холодильнике не более двух недель); 1% р-р NaNO₃; 4% р-р желатина в 25% р-ре КОН; концентрированная соляная кислота (плотность 1,19); мука пшеничная, кукурузная, гороховая (просеянная через сито и обезжиренная); водяная баня с терморегулятором или термостат; пробирки с резиновыми пробками; бюретка на 50 мл; пипетка на 1 мл; торзионные весы; фотоэлектроколориметр.

После щелочного гидролиза содержащихся в муке белков, триптофан обнаруживается по реакции с п-диметиламино-бензальдегидом в сильнокислой среде в присутствии нитрата натрия. Интенсивность развивающейся при этом окраски пропорциональна содержанию триптофана и измеряется на фотоэлектроколориметре.

Ход работы:

На торзионных весах берут навески по 10 мг муки, осторожно переносят их на дно пробирки и заливают 0,3 мл 25% р-ра КОН с желатином. Пробирку осторожно встряхивают, чтобы мука не прилипла к стенкам и ставят в термостат или водяную баню при t = 80⁰С на 20-30 мин. После гидролиза в пробирки добавляют 0,1 мл 1% р-ра NaNO₃ и 4 мл концентрированной HCI, которую приливают из бюретки под тягой. Пробирки закрывают резиновыми пробками и ставят в термостат при t = 10⁰С на 40 мин. После этого раствор в пробирках доводят дистиллированной водой до 10 мл, фильтруют и колориметрируют через красный светофильтр. Содержание триптофана в навеске определяют по калибровочному графику и выражают в процентах. Результаты работы записывают в виде следующей таблицы:

Название культуры	Навеска муки	Оптическая плотность	Содержание триптофана в навеске
			г	%

Задание4. Определение аминокислот методом тонкослойной хроматографии (тсх)

Оборудование и реактивы: хроматографические камеры, шкаф для сушки хроматограмм, пульверизаторы для опрыскивания хроматограмм, пластинки силуфола, микропипетки, микрошприцы, набор аминокислот, нингидрин, бутанол, уксусная кислота, ацетон.

Хроматографический метод, разработанный известным русским ученым М.С.Цветом, является одним из наиболее быстрых, точных и простых приемов анализа сложных смесей веществ.

Сущность хроматографического метода состоит в том, что при движении через пористую среду смесь веществ разделяется под действием различных факторов. Такими факторами являются:

1. различная адсорбируемость компонентов исследуемой смеси;

2. обмен между ионами раствора и ионами на поверхности адсорбента;

3. различная растворимость образующихся труднорастворимых осадков;

4. различное распределение компонентов между двумя несмешивающимися жидкими фазами и т.д.

Тонкослойная хроматография наиболее успешно применяется для разделения очень малых количеств материала между двумя несмешивающимися жидкими фазами.

А так как коэффициенты распределения веществ между двумя фазами различны, то разделяемые вещества под действием подвижной фазы продвинутся на разное расстояние.

В практической работе наибольшее значение имеет величина R_f данного соединения - коэффициента скорости движения, представляющего собой отношение расстояния, пройденного данным веществом, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя:

Величины R_f для всех веществ могут быть легко определены, так как пути, пройденные данным веществом и фронтом растворителя, доступны непосредственному измерению на хроматограмме.

Ход работы:

Стандартные растворы аминокислот готовят в концентрации 10 мг аминокислоты в 1 мл смеси. Некоторые аминокислоты (тирозин, аспарагиновая кислота) в воде растворяются плохо, поэтому при их растворении добавляют по несколько капель HCI. На листы или полосы (шириной 15-20 см) хроматографической бумаги или пластинки силуфола шириной 5-7см. микропипеткой (микрошприцом) наносят такое количество раствора аминокислот, чтобы содержание любой из них в местах нанесения было 15-20 мкг, а для триптофана, гистидина, тирозина, лизина и пролина – не менее 20-30 мкг. Разделение проводят в стеклянной камере. На ее дно наливают растворитель слоем 1,5 см, затем закрывают стеклянной крышкой или притертым стеклом и оставляют на 1 ч для насыщения камеры парами растворителя (уравновешивание). После достижения равновесия снимают крышку и помещают в камеру хроматографическую пластинку с нанесенной на нее смесью разделяемых веществ. Пластинку устанавливают вертикально так, чтобы место нанесения проб было несколько выше уровня растворителя и камеру снова накрывают. Растворитель поднимается вверх по закрепленному на пластинке слою адсорбента, растворяя вещества, нанесенные с пробой, движется далее вверх и, таким образом, происходит разделение. Температура в камере в ходе всего процесса должна быть постоянной.

При хроматографировании аминокислот в качестве растворителя часто используют смесь н-бутилового спирта, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:1. При приготовлении растворителя указанные реактивы в необходимых соотношениях тщательно перемешивают и, если растворитель получается недостаточно прозрачным, к нему добавляют еще несколько капель уксусной кислоты. Хроматограммы выдерживают в камере с растворителем в течение такого срока, чтобы фронт растворителя продвинулся почти до верхнего (нижнего) края листа бумаги или пластинки.

После такой соответствующей экспозиции бумагу осторожно (в перчатках) вынимают из камеры, отмечают карандашом расстояние, пройденное фронтом растворителя, и высушивают в вытяжном или специальном сушильном шкафу или с помощью фена.

После удаления растворителя пластину опрыскивают из пульверизатора 0,2% раствором нингидрина в ацетоне или бутиловом спирте, кладут в термостат на 5-10 мин при температуре 80-90⁰С.

При этом между аминокислотами и нингидрином происходит следующая реакция:

А минокислоты окисляются и распадаются на альдегиды, углекислоту и аммиак. Выделившийся аммиак конденсируется со второй молекулой нингидрина и с продуктом его восстановления – дикетооксигидринденом

Аммиачная соль энольной формы образовавшегося соединения окрашена в интенсивный сине-фиолетовый цвет.

Интенсивность окраски пропорциональна содержанию аминокислот. Для вычисления значения R_f окрашенные пятна аминокислот обводят простым карандашом, определяют центры пятен и расстояние от места нанесения аминокислот, выраженное в миллиметрах, делят на расстояние, пройденное от этой же точки фронтом растворителя. Результат измерений заносят в таблицу:

№ п/п

Наименование аминокислот

Измеренное значение Rf аминокислоты

Задание5. Определение количества аминного азота методом формольного титрования

Оборудование и реактивы:рН-метр, колбы на 100 мл; пипетки на 20 и 5 мл; химические стаканы на 100 мл; формольная смесь (50 мл формалина х.ч. смешивают с 1мл 1% -ного раствора гидроксида натрия до появления слабо – розового окрашивания (смесь пригодна в течение 2-3 дней), 0,1 н раствор гидроксида натрия

Целью данной работы является определение аминного а зота, входящего в свободные аминогруппы (-NH₂) аминокислот и других продуктов гидролиза белков. Его определяют при изучении активности протеолитических ферментов, состава форм азотистых соединений в сырье, полупродуктах и готовой продукции, при изучении реакции образования меланоидинов.

Метод формольного титрования: в молекуле аминокислоты имеются свободная аминогруппа, обладающая основными свойства, и свободная карбоксильная группа, обладающая кислыми свойствами. В водном растворе основные свойства аминогруппы почти нейтрализуются кислыми свойствами карбоксильной группы, в результате чего реакция раствора близка к нейтральной. Было предложено связывать аминогруппу формальдегидом:

│ │

Вследствие связывания аминная группа теряет свои основные свойства, а карбоксильная группа, наоборот, в полной мере проявляет свои кислотные свойства и может быть оттитрована щелочью:

│ │

Принимают, что количество карбоксильных групп равно количеству аминных групп, связанных формальдегидом. Однако такое предложение верно только для моноаминомонокарбоновых кислот. Полная нейтрализация карбоксильных групп происходит лишь при pH 9-9,5, что соответствует ярко – красному окрашиванию фенолфталеина.

Метод формольного титрования дает хорошие результаты только для прозрачных бесцветных или слабоокрашенных растворов.

Ход работы:

1. Взвесить 5г навески, перенести в мерную колбу на 100мл и перемешивать в течение 15мин.

2. Раствор профильтровать, отобрать на анализ 20мл. фильтрата.

3. К 20мл полученного фильтрата добавить 2-3 капли фенолфталеина и оттитровать 0,1Н раствором щелочи до розового окрашивания.

4. К полученному раствору приливают 3мл формольной смеси – раствор обесцвечивается.

5. Продолжают титрование раствора до ярко-красного окрашивания.

6. Для контрольного титрования отмеряют 20мл дистиллированной воды.

Содержание аминного азота рассчитывают по уравнению:

где а - объем 0,1Н раствора щелочи, пошедшего на титрование экспериментального образца, мл;

в - объем 0,1Н раствора щелочи, пошедшего на титрование контроля, мл;

н- навеска, содержащаяся в 20мл раствора, мг:

0,0014 –мг аминного азота, соответствующее 1 мл 0,1Н р-ра щелочи.

Задание 6. Выделение проламинов из зерна злаков

Оборудование и реактивы: эндосперм кукурузного зерна; эндосперм пшеничного зерна, сито; петролейный эфир; колбы на 100 мл; центрифужные пробирки; этиловый спирт 80%; 0,1 н р-р NaCl (5,85 г NaCl в 1 л воды); вакуум-эксикатор с KOH; 8 М р-р мочевины; дистиллированная вода; центрифуга.

Проламины- спирторастворимые запасные белки, встречающиеся только в зерне злаковых растений. Они хорошо растворимы в 70-90% этиловом спирте, 0,1 н уксусной кислоте, 8 М растворе мочевины и нерастворимы в воде и солевых растворах.

Проламины каждой культуры имеют свое название: глиадины- проламины ржи и пшеницы, зеины- кукурузы, авенины- овса, гордеины- ячменя, кафирины- сорго и т.д.

Ход работы:

Зеин содержится только в эндосперме кукурузного зерна и отсутствует в зародыше. Примерное содержание его в эндосперме составляет 3-6%, поэтому для получения 100 мг зеина необходимо взять 30-40 зерен.

Зерно необходимо освободить от зародышей, размолоть и просеять через сито с диаметром отверстий 0,2-0,25 мм. Полученную муку обезжиривают в колбе на 100 мл петролейным эфиром в течение часа при периодическом перемешивании. После этого обезжиренную муку отделяют центрифугированием и подсушивают на воздухе, так как петролейный эфир легко воспламеняется.

Зеин выделяют трехкратной экстракцией 80% этиловым спиртом. Для этого навески обезжиренной муки - 500-600 мг переносят в центрифужные пробирки. Первую и вторую экстракции проводят при t = 20⁰С в течение часа пятью объемами спирта, третью- при t = 60⁰C в течение часа тремя объемами. В каждом случае экстракт отделяют центрифугированием при 3-5 тыс. об/мин в течение 15 мин.

Все три центрифугата объединяют, охлаждают до t = 4⁰С. Все дальнейшие операции проводят при температуре от 0 до 4⁰С. Из раствора зеин осаждают высаливанием тремя объемами 0,1 Н NaCl.. Осадок формируется в течение часа, после чего суспензию центрифугируют при 3-5 тыс. об/мин в течение 15 мин. Осадок зеина промывают 3-4 раза дистиллированной водой до полного удаления ионов хлора и сушат в вакуум-эксикаторе над KOH.

Полученный препарат зеина представляет собой рыхлый порошок, хорошо растворимый в 80% спирте и 8 М растворе мочевины. Его используют в дальнейших работах для определения величины ИЭТ и содержания триптофана.