49. Системы качества, порядок их разработки, сертификации, внедрения и проведения аудита. Методика разработки и внедрения системы качества с учетом рекомендаций стандартов исо 9000.

Разработка и внедрение СМК – довольно кропотливый и длительный процесс, а также требует вовлечение ведущих специалистов компании. Мероприятия по разработке и внедрению СМК можно разделить на несколько основных этапов: 

1. Оценка и диагностика процессов, действующих в организации, включает в себя следующие аспекты:

-анализ и оптимизация организационной структуры

-выделение ключевых процессов, от которых зависит качество конечного продукта или услуги, выполняемой компанией, анализ документации на эти процессы;

-анализ порядка регистрации и записи данных о качестве выполняемых процессов, их полноты и результативности;

-оценка и анализ мероприятий по идентификации процессов и продукции, оценка заинтересованности персонала и его вовлеченности в вопросы управления качеством.

На основании проведенной диагностики выбирается модель СМК . 

2. Разработка документации системы менеджмента качества в соответствиями с требованиями стандарта ГОСТ Р ИСО 9000 После проведения Оценки и диагностики процессов, действующих в организации следует документирование системы менеджмента качества, т.е разработка основных документов в соответствии с требованиями стандарта ГОСТ Р ИСО 9000

-Политика в области качества;

-Руководство по качеству;

-Процедуры (стандарты организации).  

3. Подготовка организаций к сертификационному аудиту (СМК на соответствие требованиям стандарта ГОСТ Р ИСО 9001-2008).  Эти мероприятия включают в себя следующие основные моменты:

-Обучение внутренних аудиторов систем менеджмента качества и создание службы управления качеством:

-Проведение предварительного аудита системы менеджмента качества.

-Подготовка к проведению и сопровождение сертификационного аудита системы менеджмента качества. 

После того, как документация СМК разработана, внедрена и её требования выполняются (что можно проследить документально в ходе предварительного аудита), компанией заключается договор с органом по сертификации на проведение оценки соответствия СМК требованиям стандарта ГОСТ Р ИСО 9000.  В орган по сертификации направляется заявка и комплект документации СМК, где в течение небольшого промежутка времени изучается представленная документация, после чего экспертная группа проводит сертификационный аудит деятельности компании  По результатам сертификационного аудита оформляется отчет о проверке СМК, на основании которого экспертная комиссия принимает решение о выдаче сертификата соответствия требованиям стандарта ГОСТ Р ИСО 9000 или об отказе в выдачи (при неудовлетворительных результатах проверки).  Сертификат выдается сроком на 3 года с последующим продлением. В течение срока действия сертификата соответствия орган по сертификации ежегодно проводит инспекционный контроль с целью подтверждения соответствия данной Системы требованиям стандарта ГОСТ Р ИСО 9000.

50. Способы масштабирования, оптимизации биотехнологических процессов и координирования микробного метаболизма.

Масштабирование биотехнологических процессов.

Важное место в биотехнологических производствах занимает масштабирование ферментаций, т. е. культивирование микроорганизмов в промышленных условиях.

Культивирование микроорганизмов в промышленных условиях — сложный процесс, зависящий от: числа генераций микроорганизма; способов культивирования; стерилизации среды и воздуха; перемешивания и аэрации; переноса тепла; стабилизации культуры.

Maсштабирование «снизу вверх» и «сверху вниз». Обычно осуществляют масштабирование «снизу вверх». Результат, полученный в лабораторных условиях, переносят на аппарат большего размера, стараясь воспроизвести в этом аппарате все те критерии, которые выбраны для масштабирования. В мировой литературе такое масштабирование обозначают термином «Scale-up». Это не всегда приводит к успешным результатам, поскольку обычно в промышленном аппарате невозможно создать условия гидродинамики и массопередачи, идентичные условиям в аппаратах малого масштаба. При этом рекорды производительности, полученные в колбах, оказываются нереалистичными и служат только для победных отчетов научных работников перед производством. Более реально использовать масштабирование «сверху вниз» Притом ориентируются на те промышленные аппараты, которые есть в производстве. Эти аппараты изучают с учетом массообменных характеристик и других критериев масштабирования и уже лабораторные условия подгоняют под критерии, имеющиеся в производственных аппаратах. Соответственно и в колбах процесс изучают сразу при определенном объеме среды. И хотя на такой установке обычно результаты хуже по технико-экономическим показателям, чем можно было бы получить, стремясь выжать максимум из лабораторного оборудования, все же так работать выгоднее, поскольку менее вероятно возникновение трудностей при переходе на промышленное оборудование, Полученные результаты без большого труда переносятся на промышленные аппараты. Конечные показатели технологического процесса в производстве при этом не хуже, а часто и лучше чем при масштабировании типа «Scale-up».

Оптимизация биотехнологических процессов осуществляется на основе сочетания экспериментального и математического моделирования и применения современных методов оптимизации (динамического и нелинейного программирования, вариационного исчисления). Однако в настоящее время для оценки оптимальности биотехнологических процессов трудно даже подобрать критерии. При оптимизации в биотехнологии необходимо учитывать ограничения, связанные с экономическими и конструктивными условиями, возможностями контрольно-измерительной аппаратуры и средств управления, экологическими требованиями и др. Моделирование и оптимизация биотехнологических процессов – задача сложная и во многом еще не решенная. Однако именно разработка адекватных моделей различных биотехнологических процессов и на их основе создание совершенных методов оптимизации и управления – важнейшее направление биотехнологии, без которого невозможен прогресс.

Современный биотехнологический процесс немыслим без применения ЭВМ для управления процессом ферментации, а именно для:

· Поддержания оптимального значения рН среды;

· Поддержания оптимальной температуры среды;

· Автоматического пеногашения;

· Регулирования частоты вращения мешалки;

· Контроля качества растворимого О2;

· Контроля за удалением СО2 из ферментера;

· Поддержания заданной скорости подачи субстрата и др.

ЭВМ используют для учета масштабного эффекта при оценке ферментационных параметров и поддержания их в оптимальном режиме, а также для проведения анализа при установлении влияния отдельных параметров на метаболическое поведение культур микроорганизмов. Процесс оптимизации требует варьируемого параметра, который надо оптимизировать удобными параметрами для вариаций служат (на выбор):

- общая продукция при ферментации в периодических условиях;

- образование продукта/ферментер·час;

- концентрация продукта в выходящем потоке (ферментация в непрерывном режиме);

- стоимость тонны продукта, выходящего из ферментера;

- стоимость тонны экстрагируемого продукта.

Компьютерный контроль очень важен для дозируемого добавления сырья и общего потребления энергии. Это особенно важно для ферментаций, в которых субстрат и сырье составляют главную стоимость.

Преимущество компьютерного контроля – это также быстрое и эффективное управление параметрами процесса, хранение и воспроизведение нужных данных, большая гибкость работы завода в соответствии со спросом на продукцию, наиболее надежный контроль загрязненности и безопасности на производстве.

Моделирование является одним из наиболее значимых направлений при разработке биотехнологических процессов, так как с помощью моделирования, экспериментального и математического, исследуются и разрабатываются новые процессы, совершенствуются аппараты и технологические схемы производств. При экспериментальном моделировании в лабораторных и промышленных условиях применяются, как правило, модели объектов и процессов, отличающиеся масштабами. Экспериментальное моделирование позволяет исследовать и оптимизировать процессы, сущность которых мало изучена. Данный подход часто служит единственным средством для исследования биотехнологического процесса. Первым этапом экспериментального моделирования служит лабораторный уровень, в ходе которого при сравнительно небольших затратах проводится изучение новых продуцентов и разработка новых процессов. Далее полученные результаты переносят в опытные, полупромышленные и промышленные масштабы. На опытных установках отрабатываются все технологические детали будущего процесса, обучается персонал, создается оборудование, уточняются технико-экономические показатели. Затем проводятся крупномасштабные дорогостоящие промышленные эксперименты и испытания.

Экспериментальное моделирование имеет ряд особенностей: трудоемкость, сложность реализации новой модели процесса. Наиболее трудны при этом вопросы масштабирования технологии и оборудования. Развитие биологических агентов связано не только с поведением жидкости и реагентов в ферментере, но и с их собственным метаболизмом. Поэтому масштабирование в биологии требует специальных решений, при этом до настоящего времени нет единого подхода к решению данной задачи.

Для оптимизации и управления биотехнологическими процессами, помимо экспериментального, необходимо также привлечение математического моделирования. Эти два подхода, дополняя друг друга, позволяют более эффективно решать поставленные задачи. Экспериментальное моделирование часто предшествует математическому, являясь для него источником информации. Математические модели – удобное средство обобщения экспериментальных данных. Наличие математических моделей позволяет более обоснованно подходить к планированию экспериментов и обрабатывать данные, существенно сокращать объем экспериментальных работ. Для моделирования и расчета биотехнологических процессов в силу их сложности применяют системный подход. Математическая модель сложной биосистемы должна включать описание различных по своей природе объектов и явлений. Поэтому, анализируя биологическую системы в целом, применяют метод декомпозиции, расчленяя исходную систему на ряд подсистем: строятся модели массообмена, кинетики роста биообъекта и биохимических процессов. К настоящему времени разработано много моделей массообмена, кинетики потребления субстрата и образования различных продуктов. Наиболее сложная задача – моделирование собственно биологических объектов, так как они значительно сложнее химических, физических и технических. Объекты биотехнологии способны к саморегулированию, их сложность усугубляется неоднородностью. Процессы, протекающие в биореакторе, зависят не только от сложных внутриклеточных факторов, но и от условий внешней среды; в свою очередь, внешние процессы в биологии связаны с внутренними, поэтому их разделить нельзя. Кроме этого, на данном этапе уровня развития математической биологии отсутствует теория, адекватная сущности биологических процессов. Пока не создан математический аппарат, способный описать природу биологических превращений во всем многообразии, то есть необходимо развитие и совершенствование самого математического аппарата. Математическое описание биологических объектов дополнительно осложняется их недостаточной изученностью. Поэтому на данном этапе возможно достаточно упрощенное и приближенное математическое описание биологических объектов, это направление нуждается в существенном совершенствовании.

Координация микробного метаболизма

В живых клетках протекает огромное число реакций, необходимых для роста, размножения и поддержания их жизнедеятельности. Большинство этих реакций носит ферментативный характер и протекает в присутствии специфических ферментов. Для нормального функционирования клетки необходима согласованность протека­ния всех реакций во времени и в пространстве. В каждый момент должны образо­вываться и действовать ферменты, которые катализируют реакции, нужные в данный момент развития клетки.

Практически все гены у бактерий функциональные, а у эукариот 2/3 не функциональные. Белок у бактерий синтезируется сразу весь и включается в метаболизм, а у эукариот образуются экзоны и интроны.

Координация микробного метаболизма осуществляется с помощью следующих механизмов регуляции:

1. Индукция синтеза ферментов;

2. Репрессия синтеза ферментов;

3. Ингибирование активности ферментов;

4. Активизация ферментов.

Первые два механизма обеспечивают регуляцию путем изменения концентра­ции того или иного фермента в клетке, вторые два — путем изменения активности уже имеющихся ферментов. Остановимся на каждом механизме подробнее.

Индукция синтеза ферментов

Все ферменты микробных клеток можно разделить на две группы:

1. Конструк­тивные

2. Индуцибельные.

К первой относятся ферменты, которые всегда имеются в клетке, независимо от фазы её развития и условий окружающей среды. Это фермен­ты, катализирующие наиболее важные метаболические реакции, например, катабо­лизм глюкозы.

Вторая группа включает ферменты, которые синтезируются лишь в определенных условиях, при наличии в среде вещества — индуктора. Чаще всего ин-дуктором синтеза фермента является его специфичный субстрат, но иногда может быть и другое вещество. Механизм индукции не позволяет транжирить энергию и питательные ве­щества на синтез ненужных, в данных условиях, ферментов.

Например, если клетки бактерий растут на среде с глюкозой, они почти не синтезируют амилолитические ферменты, однако при переносе на среду, где единственным источником углерода и энергии является крахмал, происходит индукция синтеза амилаз, необходимых для усвоения крахмала.

Наиболее подробно изучен механизм индукции синтеза ферментов (катабо­лизм лактозы) у Е.сoli.

Три гена, кодирующие аминокислотную последователь­ность трех ферментов катаболизма лактозы (В-галактозидазы, лактопермеазы и трансацетилазы), расположены в хромосоме последоватеьно и образуют совместно с промоторной и операторной областью lac-оперон.

В начале оперона, перед структурными генами, расположены регуляторный уча­сток молекулы ДНК, состоящий из промотора и оператора.

Промотр - это участок, к которому присоединяется РНК- полимераза (начало синтеза м-РНК).

Оператор – это участок, с которым связывается специальный белок - репрессор.

Синтез репрессора, в свою очередь, кодируется геном - регулятором. Белок - репрессор содержит два активных центра - один обеспечивает присоединение белка к оператору, а другой обладает сродством с молекулами индуктора.

В отсутствие индуктора белок - репрессор прочно связывается с оператором. Это препятствует продвижению РНК-полимеразы по нуклеотидной цепочке ДНК и блокирует транскрипцию структурных генов и синтез соответствующих ферментов. При наличии индуктора (для lac - оперона - это не сама лактоза, а аллолактоза) он (индуктор) специфично присоединяется к репрессору и изменяет его конформацию, что приводит к снижению сродства репрессора к оператору и освобождению оператора. Снимается блокировка продвижения РНК-полимеразы, начинаются транскрипция структур­ных генов и синтез ферментов.

Описанный выше механизм индукции, при котором один индуктор вызывает синтез нескольких ферментов одного метаболического пути, называют координиро­ванной индукцией. Наряду с ней в клетках микроорганизмов действуют системы по­следовательной индукции. При этом длина цепочки индуцируется своим собственным субстратом (субстратом для первого фермента в цепочке).

Репрессия синтеза ферментов - это процесс, осуществляющийся по принципу об­ратной связи. Это означает, что конечный продукт цепи биохимических реакций по­давляет синтез действия фермента, катализирующего первую реакцию цепи. Подоб­ный механизм обеспечивает равновесие между скоростями синтеза низкомолеку­лярных соединений и их расходования на построение биополимеров и исключает непродуктивные затраты веществ и энергии на образование излишних количеств промежуточных продуктов.

Репрессия - подавление синтеза ферментов осуществляется следующим обра­зом. Регуляторный ген R кодирует синтез белка-репрессора (анорепрессора), кото­рый в свободном состоянии неактивен, но может быть активирован корепрессором, который и является конечным продуктом цепи биохимических превращений.

Активированный белок-репрессор связывается с геном-оператором О, что препятствует считыванию информации со структурного гена R и, следовательно, синтезу соответствующего фермента. В отсутствие корепрессора синтез фермента происходит беспрепятственно.

Если мы добавим в питательную среду какой-либо индуктор целевого вещества,то происходит сверхсинтез этого вещества, в количествах, многократно превышающих потребности самой клетки. Это явление широко используется на практике при производстве биологически ак­тивных веществ (аминокислот, витаминов, ферментов)

Ферменты, у которых легко регулируется активность, относятся к регуляторным. Они, как правило, построены из нескольких субъединиц, чаще всего из четы­рех. Кроме каталитических центров, распознающих и связывающих субстраты, у регуляторных ферментов есть и другие стереоспецифические центры. Это места свя­зывания эффекторов, изменяющих сродство фермента к субстрату. У ферментов имеются особые участки - для связывания отрицательных эффекторов (ингибиторов). Происходит ингибирование или снижение активности ферментов. При связывании положительных эффекторов (активаторов) поисходит активация активности ферментов.

Регуляторные ферменты, как правило, имеются в каждом пути биосинтеза и в некоторых путях катаболизма. В большинстве случаев они находятся в начале цепи биосинтеза и занимают, таким образом, ключевую позицию.

Аллостерические эффекторы представляют собой низкомолекулярные соеди­нения - это либо конечные продукты биосинтеза, либо вещества, концентрация ко­торых может отражать состояние клеточного метаболизм, например АТФ, АДФ, АМФ, ацетил.