Геномика

ГЕНОМИКА: ИЗУЧЕНИЕ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОМНОЙ ИНФОРМАЦИИ

Геном — это все молекулы ДНК, необходимые для выживания и передачи генетической информации следующему поколению. Данный термин можно применить к отдельной клетке, отдельному представителю вида или виду в целом. Геномика — наука, изучающая все структурные и функциональные аспекты генома. Высокопроизводительные методы секвенирования позволили получить последовательности геномов принадлежащих к разным этническим группам людей, множества животных, растений и микроорганизмов, представляющих интерес для медицины и сельского хозяйства.

Геномика изучает все молекулы, вовлеченные в транскрипцию и трансляцию, а также в их регуляцию (транскриптом); примерно 90 000 белков, синтезируемые в клетке или организме (протеом); функции всех генов (функциональная геномика); сбор, хранение и переработку данных (биоинформатика) и др.

A. Примеры организмов, чьи геномы были секвенированы

На схеме представлены организмы, геномы которых были определены за последние 25 лет. Последовательность ДНК генома человека сравнили с последовательностями вымерших гоминид, неандертальцев и других видов, а также с последовательностями приматов, большинства млекопитающих и сумчатых. (1) А. Дюрер, 1507. Адам и Ева. Национальный музей Прадо, Мадрид. (2) J. Weissenbach, 2004. (3) Weissenbach J. Genome sequencing: differences with the relatives. Nature 2004; 429: 353–355. (4) Джексоновская лаборатория. (5) Роберт Гейслер, Институт биологии развития Общества Макса Планка, Тюбинген, Германия; доступно по ссылке http://zf-health. org/. (6) Марко ван Керкховен. (7) М. Эшбернер, Кембриджский университет, Великобритания. (8) Д-р Джордан Бойл. (9) Wikimedia Commons. (10) Escherichia coli, Wikipedia. (11) The Arabidopsis Information Resource (TAIR).

Первые результаты секвенирования

Человек: International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 2004; 431: 931–945.

Lander ES. Initial impact of the sequencing of the human genome. Nature 2011; 470: 187–197.

Nature: Human Genome Collection. Доступно по ссылке: http://www.nature.com/nature/su pplements/collections/humangenome/.

UCSC Genome Bioinformatics. Доступно по ссылке: http://genome.ucsc.edu/. По состоянию на 2 февраля 2017 г.

Skipper M. User’s guide to the human genome. Nature Rev Genet 2012; 13: 678.

Неандерталец: Green RE, et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science 2010; 328: 710–722.

Шимпанзе: Chimpanzee Sequencing and Analysis Consortium. Initial sequence of the chimpanzee genome and comparison with the human genome. Nature 2005; 437: 69–87.

Собака: Lindblad-Toh K, et al. Genome sequence, comparative analysis and haplotype structure of the domestic dog. Nature 2005; 438: 803–819.

Мышь: Waterston RH, et al. Mouse Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 2002; 420: 520–562.

Крыса: Gibbs RA, et al. Rat Genome Sequencing Project Consortium. Genome sequence of the Brown Norway rat yields insights into mammalian evolution. Nature 2004; 428: 493–521.

Brachydanio rerio: Институт Сенгера. Доступно по ссылке: http://www.sanger.ac.uk/resources/ zebrafish/. По состоянию на 27 января 2012 г.

Anopheles gambiae, переносчик малярийного паразита Plasmodium falciparum: Holt RA, Subramanian GM, Halpern A, et al. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science 2002; 298: 129–149.

Drosophila melanogaster: Adams MD, et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science 2000; 287: 2185–2195.

C. elegans: C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science 1998; 282: 2012–2018.

Дрожжи: Goffeau A, et al. Life with 6000 genes. Science 1996; 274: 546, 563–567.

Escherichia coli: Blattner FR, et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 1997; 277: 1453–1462.

Растения: Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 2000; 408: 796–815.

Морской еж: Sea Urchin Genome Squencing Consortium. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science 2006; 314: 941–952.

ГЕНОМЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

Бактериальные геномы сравнительно небольшие, длиной от 130 тпн до 14 млн пн, с плотно упакованными внутри кольцевой хромосомы генами. У большинства бактерий присутствует около 1000–6000 генов. Кодирующие области короткие (около 1 тпн) и не содержат интронов. К настоящему моменту получены последовательности десятков тысяч геномов бактерий и архей 50 и 11 различных типов соответственно. К февралю 2015 г. удалось определить последовательности примерно 14 000 геномов бактерий и архей.

Из-за небольшого размера бактериальные геномы удалось полностью секвенировать первыми. Например, геном Haemophilus influenzae был секвенирован в 1995 г. Самый маленький бактериальный геном — это геном

Mycoplasma genitalium (483 гена), облигатного внутриклеточного паразита. В нем отсутствуют гены, кодирующие белки метаболических функций. Неполноценность метаболизма у M. genitalium компенсирует транспорт жизнеобеспечивающих молекул из хозяйской клетки.

A. Геном бактериофага

Бактериофаг ΦX174 с 10 генами (A–J), содержащимися в одноцепочечной ДНК из 5386 ну-

клеотидов, был первым организмом, чей геном удалось секвенировать. (Sanger et al., 1977). Геном фага ΦX174 настолько компактный, что участки некоторых генов перекрываются.

Б. Перекрывающиеся гены фага ФX174

Рамки считывания генов А и В, В и С, D и E частично перекрываются. Перекрывающиеся гены транскрибируются в разных рамках считывания: в старт-кодоне ATG гена E (см. рис.) последние два нуклеотида (AT) представляют собой часть кодона TAT, кодирующего тирозин (Tyr) в гене D. При этом стоп-кодон TGA гена E является частью кодонов GTG (валин) и ATG (метионин) гена D. Такое перекрывание позволяет эффективно использовать геном небольшого размера.

В. Геном Escherichia coli

На схеме отражены основные особенности бактериального генома. Функционально родственные гены обычно образуют опероны (на схеме представлены только четыре из множества возможных). Примерно половина генов сгруппирована в оперонах. Как правило, размер бактериального генома соответствует количеству генов. Бактерии, живущие в симбиозе с другими организмами, имеют геномы наименьших размеров.

АРХИТЕКТУРА ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА

Человеческий геном содержит 2,85 млрд нуклеотидов (около 3 109 пн для гаплоидного генома). Если каждый нуклеотид напечатать как букву шириной 1 мм, то получится цепочка букв длиной около 3200 км! Примерно 22 000 кодирующих белки генов составляют 1,5% генома. Около 6% последовательности ДНК человека представлено консервативными некодирующими элементами. Основные особенности генома человека — низкая средняя плотность генов, дупликация сегментов хромосом, диспергированные повторяющиеся последовательности, явление транспозиции. Повторы, возникшие из транспозонов в процессе эволюции (в основном благодаря РНКпосредникам), составляют около 40% генома.

A. Типы последовательностей

Можно выделить следующие типы последовательностей: фрагменты генов или регуляторных элементов и повторяющиеся последовательности, лежащие за пределами генов (межгенные последовательности), состоящие из различных типов диспергированных повторяющихся фрагментов.

Б. Диспергированные повторы

В геноме присутствуют четыре типа повторяющихся последовательностей. Длинные диспергированные повторы (LINE, 1) представляют собой ретротранспозоны млекопитающих, у которых, в отличие от ретровирусов, отсутствуют длинные концевые повторы. Фрагменты LINE состоят из повторяющихся последовательностей длиной до 6500 пн. Длинные диспергированные повторы кодируют две открытые рамки считывания (ORF1 и ORF2), которые используются при трансляции. Помимо промотора 5' (Р), такие фрагменты содержат внутренний промотор. В человеческом геноме присутствует около 600 000 элементов L1. LINE-2 и LINE-3 находятся в неактивном состоянии, поскольку отсутствует обратная транскрипция. Фрагменты LINE-1 составляют 21% генома.

Короткие диспергированные повторы (SINE, 2) — это повторяющиеся сегменты длиной 100–400 пн с тандемными дупликациями CGбогатых сегментов, разделенных А-богатыми сегментами. Они не кодируют белки и не способны образовывать автономные вставки.

Наиболее распространенный тип фрагментов SINE в геноме приматов — это последовательности семейства Alu (Alu-последовательности),

присутствующие у человека в числе 1,2 млн копий (около 6% генома). Один Alu-повтор присутствует на каждых 3 тпн генома человека.

Ретротранспозоны с длинными концевыми повторами (LTR) (3) фланкированы длинными концевыми повторами, содержащими регулирующие транксрипцию элементы. Автономные ретротранспозоны содержат гены gag и pol, кодирующие необходимые для ретротранспозиции белки.

ДНК-транспозоны (4) составляют различные классы напоминающих бактериальные транспозонов с инвертированными повторами и кодирующих транспозазу.

В. Сегментарные дупликации

Геном человека содержит более 1000 блоков удвоенных сегментов, которые составляют 5% генома. Они сосредоточены преимущественно в субтеломерных и перицентрических областях или рассредоточены вдоль каждой хромосомы (сегментарные дупликации). Такие сегменты существуют в виде блоков геномных последовательностей длиной 1–200 тпн, присутствующих в другом сайте той же хромосомы (внутрихромосомные) или другой хромосомы (межхромосомные). На рисунке представлены примеры сегментарных дупликаций Х-хромосомы: хромосома 20 и хромосома 4. Блоки, присутствующие в других хромосомах, соединены линиями. Если в определенной области имел место неравный кроссинговер, может образоваться цепь ДНК с дупликацией или утраченным сегментом, что приведет к возникновению генетического заболевания (см. с. 252).

Медицинская значимость

Перемещение сегментов LINE и SINE может стать причиной спорадических форм заболеваний (например, гемофилии A, см. с. 284).

РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ В АРХИТЕКТУРЕ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА

Плотно упакованная ДНК хроматина должна быть доступна для транскрипции, чтобы стала возможной экспрессия генов в клетках различных типов на разных стадиях развития. Все уровни иерархической структуры генома предполагают участие большого количества тесно связанных между собой функциональных регуляторных элементов. Они расположены в отдельных топологически ассоциированных доменах (ТАД). Регуляцию в них обеспечивают цис-регуляторные элементы, такие как энхансеры, сайленсеры и инсуляторы, часто расположенные в пределах регуляторных областей локуса. Образуя петли, регуляторные элементы могут контактировать с промоторами геновмишеней. Эухроматин соответствует активным областям, в то время как гетерохроматин относится к неактивным областям. В рамках проекта ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) ученые проводят систематическое картирование областей транскрипции, взаимодействие факторов транскрипции, структуры хроматина и модификаций гистонов. Полученные результаты позволили определить функции примерно 80% генома.

A. Иерархическая организация генома

ДНК (1), упакованная в нуклеосомы (2), образует первичную структуру. Она делится на ТАД (3) в пределах хромосомы (4). Это вторичная структура. Третичную структуру представляет складчатость целой хромосомы (5). Третичная структура напоминает складчатую структуру белка.

Б. Топологически ассоциированные домены

ТАД состоят из выскококонсервативных последовательностей, средний размер которых составляет 1 млн пн (1). В ядерных ТАД энхансер и промотор взаимодействуют на расстоянии 100 тпт (ДНК), образуя петлю (2). Границы между ТАД определенной области генома, содержащей изолированные сайты связывания (3), определяют инсуляторные элементы. Они препятствуют формированию петель поблизости от сайтов связывания (4). Доменные границы (TDB) ассоциированы с формирующим петлю репрессором транскрипции CTCF — высококонсервативным белком с 11 цинковыми пальцами, кодируемым геном CTCF (OMIM 604167). Он участвует в регуляции целого ряда

функций, в том числе активации и подавлении транскрипции, инсуляции, импринтинге

иинактивации Х-хромосомы.

В.Функциональные состояния топологически ассоциированных доменов

Различают факультативную и конститутивную модели ТАД. Согласно факультативной модели (1), неактивные (синий) и активные (красный) домены образуют отдельные ТАД. Некоторые гены остаются в неактивном состоянии и активируются в процессе развития за счет сдвига границы. Согласно конститутивной модели (2), сдвиг границы не приводит к изменениям активности генов. Экспрессия генов запускается благодаря изменениям взаимодействия элементов внутри ТАД. (Рис. из: Sexton & Cavalli, 2015.)

Медицинская значимость

Структурные перестройки энхансера, сайленсера или инсуляторного элемента могут привести к тканеспецифичной утрате функции или аберрантной экспрессии гена (см. Заболевания, связанные с перестройкой цис- регуляторных элементов, с. 256).

АНАЛИЗ ГЕНОМА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-МИКРОЧИПОВ

(МИКРОМАТРИЧНЫЙ АНАЛИЗ)

Существуют различные типы микрочипов для анализа генома в диагностических целях. Микрочип, или ДНК-чип, — это набор олигонуклеотидных или других ДНК-зондов, зафиксированных на специальном субстрате. Такие микрочипы высокой плотности можно применять для анализа образцов сложных смесей ДНК и РНК. Микрочип позволяет оценить уровень экспрессии большого числа генов. Один из методов предполагает использование комплементарных ДНК (кДНК), полученных из информационной РНК (мРНК; анализ экспрессии), или обнаружение вариантов последовательностей генов (скрининг ДНКвариантов). Методы анализа на микрочипах имеют множество преимуществ: возможность одновременного анализа тысяч генов, возможность автоматизации, небольшой размер образца, простота применения. Некоторые производители предлагают высокоэффективные микрочипы, в которых на поверхности площадью 1,7 см2 (1,28 1,28 см) находится более 6 млн различных олигонуклеотидных популяций.

Существует два основных типа ДНК-микро- чипов: а) микрочипы с предварительно подготовленными клонами ДНК или продуктами ПЦР, которые иммобилизованы на поверхности и образуют двумерную сетку из матриц высокой плотности; б) микрочипы с олигонуклеотидами, синтезированными in situ на подходящей подложке.

A. Профиль экспрессии генов, полученный с использованием кДНК-микрочипов

На рисунке представлен микрочип с 1500 различными кДНК, соответствующими Х-хромо- соме человека. кДНК были выделены из лимфобластных клеток нормального мужчины (XY) и нормальной женщины (XX). кДНК из женских клеток были помечены флуорофором Cy3 (красный), а кДНК из мужских клеток — флуорофором Cy5 (зеленый).

Инактивация большинства генов одной из двух Х-хромосом в женских клетках дает соотношение 1 : 1 для кДНК экспрессируемых генов мужской и женской Х-хромосом. В результате большая часть сайтов микрочипа дает желтый сигнал, когда красный (женские клетки) и зеле-

ный (мужские клетки) флуоресцентные сигналы присутствуют в равных количествах. Семь сайтов (на рисунке обведены желтым) испускают красный сигнал. Гены, избежавшие инактивации на неактивной женской Х-хромосоме (см. с. 200), экспрессируются с удвоенной силой. (Фотографии: G. M. Wieczorek, U. Nuber, H. H. Ropers, Институт молекулярной генетики Общества Макса Планка, Берлин, с разрешения.)

Б. Экспрессия генов в человеческих опухолевых клетках

Микрочипы можно применять для анализа экспрессии генов в опухолевых клетках в рамках диагностики и мониторинга эффективности терапии. На рисунке представлены паттерны экспрессии генов в 60 клеточных линиях, полученных из различных опухолевых клеток человека. Используя метод анализа на микрочипах, исследовали около 8000 генов (Ross et al., 2000). Была выявлена устойчивая связь между паттернами экспрессии генов и соответствующими тканями. Дендрограмма отражает связь между паттернами экспрессии генов и тканями, из которых были получены клеточные линии. Для анализа использовали 1161 кДНК из 64 клеточных линий (1). На рисунке представлено цветное изображение микрочипа, полученного с использованием Cy3-меченой кДНК (красный), обратно транскрибированной с выделенной из клеточных линий мРНК, и Cy5-меченой кДНК (зеленый), полученной из эталонной мРНК (2). Несколько скоплений красных точек в столбцах (1161 ген) и рядах (60 клеточных линий) указывают на повышенную экспрессию генов. Таким образом, эти области микрочипа соответствуют генам, паттерн экспрессии которых в опухолевых клетках изменился. (Рис. из: Ross et al., 2000, с разрешения автора.)

СКАНИРОВАНИЕ ГЕНОМА И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ГЕНОМНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ

Полногеномное сканирование и сравнительная геномная гибридизация (CGH, см. следующую страницу) направлены на анализ всего генома, а не отдельных групп генов. Сейчас полногеномные исследования широко применяют для поиска ассоциаций (см. с. 134). Один из методов полногеномного сканирования основан на использовании ОНП-микрочипов. Он позволяет обнаружить полиморфные последовательности ДНК (ОНП, см. с. 88) во множественных локусах всех хромосом в процессе поиска ассоциаций с областями, которые могут быть связаны с генами или фрагментами хромосом, ответственными за развитие заболевания или предрасположенность к нему. В геноме человека удалось идентифицировать более 12 млн ОНП (представлены в базе данных ОНП), которые можно использовать в исследовательских и диагностических целях. Метод микроматричной сравнительной геномной гибридизации (aCGH) представляет собой сочетание использования микрочипов и геномной гибридизации. Принцип метода представлен на рисунке в виде схемы.

A. Принцип полногеномного скрининга

При полногеномном скрининге анализируют все хромосомы (на схеме изображены только четыре), выполняя поиск локуса заболевания с использованием полиморфных маркеров на каждой хромосоме (многоточечный анализ сцепления). Пик логарифмической кривой количественного показателя сцепления генов, достигающий почти 4 для хромосомы 2, указывает на то, что может присутствовать сцепление между локусом заболевания и двумя маркерными локусами (показаны красным и синим). Количественный показатель сцепления 3 или выше свидетельствует о том, что отношение вероятностей для сцепления/отсутствия сцепления составляет 1000 : 1 или более.

Кроме того, полногеномный скрининг может быть направлен на выявление связи между областью, содержащей локусы восприимчивости к мультифакторным заболеваниям, и полиморфными вариантами. О наличии связи можно судить по неравновесному сцеплению. Неравновесное сцепление — результат преимущественной сегрегации определенных

аллелей, содержащих ответственный за предрасположенность фрагмент (см. с. 134). Существует большое количество различных компьютеризированных методов анализа сцепления.

Б. Микроматричная сравнительная геномная гибридизация

Микроматричная сравнительная геномная гибридизация (aCGH) — это метод, который представляет собой сочетание использования микрочипов и сравнительной геномной гибридизации (см. следующую страницу). Метод aCGH предполагает применение множества картированных клонов на микрочипе вместо метафазных хромосом, что существенно повышает точность обнаружения небольших делеций и дупликаций. Исследуемый геном сравнивают с эталонной нормальной последовательностью. Для последовательностей используют разные метки. В рассмотренном здесь примере ДНК пациента помечена флуорофором Cy5 (зеленый). ДНК контроля помечена флуорофором Cy3 (красный).

Если количество ДНК в тестовом и контрольном образцах одинаково, появится желтый сигнал. При дисбалансе если количество ДНК уменьшено из-за делеции, сигнал будет красным. Зеленый сигнал свидетельствует о наличии дупликации.

С помощью aCGH можно быстро и эффективно обнаружить делеции и дупликации в масштабах всего генома. (Рис.: E. E. Eichler, Университет Вашингтона, Сиэттл, с разрешения).

Медицинская значимость

Микроматричную сравнительную геномную гибридизацию широко используют в диагностических целях.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ГЕНОМНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ

Сравнительная геномная гибридизация (CGH) — это метод обнаружения небольших делеций и дупликаций (микроделеций/микродупликаций) в масштабах всего генома. Он позволяет выявить вариации числа копий генов (см. с. 252) в ДНК всех хромосом одновременно путем сравнения ДНК пациента с контролем. Метод основан на применении флуоресцентной гибридизации in situ и окрашивании хромосом с помощью гибридизующихся с целыми хромосомами зондов. Сравнительную геномную гибридизацию широко используют для исследования опухолевых клеток в метафазе и интерфазе. Разновидности метода — микроматричная сравнительная геномная гибридизация (aCGH) и метод мультиплексного генетического анализа MLPA (Sellner and Taylor, 2004).

A. Применение метода сравнительной геномной гибридизации

Метод CGH позволяет выявить изменения в геноме опухолевых клеток с помощью сравнения выделенной из ткани опухоли ДНК с геномной ДНК здорового человека в качестве контроля. На верхнем рисунке представлены метафазные хромосомы пациента с наследственной формой почечно-клеточной карциномы (синдром фон Гиппеля–Линдау, OMIM 193300). На рисунке слева метафазные хромосомы окрашены в зеленый цвет флуоресцинизотиоцианатом, который в данном случае является меткой опухолевой ДНК (1). На рисунке в середине те же метафазные хромосомы окрашены в красный цвет родамином, являющимся меткой нормальной ДНК (2). На рисунке справа (3) представлено полученное путем наложения изображение, на котором видны как зеленые, так и красные фрагменты. Желтое свечение говорит о нормальном соотношении зеленого и красного сигналов (1 : 1). Это значит, что потери или приобретения хромосомного материала не произошло. Красное свечение свидетельствует о хромосомных потерях в опухолевых клетках, а зеленое — о появлении дополнительных фрагментов хромосом. Паттерн гибридизации представлен для всех хромосом в виде профиля сравнительной геномной гибридизации (4). Отдельные хромосомы окрашены синим красителем, который взаимодействует с АТ-богатыми последовательностями (DAPI, 4', 6-диамидин-

2-фенилиндол), и визуализированы методом флуоресцентной микроскопии. Метафазные хромосомы последовательно анализируют с помощью камеры с ПЗС-матрицей для красного, зеленого и синего (контрокрашивание DAPI), используя различные фильтры. Синее свечение DAPI конвертируют в черно-белое изображение. Усиление контраста позволяет идентифицировать хромосомы благодаря появлению исчерченности, такой же, как при G-окрашивании. Профиль CGH основан на сканировании каждой хромосомы на наличие красных сигналов (первая вертикальная линия в левой части каждого поля), свидетельствующих о потере хромосомного материала, или на наличие зеленых сигналов (третья вертикальная линия), которые свидетельствуют о появлении дополнительного хромосомного материала. Выход за расположенную слева линию наблюдается в области длинного плеча хромосомы 4. Это значит, что в области 4q имеет место утрата хромосомного материала. Сдвиг в сторону зеленой линии в области длинного плеча хромосомы 10 свидетельствует о появлении дополнительного хромосомного материала в области 10q. Центромеры показаны на рисунке как горизонтально расположенные прямоугольники серого цвета. (Рис.: N. McNeil, T. Ried, Национальный институт здоровья, с разрешения.)

Б. Идентификация дополнительного хромосомного материала методом многоцветной флуоресцентной гибридизации in situ

Здесь дополнительный хромосомный материал, невидимый при обычном кариотипировании, визуализировали методом многоцветной флуоресцентной гибридизации in situ (M-FISH, см. с. 170). Мультиплексная кариограмма FISH (справа) содержит небольшую дополнительную полосу на конце длинного плеча хромосомы 21 (обозначена стрелкой). Данный фрагмент произошел от хромосомы 12. (Рис.: S. Uhrig, M. Speicher, Грац, Австрия, с разрешения.)

МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ

Мобильные генетические элементы — это последовательности ДНК, способные перемещаться внутри генома за счет транспозиции (см. с. 98). Понятие «динамичность генома» говорит о том, что геномы всех живых организмов нестатичны. Напротив, им свойственны гибкость и подверженность изменениям. Явление транспозиции впервые обнаружила Б. Макклинток в процессе изучения генетики кукурузы Zea mays. Она заметила, что некоторые гены могли спонтанно изменять свое положение в геноме. Б. Макклинток назвала такие гены «прыгающими». Позднее они были названы мобильными генетическими элементами. Хотя наблюдения Макклинток сначала восприняли скептически, в 1984 г. за эту работу она была удостоена Нобелевской премии (FoxKeller, 1983; McClintock, 1984). Подвижные генетические элементы или их фрагменты составляют почти половину генома млекопитающих и до 90% генома некоторых растений. Транспозиция обеспечивает механизмы создания новых последовательностей и перестройки генома в процессе эволюции.

A.Стабильные инестабильные мутации

В 1953 г. Б. Макклинток установила, что некоторые мутации кукурузы нестабильны. Стабильная мутация в локусе С обеспечивает фиолетовую окраску зерен кукурузы (1), в то время как при нестабильной мутации на отдельных зернах присутствуют только пятна фиолетового пигмента (мозаицизм, 2).

Б. Эффект мутации и транспозиции

В норме ген в локусе С отвечает за выработку фиолетового пигмента в клетках алейронового слоя у кукурузы (1). Он может быть инактивирован за счет встраивания в ген мобильного элемента (Ds), приводящего к появлению бесцветного зерна (2). В случае исчезновения Ds из-за транспозиции функция локуса С восстанавливается, и на зерне появляются небольшие пигментированные участки (3).

В. Встраивание и удаление элемента Ds

Система активации-диссоциации (Ac/Ds) — это система регуляторных элементов генома кукурузы. Ac — нестабильный элемент. Он может активировать другой локус, локус диссо-

циации (Ds), и вызывать разрыв хромосомы (1). Ac способен перемещаться автономно (автономная транспозиция), а перемещение Ds

вдругую область хромосомы возможно только при участии Ac (неавтономная транспозиция). Локус Ac представляет собой транспозон размером 4,6 тпн. Ds не может функционировать

вотсутствие гена транспозазы (см. с. 98). Инактивация локуса C (2) происходит из-за встраивания элемента Ds. Ds может быть удален благодаря воздействию элемента Ac. Это приводит к восстановлению функции локуса С.

Г. Транспозоны у бактерий

В зависимости от их эффекта и молекулярной структуры транспозоны делят на простые инсерционные последовательности (IS) и транспозоны более сложной структуры (Tn). Иногда в состав транспозона входят дополнительные гены, например ответственные за устойчивость бактерий к антибиотикам.

Транспозиция — это особый тип рекомбинации, при котором сегмент ДНК длиной от 750 пн до 10 тпн может перемещаться с одного сайта на другой как в пределах одной молекулы ДНК, так и между молекулами. Для встраивания фрагмента (1) необходимы разрыв (2) и последующая интеграция (3). Последовательности по обеим сторонам от встроившегося сегмента внутри сайта интеграции представляют собой прямые повторы. На обоих концах инсерционной последовательности транспозона присутствуют инвертированные повторы, длина и последовательность нуклеотидных снований различны для разных инсерционных последовательностей и транспозонов. (Фотографии на рис. А и Б из: Fedoroff, 1984.)

Медицинская значимость

Встраивание транспозона в функциональный ген может стать причиной генетического заболевания.

CRISPR-CAS — СИСТЕМА РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА

Под редактированием генома понимают совокупность молекулярных методов, позволяющих производить точные направленные изменения в геноме. Система CRISPR-Cas (короткие палиндромные кластерные повторы и эндонуклеаза Cas9) была выделена из бактерий, у которых она выполняет функцию защиты от заражения чужеродными ДНК. Вирусные последовательности ДНК встраиваются в последовательность локуса CRISPR бактериального генома. При повторном инфицировании адаптивная иммунная система, основу которой составляет CRISPR, идентифицирует чужеродные последовательности ДНК и индуцирует сайт-специфичный двухцепочечный разрыв за счет действия ассоциированной с CRISPR эндонуклеазы Cas9.

A. Функции системы CRISPR-Cas у бактерий

Локус CRISPR состоит из нескольких сотен повторов, перемежающихся чужеродными последовательностями, которые были получены при предыдущих контактах с вирусом (спейсеры). Адаптивный иммунитет возникает в два этапа: встраивание короткой вирусной ДНК в специфичную область локуса CRISPR (1)

ипри повторном инфицировании обнаружение

ирасщепление чужеродной ДНК (2). Для этого необходима транскрипция в предшественник CRISPR-РНК, расщепление которого приводит к появлению зрелых CRISPR-РНК.

CRISPR-РНК образует дуплекс с транс-

активирующей РНК, который связывается с Cas9 и обеспечивает расщепление ДНКмишени в области последовательностей PAM (protospacer adjacent motifs, 5'-NGG-3').

Б. Применение системы CRISPR-Cas для редактирования генома

Чтобы провести редактирование генома, получают комплекс из CRISPR-РНК и трансактивирующей РНК, который гибридизуется с одной из цепей чужеродной ДНК-мишени. Два нуклеазных домена белка Cas9 индуцируют сайт-специфичные разрывы каждой цепи ДНК-мишени. Поскольку появление разрывов цепей ДНК индуцирует механизмы репарации в клетках хозяина, данный процесс можно использовать для разрушения генов (нокаут) или замены последовательностей ДНК (нокин).

Применение в медицине

Система CRISPR-Cas может в будущем быть использована в генной терапии для коррекции мутаций и борьбы с инфекционными агентами, такими как вирус гепатита В, ВИЧ и др. (Рис. А из: Alberts et al., 2015; рис. Б из: Charpentier & Doudna, 2013.)

ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ И ГЕНОМОВ

Ныне существующие гены и геномы представляют собой результат совокупности имевших место в прошлом эволюционных событий. Классическая теория эволюции, сформулированная Ч. Дарвином в 1859 г., гласит, что: а) все ныне живущие живые организмы произошли от живших ранее; б) организмы, жившие ранее, отличаются от ныне живущих; в) изменения были постепенными и непрерывными; г) изменения, как правило, приводят к дивергенции, при этом число современных типов организмов превышает число предковых типов.

A. Эволюция в результате дупликации генов

Исследование множества геномов показало, что могли иметь место различные типы дупликаций — дупликации отдельных генов или их фрагментов (экзонов), субгеномные дупликации и очень редко дупликации всего генома (Ohno, 1970). Удвоение гена снимает давление отбора на этот ген. После дупликации ген может накапливать мутации без ущерба для исходной функции в организме при условии, что при дупликации появляется отдельная регуляторная система. Дупликация может также приводить к появлению тупиковых форм генетических элементов. В таких случаях мутации инактивируют ген, превращая его в псевдоген. Каждая хромосома человека содержит примерно равное количество функциональных генов и псевдогенов.

Б. Эволюция в результате перетасовки экзонов

Экзонно-интронная структура генов эукариот обеспечивает большую эволюционную гибкость. Новые гены могут появляться благодаря перемещению существующих генов в новый контекст с образованием несущей новую функцию комбинации. Это явление называют перетасовкой экзонов или доменов.

В. Эволюция хромосом

Эволюция происходит и на хромосомном уровне в результате структурных перестроек генома. Родственные виды, например виды млекопитающих, различаются числом и морфологией хромосом, но не числом генов, которое обычно сохраняется на одном уровне. Человеческая хромосома 2 могла образоваться в результате слияния двух хромосом приматов. Хромосома 3 отличается от приматной незначительно. Отличие хромосомы 3 орангу-

тана от человеческой хромосомы или хромосомы других приматов состоит в том, что в ней присутствует перицентрическая инверсия. Исчерченность хромосом всех приматов очень схожа. Это свидетельствует о тесной эволюционной связи между ними. (Рис. из: Yunis & Prakash, 1982.)

Г. Молекулярная филогенетика и построение филогенетического древа

Филогенетическое древо можно построить, используя различные типы данных — данные палеонтологических исследований, различия между белками, иммунологические данные, гибридизацию ДНК-ДНК и сходство последовательностей ДНК. Важно определить, какое число эволюционных событий было необходимо, чтобы обеспечить существующее в наше время разнообразие. От предкового гена (1) на схеме прочерчены линии к двум событиям. Различают две категории гомологов: паралоги и ортологи (2). Паралоги — это гомологичные гены, которые эволюционировали в пределах вида посредством дупликации. Ортологи — это гомологичные гены филогенетически родственных организмов, разошедшихся в процессе видообразования. Примерами паралогов могут служить человеческие локусы α-глобина и δ-глобина. Гены α-глобина и β-глобина человека и других млекопитающих представляют собой ортологи. Понятие «паралогичный» применяют при сравнении азотистых последовательностей.