Добавил:

Nemo_Nemorino Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Днепропетровский национальный университет им. Олеся Гончара

Предмет:

Генетика

Файл:

Наглядная генетика (2020).pdf

Скачиваний:

257

Добавлен:

30.05.2021

Размер:

85.92 Mб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 34 / 94 5 6 7 8 9 > Следующая >>>

Основы

42 Основы

	ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ДРЕВО	В. Филогения млекопитающих
	ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ	Млекопитающие появились около 100–120
	ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ	Млекопитающие появились около 100–120
		млн лет назад в конце мезозойской эры.
		Датировки, впрочем, приблизительны. Из 4629
	Филогенетическое древо — это попытка по-	известных видов млекопитающих 4356 явля-
	казать предполагаемые эволюционные вза-	ются плацентарными, их делят на 12 классов.
	имосвязи живых организмов. Впервые такое	Первые пять классов плацентарных млекопи-
	древо было представлено Ламарком в 1809 г.	тающих по количеству видов — грызуны (2015),
	Это один рисунок в работе «Происхождение	рукокрылые (925), насекомоядные (385),
	видов», где в 1859 г. Чарльз Дарвин написал:	хищные (271) и приматы (233). Появление ин-
	«Вероятно, все органические существа, ко-	формации о последовательности ДНК стало
	торые когда-либо жили на этой Земле, про-	причиной определенных изменений филоге-
	изошли от какой-то изначальной формы».	нетического древа. (Рис. из: Klein & Takahara,
	Считается, что Земле чуть больше 4,5 млрд	2001.)
	лет, а ранние формы жизни появились около
	3,5 млрд лет назад.
	A. Три основные ветви древа жизни
	Общепризнанная иерархия живых организмов
	использует принцип от высшего к низшему:
	домен → царство → тип → класс → порядок/
	отряд (у растений/животных) → семейство →
	род → вид. Живые организмы объединены
	в группы в соответствии с тем, из каких клеток
	они состоят — прокариотических или эукарио-
	тических. Третья группа живых организмов, ар-
	хеи, называемые также архебактериями, была
	обнаружена в 1960-х гг. Они относятся к двум
	типам: эвриархеоты и кренархеоты. Последние
	данные показывают, что трехдоменное эволю-
	ционное древо на самом деле состоит из двух
	доменов — археи и бактерии. Эукариоты воз-
	никли благодаря их взаимодействию около
	1,8 млрд лет назад (Williams et al., 2013). Археи
	могут выживать без молекулярного кислорода
	при высоких (70–110 °C, термофилы) или низ-
	ких (психрофилы) температурах, в воде с вы-
	сокой концентрацией хлорида натрия (гало-
	филы) или серы (сульфотермофилы), в сильно
	щелочной среде (pH 11,5, алкалофилы), в кис-
	лой среде (ацидофилы), а также в условиях со-
	четания неблагоприятных факторов, в которых
	обычные бактерии могут погибнуть. Эукариоты
	подразделяются на несколько царств: живот-
	ные, грибы, растения, водоросли, простейшие
	и др. У всех доменов есть предполагаемый об-
	щий предшественник, называемый последним
	универсальным общим предком.
	Б. Филогения многоклеточных
	животных
	Филогения многоклеточных различается в зави-
	симости от того, основана она на традиционных
	принципах или на молекулярных данных, полу-
	ченных преимущественно в результате сравне-
	ния последовательностей рибосомной РНК.

Филогенетическое древо живых организмов

44 Основы

ПРОИСХОЖДЕНИЕ ЧЕЛОВЕКА

Линии человека и шимпанзе отделились от общего предка около 6–7 млн лет назад. Имеющие отношение к эволюции человека вымершие виды в целом называт гоминидами, хотя термин «гоминины» также используют. Общая схема эволюции человека, созданная в последние 10–15 лет, основана на данных новейших палеонтологических исследований, а также генетических, полученных в результате анализа последовательностей древней ДНК. Основные места обнаружения гоминид в Африке расположены вдоль Рифт-Вэлли в Восточной Африке, в районе Афарской котловины и Хадара (северо-восточная Эфиопия), по обе стороны от озера Туркана в Кении, в ущелье Олдувай и Летоли (Танзания), в двух пунктах в Центральной Африке (Бахр- эль-Газаль и Торос-Меналла, оба в республике Чад), а также в нескольких пунктах в Южной Африке (Стеркофонтейн, Кромдрай, Сварткранц и Таунг).

А. Хронология эволюции гоминид

Выделяют четыре этапа эволюции гоминид: древнейшие гоминиды (преавстралопитеки); переходные формы, к которым относят массивных (робустных) гоминид (грацильные австралопитеки и парантропы); древние люди

илюди современной анатомии. В каждой группе есть несколько представителей, связи между которыми обозначены стрелками. Однако во многих случаях подробная информация отсутствует. Для древнейших форм в большинстве случаев доступными для изучения были только фрагменты скелета и зубы.

Древнейшие гоминиды: старейшим представителем этой группы является Sahelanthropus tchadensis (6–7 млн лет назад), обнаруженный в Центральной Африке, в 2500 км к западу от рифтовой долины. Размеры мозга такие же, как у шимпанзе (360–370 см3), однако лицо относительно плоское, а толщина зубной эмали средняя между человеком и шимпанзе. Два рода, жившие около 5–6 млн лет назад, — это Orrorin tugenensis («первый человек из Туген Хиллс», район Баринго в центральной Кении)

иArdipithecus ramidus kadabba (из Аваша, Афар, Эфиопия).

Переходные формы гоминид: в эту группу входит подсемейство Australopithecinae семейства гоминид, которое, возможно, дало начало древнейшим видам гоминин. Для представителей характерно прямохождение с сопутствующими изменениями рук и ног,

уменьшение размера зубов и прогрессивное развитие мозга. Так, впервые обнаруженный Дартом в 1924 г. в Южной Африке детский череп из Таунга принадлежит Australopithecus africanus, который явно обладал способностями к прямохождению. Наиболее известным представителем группы является A. afarensis (3–4 млн лет назад), для которого были характерны прямохождение и другие свойственные гоминидам черты. «Люси» — самый яркий представитель вида. Массивные гоминиды с крупными челюстями и зубами вымерли, их не считают предшественниками рода Homo. Древний человек: основной представитель древних людей — это Homo erectus. Он появился в Африке около 1,9 млн лет назад

иявляется первым из древнейших гоминид, обнаруженных за пределами Африки, в Азии

ина Кавказе (1,6–1 млн лет назад в Грузии). Homo habilis (2,4–1 млн лет назад), человек умелый, генетически не был идентичен H. еrectus, однако существовал в том же хронологическом промежутке. Эволюцию рода Homo можно проследить по характеру использования каменных орудий труда. Наиболее ранние образцы H. erectus из Африки иногда относят к H. ergaster (2,3–1,4 млн лет назад).

Homo heidelbergensis (0,6–0,1 млн лет назад) — это вымерший вид рода Homo, который может быть предком как H. neanderthalensis, так и H. sapiens в Европе. Homo antecessor

(0,8 млн лет назад) — вымерший вид человека, который был обнаружен 10 лет назад в Гран Долине в Испании. Homo floresiensis — вымерший 0,6 млн лет назад вид маленького роста (высота взрослого 1 м), обнаруженный на острове Flores в Индонезии (о денисовцах читайте на следующей странице).

Человек современной анатомии: все ныне живущие люди принадлежат к одному виду —

Homo sapiens. Homo sapiens отделился от H. erectus в Африке около 200–100 тыс. лет назад. Люди современной анатомии покинули Африку около 50 тыс. лет назад и в разное время мигрировали на все континенты. (По данным: Wood, 2005 и Stringer, 2005.)

Происхождение человека

46	Основы
ИЗ АФРИКИ: К ЧЕЛОВЕКУ		(~13 тыс. лет назад). Расселение из Африки
СОВРЕМЕННОГО ТИПА		совпадает	с	ростом локальных		популяций

		и возникновением дефицита ресурсов. По-
		видимому, наибольшее влияние на человече-
Люди современного типа появились в Африке		ские популяции, переселившиеся в Европу,
около 200 тыс. лет назад. Впоследствии не-		оказывал климат. Стремительно развивалось
сколько групп мигрировало из Африки в Азию.		производство инструментов, но изготавли-
Недавно была установлена связь ДНК всех		вали и предметы			материальной	культуры,
ныне существующих неафриканских популя-		не имевшие практической ценности. Возраст
ций человека с одним переселением. Люди со-		древнейших инструментов для производства
временного типа, прибывшие в Европу около		одежды, таких как костяные иглы, составляет
50 тыс. лет назад, встретились с более ранней		около 40 тыс. лет. Заниматься сельским хозяй-
популяцией, которая жила там на протяжении		ством и использовать одомашненных живот-
примерно 400 тыс. лет, с неандертальцами.		ных начали около 12 тыс. лет назад (Рис. из:
В большинстве случаев они жили в разных ме-		Jones, 2007.)
стах и создали разные, хотя и частично повто-		В. Инструменты и искусство
ряющие друг друга формы ранней культуры,
которые известны как Мустьерская культура		людей современного типа
для неандертальцев и Ашельская культура для		в древнейшие времена
людей современного типа, получившие свои		У людей современного типа в эпоху верх-
названия от районов Франции. В Азии люди		него палеолита (17–33 тыс. лет назад) было
современного типа встретились еще с одной		развито производство инструментов и ис-
группой древних гоминин — денисовцами, это		кусство.	На	тот	период выявлено четы-
произошло около 100–60 тыс. лет назад.		ре этапа развития: Мадленская культура,
A. Происхождение человека		Солютрейская культура, Граветтская культура
		и Ориньякская/Шательперонская				культура.
и неандертальцы		В качестве примера представлены костяная
Около 800 тыс. лет назад у людей и неандер-		игла, возраст которой составляет 26 тыс. лет
тальцев был общий предок. Разделение по-		(1), и флейты, изготовленные из кости лебе-
пуляций произошло между 270 тыс. и 440 тыс.		дя, возрастом 38 тыс. лет (2). (Фотографии из:
лет назад. Неандертальцы и люди современ-		Conard et al, 2009.)
ного типа жили вместе на территориях, про-		Медицинская значимость
стиравшихся от Северо-Восточной Европы
до Сибири. Хотя неандертальцы вымерли		Такая область, как эволюционная медицина,
около 28 тыс. лет назад, примерно 4% ге-		направлена на решение научных и практиче-
нома ядерной ДНК европейцы и азиаты по-		ских вопросов, связанных с эволюционными
лучили от неандертальцев, а африканские		причинами многих болезней современного че-
популяции нет. Третья группа, получившая		ловека. Примерами таких болезней являются
название «денисовцы», была впервые обна-		ожирение, атеросклероз, гипертония, ишеми-
ружена в Денисовой пещере, расположенной		ческая болезнь сердца, аутоиммунные заболе-
в Алтайских горах в Сибири. Неандертальцы		вания и пр. (Gluckman и др., 2009.)

иденисовцы более близки друг к другу, чем к современному человеку (Prüfer и др., 2014). Примерно 0,5% генома денисовского человека получено от неандертальцев. (Рис. из: Nonnan

идр., 2006.)

Б. Расселение людей современного типа за пределами Африки

Установлено, что расселение из Африки, имевшее место около 60 тыс. лет назад, происходило в северном и южном направлениях. Сначала была заселена Азия (50–70 тыс. лет назад), затем Австралия и немного позднее Европа (40 тыс. лет назад). Американские континенты были заселены в последнюю очередь

Из Африки: к человеку современного типа

48 Основы

КЛЕТКА И ЕЕ КОМПОНЕНТЫ

Клетки — это мельчайшие структурные единицы живых организмов, окруженные мембраной. В течение жизни они могут выполнять множество функций. Согласно положению, выдвинутому Рудольфом Вирховом в 1855 г., каждая клетка происходит от другой живой клетки (omnis cellula е cellula). Существует два основных типа клеток: 1) прокариотические клетки, у которых вся функциональная информация содержится в кольцевом геноме без ядерной оболочки: бактерии (или эубактерии) и археи (или архебактерии); 2) эукариотические клетки, геном которых находится в отдельных хромосомах внутри ядра. У них хорошо организованная внутренняя структура. Роберт Гук предложил термин «клетка» в 1665 г. для крошечных ячеек в пробке, которые напомнили ему кельи монахов. Матиас Шлейден и Теодор Шванн в 1839 г. признали, что клетки являются «элементарными частицами организмов», растений и животных. Сейчас мы уже знаем, как происходит большая часть биологических процессов в клетке на молекулярном уровне.

A. Строение прокариотической клетки

Клетки прокариот (бактерий) обычно бывают палочковидными и сферическими, их диаметр составляет несколько микрометров, у них отсутствует ядро или особая внутренняя структура. Внутри бактерии, окруженной клеточной стенкой, находится около 1000–5000 генов, плотно записанных в кольцевой молекуле ДНК. Кроме того, бактерии обычно содержат небольшие кольцевые молекулы ДНК, называемые плазмидами. Репликация плазмид происходит независимо от главной хромосомы; обычно они содержат гены, ответственные за устойчивость к антибиотикам.

Б. Строение эукариотической клетки

Эукариотическая клетка состоит из цитоплазмы и ядра, окруженных плазматической мембраной. Ядро эукариотической клетки содержит генетическую информацию. В ядрышках, немембранных компартментах, происходит синтез рибосом. Ядерная оболочка отделяет ядро от цитоплазмы, в которой находится сложная система внутренних мембран, образующая дискретные структуры (органеллы). Это митохондрии (в них происходят необходимые для энергообразования химические реакции), эндоплазматический ретикулум (мембранная сеть, в которой идет синтез важных молекул), аппарат Гольджи (обеспечивает

транспорт), лизосомы (в них происходит переваривание некоторых белков) и пероксисомы (синтез и разложение определенных молекул). У животных клеток (1) и растительных клеток (2) есть ряд общих черт и важные структурные различия.

Растительная клетка содержит хлоропласты для фотосинтеза, окружена твердой стенкой из целлюлозы и других полимерных молекул, а также содержит вакуоли для воды, ионов, сахара, азотистых соединений или продуктов жизнедеятельности. Вакуоли проницаемы для воды, но не для других находящихся в них веществ.

В. Плазматическая мембрана клетки

Клетки окружены плазматической мембраной, состоящей из молекул жирных кислот, гидрофобных фосфолипидов, образующих двойной слой (бислой). Множество молекул проникает сквозь плазматическую мембрану, обеспечивая определенные функции взаимодействия клеток. Можно выделить различные типы мембранных белков: 1) трансмембранные белки, обеспечивающие транспорт молекул внутрь клетки и вовне; 2) белки, соединенные друг с другом и обеспечивающие стабильность; 3) рецепторные молекулы, вовлеченные в процесс передачи сигнала; 4) обладающие функциями ферментов молекулы, катализирующие химические реакции внутри клетки в ответ на сигнал извне; 5) межклеточные щелевые контакты у специализированных клеток, образующие поры между соседними клетками. Белки межклеточных щелевых контактов состоят из коннексинов.

Они обеспечивают проникновение молекул диаметром до 1,2 нм. Клетки содержат четыре основные группы органических молекул: углеводы, жирные кислоты, аминокислоты и нуклеотиды.

Клетка и ее компоненты

50 Основы

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПРОЦЕССОВ СТАРЕНИЯ

Старение является результатом зависящих от времени процессов, которые затрагивают клеточный, генетический и метаболический гомеостаз, а также оказывают воздействие на способность стволовых клеток регенерировать. Организмы стареют в рамках специфичной для каждого вида продолжительности жизни, из чего можно сделать вывод, что в процесс старения вовлечены не только повреждения, но и генетически запрограммированные факторы. Мутации некоторых генов могут увеличивать продолжительность жизни у нематод, дрозофил и мышей. У человека с некоторыми генетическими нарушениями связаны преждевременное старение и уменьшение продолжительности жизни.

A. Фенотипические проявления старения

Густав Климт (1862–1918) продемонстрировал фенотипы людей разного возраста (1). На клеточном уровне продолжительность жизни культивированных фибробластов человека ограничена 40–60 делениями клетки в зависимости от возраста донора. Это явление получило название «предел Хейфлика». Сначала (фаза I) клетки растут, пока не достигнут достаточных размеров (фаза II). Затем они вступают в фазу III и больше не делятся (2). Это состояние покоя, в котором не происходит деление, называется клеточным старением. Раковые клетки в культуре, наоборот, продолжают делиться. На уровне организма старение влияет практически на все функции тела, способность к обучению и репродуктивную успешность. Оно также повышает риск распространенных заболеваний, таких как атеросклероз и рак. Семь направлений исследований старения соответствуют различным механизмам, которые предположительно вовлечены в процесс старения (3). (Рис. 1 из: Национальный музей современного искусства, Рим; рис. 2 из: Hayflick and Moorhead, 1961; рис. 3 из: Kennedy et al., 2014.)

Б. Возрастные изменения клетки

Старение связано с повреждением ДНК и укорочением теломер. Кроме того, имеет место нарушение других клеточных структур и процессов, в том числе архитектуры ядра, функций и стабильности митохондрий, эпигенетической регуляции, функционирования белков

и взаимодействия клеток. (Рис. из: Lоpez-Otín et al, 2013.)

В. Генетические нарушения, вызывающие преждевременное старение

Прогерия взрослых, или синдром Вернера (OMIM 277700), впервые описанная в 1904 г., представляет собой заболевание с ауто- сомно-рецессивным типом наследования, при котором множественные проявления преждевременного старения возникают в течение второго и третьего десятилетий жизни. Синдром Вернера вызывают гомозиготные мутации гена ДНК-хеликазы WRN (OMIM 604611), кодирующего RECQL2. Другие связанные с хеликазами заболевания — это синдром Блума (OMIM 210900), причиной которого являются мутации гена RECQL3 (ген BLM 604610), и синдром Ротмунда—Томсона (OMIM 277700), причиной которого являются мутации гена RECQL4 (603780). Хеликазы разделяют цепи молекулы ДНК, что необходимо для репликации, рекомбинации, репарации и транскрипции (см. с. 68). Потеря функции хеликазы приводит к нестабильности генома. (Фотографии из: Werner Syndrome International Registry, http://www.wernersyndrome.org/.)

Генетические основы процессов старения

52	Молекулярные основы генетики

УГЛЕВОДЫ

Углеводы — это карбонильные соединения (альдегиды, кетоны), которые в больших количествах присутствуют в живых организмах как часть биомолекул. Углеводы представляют собой один из наиболее важных классов биомолекул. Их основные функции можно разделить на три группы: 1) доставка и создание запаса энергии; 2) обеспечение каркаса для несущих информацию молекул, ДНК и РНК (см. с. 62); 3) формирование структурных элементов клеточной стенки у бактерий и растений (полисахариды). Кроме того, углеводы образуют структуры на поверхности клетки (рецепторы), которые служат для передачи сигнала от клетки к клетке. Вместе с многочисленными белками и липидами углеводы являются важными компонентами многих структур внутри клетки.

A. Моносахариды

Моносахариды (простые углеводы) представляют собой альдегиды (–C=O, –H) либо кетоны (C=O) с двумя или более гидроксильными группами (общая структурная формула CH2O). Альдегидная или кетонная группа может вступить в реакцию с одной из гидроксильных групп, чтобы образовать кольцо. Это обычная конфигурация для углеводов, содержащих пять или шесть атомов углерода (пентозы и гексозы). Атомы углерода нумеруют последовательно. Формы углеводов D (dextro) и L (levo) являются оптическими изомерами одной и той же молекулы.

В природе преобладают D-формы. Их, в свою очередь, подразделяют на α- и β-формы как стереоизомеры. У циклических углеводов атомы углерода расположены не на одной плоскости, а в трехмерном пространстве и принимают форму «стула» или «лодки». Расположение гидроксигрупп может быть разным, так образуются стереоизомеры вроде маннозы или галактозы.

Б.Дисахариды

Это соединения из двух моносахаридов, соединенных друг с другом. Обычно связь образуется между гидроксильной группой одного углевода и гидроксильной группой другого. Часто встречающиеся дисахариды — сахароза и лактоза.

В. Производные сахаров

Глюкуроновая кислота, глюкозамин и N-аце- тилглюкозамин — производные сахаров, образовавшиеся в результате замещения отдель-

ных гидроксигрупп другими группами. Они играют роль в развитии нескольких генетических заболеваний обмена веществ.

Г.Полисахариды

Короткие (олигосахариды) и длинные (полисахариды) цепи сахаров и производных сахаров образуют необходимые структурные элементы клетки. Сложные олигосахариды, образующие связи с белками и липидами, являются частью структур на поверхности клетки, например антигенов группы крови. Другие полисахариды входят в состав внеклеточного матрикса.

Медицинская значимость

Примеры наследственных заболеваний человека, связанных с нарушением углеводного обмена:

Сахарный диабет (OMIM 125850): гетерогенная группа заболеваний, для которых характерно повышение уровня глюкозы в крови, имеющая сложные клинико-генетические особенности (см. с. 292).

Нарушения обмена фруктозы: наследственная непереносимость фруктозы (OMIM 229600) и наследственная недостаточность фруктозо- 1,6-бисфосфатазы с гипогликемией и часто с летальным исходом у новорожденных (OMIM 229700).

Метаболизм галактозы: галактоземия (OMIM 230400), недостаточность галактокиназы (OMIM 230200), недостаточность галактоэпимеразы (OMIM 230350) и др.

Гликогенозы: существует восемь типов нарушений метаболизма гликогена, различающихся клиническими симптомами, а также набором вовлеченных генов и ферментов (OMIM 232200, 232210–232800). В большой группе генетически детерминированных нарушений сложные полисахариды не могут расщепляться из-за сниженной или отсутствующей функции фермента, в результате чего развивается болезнь накопления (мукополисахаридозы, муколипидозы) (см. с. 308).

Углеводы

54	Молекулярные основы генетики

ЛИПИДЫ (ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ)

Жирные кислоты — это необходимые компоненты плазматических мембран и предшественники таких биомолекул, как стероидные гормоны и другие молекулы, задействованные в процессах передачи сигналов. Липиды служат важным источником энергии, поступающей с пищей (в зависимости от дозы). Они образуют важные соединения, связываясь с углеводами (гликолипиды) и фосфатными группами (фосфолипиды). Липиды можно классифицировать, основываясь на их способности гидролизоваться (омыляемые и неомыляемые).

A.Жирные кислоты

Жирная кислота состоит из неразветвленной углеводородной цепи, содержащей 4–24 атома углерода, и концевой группы карбоновой кислоты (1). Это полярная молекула с гидрофильным (–COOH) и гидрофобным (–CH3) концами. Существуют насыщенные жирные кислоты без двойных связей и ненасыщенные жирные кислоты с одной или несколькими двойными связями (2). Пальмитиновая кислота содержит обладающую высокой химической активностью гидрофильную карбоксильную группу (– COOH) в начале и гидрофобный конец, который не обладает высокой химической активностью. Ненасыщенная олеиновая кислота имеет двойную связь между атомами углерода 8 и 9. Линолевая и арахидоновая кислоты должны непременно присутствовать в рационе человека.

Б.Липиды

Жирные кислоты могут связываться с другими группами, образуя различные типы липидов. Будучи нерастворимыми в воде (гидрофобными), они способны растворяться только в органических растворителях. Карбоксильная группа может образовывать эфирную или амидную связь. Соединения жирных кислот с глицеролом называют ацилглицеридами.

Структурные элементы важных макромолекул — гликолипиды (липиды с углеводными остатками) и фосфолипиды (липиды, у которых фосфатная группа присоединена к производному спирта). Сфинголипиды представляют собой группу молекул, входящих в состав биологических мембран. У них вместо глицерола к жирной кислоте присоединяется сфингозин. Сфингозин содержит сфингомиелин и ганглиозиды. Ганглиозиды составляют до 6% системных липидов ЦНС. Их расщепление обеспечивает целый ряд ферментов.

В. Липидные агрегаты

Благодаря биполярности жирные кислоты обладают способностью образовывать липидные агрегаты в воде. Гидрофильные концы стремятся к взаимодействию с водой, а гиброфобные проникают на поверхность воды и образуют поверхностную пленку. Находясь полностью под водой, липиды могут образовывать мицеллы, компактные и обезвоженные внутри. Фосфолипиды и гликолипиды обладают способностью образовывать двухслойные мембраны (липидный мембранный бислой). Они основные структурные элементы плазматических мембран.

Г. Другие липиды: стероиды

Стероиды — это мелкие молекулы, содержащие четыре разных углеродных кольца. Холестерин является предшественником основных классов стероидных гормонов — глюкокортикоидов, минералокортикоидов, андрогенов и эстрогенов. Каждый из классов гормонов имеет важную биологическую функцию, такую как сохранение беременности, поддержание жирового и белкового обмена, поддержание объема крови и кровяного давления, а также половое развитие.

Медицинская значимость

Существует несколько групп заболеваний, связанных с нарушением метаболизма липопротеинов и липидов. Среди них семейная гиперхолестеринемия (OMIM143890, см. с. 284), гиперлипопротеинемия (OMIM 238600), дисбеталипопротеинемия (OMIM107741) и недостаток липопротеинов высокой плотности (OMIM 142695). Генетически детерминированные нарушения катаболизма ганглиозидов приводят к развитию тяжелых заболеваний, например болезни Тея — Сакса (OMIM272800), возникающей вследствие нарушения расщепления ганглиозида GM2 (недостаточность β-N-ацетилгексозаминидазы), нескольких типов ганглиозидозов (OMIM 230500, 305650), болезни Сандхоффа (OMIM 268800) и др.

Липиды (жирные кислоты)

56	Молекулярные основы генетики

АМИНОКИСЛОТЫ

Аминокислоты (аминокарбоновые кислоты) — это элементарные структурные единицы белков. Аминокислота состоит из центрального α-атома углерода, к которому присоединены четыре разные химические группы — одна аминогруппа (–NH2), одна карбоксильная группа (–COOH), атом водорода (H) и боковая цепь, радикал (R). R — это основной элемент, определяющий функциональные свойства каждой аминокислоты. При рН-7 происходит ионизация групп NH2 и COOH. Двадцать различных боковых цепей определяют физико-химические свойства каждой из аминокислот. Аминокислоты существуют

вдвух конфигурациях: D- и L-изомеров. В составе белков, за редким исключением, присутствуют только L-конфигурации аминокислот. Аминокислоты классифицируют по их боковым цепям и химической активности. Для обозначения аминокислот используют однобуквенный и трехбуквенный коды. Незаменимыми аминокислотами, которые не синтезируются

ворганизме человека, являются Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Met, Thr и Lys. Их человек получает с пищей.

A. Алифатические аминокислоты

Аминокислоты с алифатической боковой цепью — это глицин с одним атомом водорода (–H) в качестве боковой цепи, аланин с метильной группой (–CH3) или с более крупной гидрофобной боковой цепью, такие как валин, лейцин и изолейцин. Пролин имеет боковую цепь, которая присоединяется как к центральному атому углерода, так и к аминогруппе, образуя кольцевую структуру. Гидрофобные ароматические боковые цепи присутствуют у фенилаланина (фенильная группа, присоединенная через метиленовую группу [– CH2–]) и триптофана (индольное кольцо, присоединенное через метиленовую группу). Две гидрофобные аминокислоты содержат атомы серы (S) — цистеин с сульфгидрильной группой (–SH) и метионин с тиоэфирной группой (–S–CH3). Сульфгидрильная группа цистеина обладает высокой реакционной способностью и образует ковалентные дисульфидные связи (–S–S–). Такие сшивки играют важную роль в стабилизации пространственной структуры белков. Аналог цистеина — селеноцистеин встречается в нескольких белках вроде фермента глутатионпероксидазы.

Б. Гидрофильные аминокислоты

Серин, треонин и тирозин содержат карбоксигруппы (–OH). Таким образом, они представляют собой гидролизованные формы глицина, аланина и фенилаланина. Гидроксигруппы делают их гидрофильными и химически активными. Аспарагин и глутамин содержат аминогруппу и амидную группу. При физиологических значениях рН их боковые цепи несут отрицательный заряд.

В. Заряженные аминокислоты

Такие аминокислоты содержат либо две несущие заряд аминогруппы (щелочные), либо две карбоксильные группы (кислотные). Основными несущими положительный заряд аминокислотами являются аргинин, лизин

игистидин. Гистидин имеет имидазольное кольцо, которое может как не иметь заряда, так и нести положительный заряд в зависимости от окружения. Обычно он встречается в реакционных центрах белков (например, на связывающем кислород участке гемоглобина). Аспарагиновая и глутаминовая кислоты содержат две карбоксильные группы (–COOH)

иобычно имеют кислотные свойства. Семь из 20 аминокислот содержат ионизирующиеся боковые цепи, что существенно повышает их реакционную способность (аспарагин, глутаминовая кислота, гистидин, цистеин, тирозин, лизин и аргинин).

Медицинская значимость

Глицин, фенилаланин, тирозин, гистидин, пролин и лизин, а также содержащие разветвленные цепи аминокислоты валин, лейцин и изолейцин связаны с некоторыми генетическими заболеваниями, при которых симптомы интоксикации возникают вследствие повышения или понижения их концентрации в плазме (нарушения метаболизма аминокислот).

Фенилкетонурия: нарушение гидроксилирования фенилаланина, в результате которого возникает набор симптомов разной тяжести (OMIM 261600, см. с. 294).

Лейциноз: по-разному проявляющееся заболевание, связанное с недостаточностью боковой цепи дегидрогеназы α-кетокислот, приводящей к накоплению валина, лейцина и изолейцина (OMIM 248600). Классическая тяжелая форма приводит к угнетению ЦНС у детей.

Аминокислоты

58	Молекулярные основы генетики

НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Нуклеиновые кислоты — это макромолекулы, которые в качестве субъединиц ДНК и РНК играют ключевую роль в хранении и передаче генетической информации. Они принимают участие во множестве биологических процессов, обеспечивают передачу энергии, являются частью необходимых коферментов и регулируют огромное количество функций обмена веществ.

A. Фосфатные группы

Фосфатные группы встречаются в нуклеиновых кислотах и нуклеотидах в виде монофосфатов (один атом фосфора), дифосфатов (два атома фосфора) или трифосфатов (три атома фосфора).

Б. Углеводные остатки

Углеводные остатки нуклеотидов обычно представляют собой производные рибозы в виде β-D-рибозы (РНК) или β-D-дезоксирибозы (ДНК).

В.Пиримидиновые азотистые основания

Три пиримидиновых азотистых основания: цитозин (C), тимин (T) и урацил (U) — различаются боковыми цепями (–NH2 присоединяется к атому углерода в позиции 4 (С-4) у цитозина, –CH3 в позиции C-5 у тимина и O в позиции C-4 у урацила). Кроме того, у цитозина присутствует двойная связь между N-3 и C-4.

Г. Пуриновые азотистые основания

Пуриновые азотистые основания аденин (A)

игуанин (G) различаются боковыми цепями

иналичием двойной связи между N-1 и C-6 (присутствует у аденина, отсутствует у гуанина).

Д. Нуклеозиды и нуклеотиды

Нуклеозид — соединение, состоящее из углеводного остатка (рибозы или дезоксирибозы) и азотистого основания. Связь присутствует между атомом углерода в позиции 1 (С-1) и атомом азота азотистого основания (N-гликозидная связь). Нуклеотид — это соединение, в состав которого входят углеводное основание из пяти атомов углерода (рибоза или дезоксирибоза), связанное с азотистым основанием (пиримидиновым или пуриновым), и фосфатная группа.

Нуклеозиды с разными основаниями делят на рибонуклеозиды и дезоксирибонуклеозиды, например аденозин и дезоксиаденозин, гуанозин и дезоксигуанозин, цитидин и дезоксицитидин. Уридин встречается только в форме рибонуклеозида, тимидин — только в виде дезоксирибонуклеозида.

Е. Нуклеиновая кислота

Нуклеиновая кислота состоит из нуклеотидов, последовательно соединенных фосфодиэфирным мостиком между 3'-атомом углерода одного нуклеотида и 5'-атомом углерода следующего нуклеотида. Линейную последовательность обычно представляют в виде отрезка с буквенными обозначениями соответствующих азотистых оснований, а считывание осуществляют в направлении от 5'- к 3'-концу. Например, ATCG обозначает последовательность из аденина (A), тимина (T), цитозина

Медицинская значимость

Перечисленные ниже заболевания — примеры наследственных состояний человека, возникающих в результате нарушения метаболизма пуринов и пиримидинов.

Гиперурикемия и подагра — группа заболеваний, связанных с генетически детерминированным повышением синтеза пуриновых предшественников (OMIM 240000).

Синдром Леша–Нихена — вариабельное, обычно тяжелое заболевание с Х-сцепленным типом наследования, при котором выраженные неврологические симптомы возникают у детей вследствие недостаточности гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (OMIM 308000).

Недостаточность аденозиндезаминазы — гетерогенная группа заболеваний, приводящих к возникновению тяжелого иммунодефицита у детей. Существуют формы, наследуемые по аутосомно-рецессивному и Х-сцепленному типу (OMIM 102700).

Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты

60	Молекулярные основы генетики

ДНК И ЕЕ КОМПОНЕНТЫ

ДНК состоит из трех компонентов: азотистых оснований, фосфатных групп и остатков сахара (дезоксирибозы). Компоненты образуют цепочку нуклеотидов, формирующих пространственную структуру, определяющую функции ДНК (см. с. 72). Другая нуклеиновая кислота содержит рибозу (рибонуклеиновая кислота, РНК).

А.Азотистые основания

Азотистые основания ДНК — это гетероциклические молекулы, представляющие собой производные пурина или пиримидина. В нуклеиновых кислотах двух типов, ДНК и РНК, встречается пять азотистых оснований. Пуриновые основания — это аденин (А) и гуанин (G), а пиримидиновые основания — тимин

(Т) и цитозин (С) в ДНК; в РНК тимин заменяет урацил (U). Азотистые основания являются частью субъединицы ДНК (нуклеотида). Нуклеотид состоит из всех трех компонентов ДНК — одного из четырех азотистых оснований, углевода (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Атом азота в позиции 9 пурина или в позиции 1 пиримидина связан с атомом углерода в позиции 1 сахара (N-гликозидная связь). У РНК есть два отличия от ДНК: она содержит рибозу вместо дезоксирибозы (в отличие от дезоксирибозы, рибоза имеет гидроксильную группу, присоединенную к атому углерода в позиции 1) и урацил вместо тимина. У урацила нет метильной группы у атома углерода в позиции 5. Нуклеозид состоит из азотистого основания, соединенного с атомом углерода в позиции 1 пентозы.

Б. Нуклеотидная цепь ДНК

ДНК — это линейный полимер, состоящий из дезоксирибоазотистых элементов. Цепь нуклеотидов образуется за счет присоединения гидроксильной группы углеводного остатка одного нуклеотида к фосфатной группе углеводного остатка следующего нуклеотида. Сахара, связанные вместе фосфатными группами, образуют инвариантную часть ДНК. Вариабельная часть ДНК — это последовательность азотистых оснований A, T, C и G. Нуклеотидная цепь ДНК ориентирована вследствие особенностей соединения углеродных остатков друг с другом. Фосфатная группа в позиции С-5 (5'-атом углерода) одного углеводного остатка соединяется с гидроксильной группой в позиции С-3 (3'-атом углерода) следующего углеводного остатка через фосфо-

диэфирный мостик. Таким образом, на одном конце цепи присутствует свободная 5'-фос- фатная группа, а на другом конце — свободная 3'-гидроксильная группа (5'-конец и 3'-конец соответственно). Нуклеотидную последовательность принято записывать в направлении от 5'- к 3'-концу.

В.Водородные связи между основаниями

Химическая структура азотистых оснований определяет специфические пространственные отношения. Пуриновое основание (аденин или гуанин) всегда находится напротив пиримидинового основания (тимина или цитозина). Три водородные связи возникают между цитозином (С) и гуанином (G). Между аденином

(А) и тимином (Т) образуются две водородные связи. Таким образом, либо гуанин и цитозин, либо аденин и тимин располагаются друг напротив друга, образуя комплементарные пары G-C и A-T. Другие пространственные отношения невозможны. Расстояние между двумя основаниями составляет 2,90 и 3,00 Å соответственно.

Г. Двойная цепь ДНК

ДНК состоит из двух цепей противоположной ориентации (антипараллельных) — одной в направлении от 5'- к 3'-концу, а другой в направлении от 3'- к 5'-концу. Последовательность азотистых оснований одной цепи ДНК (в направлении от 5'- к 3'-концу) комплементарна последовательности азотистых оснований (или просто последовательности оснований) другой цепи в направлении от 3'- к 5'-концу. Специфичность спаривания оснований — важнейшая структурная особенность ДНК.

ДНК и ее компоненты

62	Молекулярные основы генетики

ДНК КАК НОСИТЕЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ

Потребовалось на удивление много времени, чтобы понять, что за хранение и передачу генетической информации отвечает ДНК, а не белки, как считали ранее. Обнаружение Фридрихом Мишером в 1869 г. «нуклеина», нового, обладающего кислотными свойствами фосфоросодержащего вещества, которое Ричард Альтман в 1889 г. назвал нуклеиновой кислотой, не позволило понять его биологическую роль. К 1900 г. были известны пуриновые и пиримидиновые основания, а 20 лет спустя было выделено два вида нуклеиновых кислот, ДНК и РНК. Случайное, но оказавшееся верным наблюдение Фреда Гриффита в 1928 г., а также эксперименты Освальда Эвери в 1944 г. показали, что ДНК является носителем генетической информации.

A. Эксперимент Гриффита

В 1928 г. британский микробиолог Фред Гриффит, исследуя различные штаммы пневмококков (Streptococcus pneumonia — возбудитель воспаления легких, пневмонии), сделал интересное наблюдение. Он определил, что мыши, зараженные штаммом S (smooth), умирали (1), а животные, зараженные штаммом R (rough), выживали (2). Когда он инактивировал вирулентный штамм S нагреванием, животные тоже выживали (3). К его удивлению, смесь невирулентного штамма R и инактивированного нагреванием штамма S приводила к гибели животных так же, как и первоначальный штамм S (4). Когда он обнаружил нормальных живых пневмококков штамма S в крови животных, он сделал вывод, что клетки штамма R каким-то образом превратились в клетки штамма S. Это называется бактериальной трансформацией. В то время этот удивительный результат объяснить не удалось, поэтому к эксперименту отнеслись скептически. Его значение для генетики не было очевидно. (Рис. из: Stent & Calendar, 1978.)

Б. Трансформирующее начало ДНК

Открытия Гриффита послужили отправной точкой в экспериментах Эвери и его сотрудников в 1944 г. в Рокфеллеровском университете Нью-Йорка. Они определили, что веществом, вызвавшим трансформацию, была ДНК. Из культуры штамма S (1) был получен экстракт лизированных клеток (бесклеточный экстракт, 2). После того как из него удалили все

белки, липиды и полисахариды, экстракт сохранил способность трансформировать пневмококков штамма R в пневмококки штамма S (трансформирующее начало, 3).

Эвери и его сотрудники определили, что причиной была только ДНК. Таким образом, ДНК позволила дать объяснение наблюдениям Гриффита. После нагревания бактериальные хромосомы остались целыми. Фрагмент хромосомы с геном, ответственным за формирование капсулы (S-ген), мог высвободиться из разрушенных клеток штамма S, после чего его поглотили некоторые клетки штамма R при последующем культивировании. После встраивания S-гена в ее ДНК клетка штамма R превращалась в клетку штамма S (4). Этот вывод был сделан на основании способности бактерий поглощать чужеродную ДНК, которая меняет (трансформирует) некоторые из их генетических признаков.

В. ДНК передает генетическую информацию

Последнее доказательство того, что ДНК передает генетическую информацию, было представлено Херши и Чейзом в 1952 г. Они пометили белок оболочки бактериофага радиоактивной серой (35S), а ДНК радиоактивным фосфором (32P). После заражения бактерий меченым бактериофагом внутри клетки обнаружили только 32P (ДНК), а не 35S (белок оболочки). Последующее образование новых целых фаговых частиц в клетках показало, что ДНК была единственным носителем генетической информации, необходимой для формирования новых фаговых частиц.

	ДНК как носитель генетической информации	63

64	Молекулярные основы генетики

СТРУКТУРА ДНК

Открытие двойной спирали ДНК Уотсоном и Криком в 1953 г., в котором также приняли участие Розалинд Франклин и Морис Уилкинс, считают поворотным моментом, краеугольным камнем современной генетики. Новые особенности такой структуры объясняют два фундаментальных генетических механизма: хранение генетической информации в линейном, считываемом формате, а также репликацию генетической информации, обеспечивающую успешную ее передачу от поколения к поколению.

A. Двойная спираль ДНК

Две комплементарные полинуклеотидные цепи ДНК закручиваются одна вокруг другой в противоположных направлениях, образуя двойную спираль с единой осью. Азотистые основания расположены внутри молекулы парами (аденин напротив тимина, A—T, а гуанин напротив цитозина, G—C). Сахарофосфатный остов находится снаружи. Можно различить малую и большую бороздки. ДНК встречается в нескольких формах, таких как A-ДНК, В-ДНК и Z-ДНК. Наиболее распространена В-форма ДНК с примерно 10 парами на виток.

Б.Репликация

Комплементарное расположение пар оснований позволяет получить точную копию (реплику) молекулы ДНК. Каждая цепь служит матрицей для образования новой цепи. Репликация ДНК полуконсервативна. Это значит, что каждая новая комплементарная цепь копируется с каждой из существующих цепей.

В.Денатурация иренатурация

ДНК стабильна при физиологической температуре благодаря множеству водородных связей, удерживающих вместе несколько сотен миллионов нуклеотидов. Две цепи разделяют раскручиванием, а затем подвергают воздействию высоких температур или химических реагентов (например, щелочи, формамида или мочевины). Такой обратимый процесс называют денатурацией или плавлением. Температура плавления (Tm) зависит от многих факторов, в том числе от доли пар G—C, поскольку три водородные связи между G и С более стабильны, чем две водородные связи пар А—Т. Полученные в результате одноцепочечные молекулы ДНК не сохраняют спиральную структуру. При понижении темпера-

туры, увеличении концентрации ионов или нейтрализации рН две цепи снова собираются в двойную спираль (ренатурация), однако это происходит только в том случае, если они комплементарны. При полной комплементарности гибридизация происходит быстро, при частичной — медленно, а при отсутствии комплементарности гибридизации не происходит. Способность одноцепочечной ДНК к гибридизации показывает, что две цепи комплементарны друг другу. Габридизацию одноцепочечных ДНК или РНК широко используют для выявления комплементарных фрагментов ДНК или РНК.

Г. Передача генетической информации

Расшифровку и считывание последовательности азотистых пар (A—T и G—C) осуществляют в два этапа, называемых транскрипцией

итрансляцией. При транскрипции последовательность одной или двух цепей ДНК преобразуется в комплементарную последовательность оснований в виде похожей молекулы, известной как информационная РНК (мРНК). Цепь ДНК, которая расположена в направлении от 3'- к 5'-концу (кодирующая цепь), служит матрицей. При трансляции эта последовательность преобразуется в определенную последовательность аминокислот. Триплет, состоящий из трех пар оснований (кодон), кодирует одну из 20 аминокислот. Начавшись в определенной стартовой точке (метионин), происходит преобразование азотистой последовательности молекулы мРНК в соответствующую аминокислотную последовательность. ДНК

иРНК различаются одним нуклеотидом: РНК содержит урацил (U) вместо похожего на него по структуре тимина. Механизмы и биохимические реакции, лежащие в основе транскрипции и трансляции, являются комплексными (здесь не представлены).

Структура ДНК

66	Молекулярные основы генетики

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК

Репликацией называют процесс копирования каждой из цепей ДНК и образования новой комплементарной цепи. Это происходит при каждом делении клетки и обеспечивает передачу генетической информации обеим дочерним клеткам. Для репликации ДНК необходимо слаженное действие множества белков комплекса, называемого реплисомой. В ходе репликации требуется высокая скорость и точность — сборка двух новых цепей ДНК у Escherichia coli происходит со скоростью около 1000 нуклеотидов в секунду. При репликации каждая из ранее существовавших цепей ДНК служит матрицей для образования новой цепи. Это называют полуконсервативной репликацией.

A. Репликация у прокариот начинается в одной точке

В клетках прокариот репликация начинается

вопределенной точке кольцевой бактериальной хромосомы — точке начала репликации (1). Формирование новой ДНК происходит

вобоих направлениях. Репликацию можно визуализировать методом авторадиографии, встроив во вновь образовавшуюся ДНК меченый тритием (3Н) тимидин (2).

Б. Репликация у эукариот начинается в нескольких точках

У эукариот синтез ДНК происходит в определенной фазе клеточного цикла (фаза S). Репликация ДНК эукариот начинается во множестве точек (репликонов) (1). В каждой из таких точек две исходные цепи раскручивают хеликазы. Репликация идет в обоих направлениях от точки старта до тех пор, пока не происходит слияния соседних репликонов (2) и удвоения всей ДНК (3). На электронной микрофотографии (4) представлены репликоны в трех точках (обозначены стрелками).

В.Репликативная вилка

При репликации ДНК в точке, где открывается двойная спираль и начинается синтез новых цепей, образуется специфическая структура, называемая репликативной вилкой (1). В состав этого мультиферментного комплекса входят ферменты для синтеза ДНК. Он продвигается вдоль двойной спирали по мере раскручивания родительских цепей ДНК-хеликазами. Перед этим фермент, называемый топоизомеразой I, связывается с ДНК в случайных точках и ослабляет торсионное напряжение,

разрывая фосфодиэфирные связи одной из цепей. Каждая из ранее существовавших цепей ДНК служит матрицей для синтеза новой цепи (образуется репликативный глазок). Однако репликативная вилка асимметрична. Одна из дочерних цепей синтезируется непрерывно — это лидирующая цепь, в то время как другая цепь отстает (отстающая цепь). Синтез новой ДНК всегда осуществляется в направлении от 5'- к 3'-концу. Как следствие, нуклеотиды могут присоединяться к лидирующей цепи непрерывно (2), а для отстающей цепи такое невозможно.

Для репликации необходима затравка (праймер) из комплементарной РНК в точке начала репликации. У лидирующей цепи синтез ДНК идет непрерывно от единственной затравки в направлении от 5'- к 3'-концу. По отстающей цепи, напротив, ДНК синтезируется мелкими фрагментами из 1000–2000 нуклеотидов (фрагменты Оказаки) в противоположном направлении. Каждому фрагменту Оказаки требуется свой праймер. Впоследствии праймеры удаляются и заменяются цепью ДНК от следующего фрагмента, устранение разрывов происходит благодаря ДНК-лигазе. Фермент, ответственный за синтез ДНК, ДНКполимераза III, является комплексным и содержит несколько субъединиц. У эукариот разные ферменты осуществляют синтез лидирующих и отстающих цепей ДНК. Система коррекции ошибочного спаривания и система репарации устраняют ошибки репликации.

Репликация ДНК

68	Молекулярные основы генетики
ПОТОК ГЕНЕТИЧЕСКОЙ					полипептидной цепи. тРНК содержит называе-
ИНФОРМАЦИИ: ТРАНСКРИПЦИЯ					мый антикодоном фрагмент, который компле-
И ТРАНСЛЯЦИЯ					ментарен кодону мРНК. На рисунке представ-
					лены кодоны мРНК 1, 2, 3 и 4, обеспечивающие


					синтез следующей аминокислотной последо-
Превращение содержащейся в нуклеотидной					вательности: метионин (Met), глицин (Gly), се-
последовательности гена информации в важ-					рин (Ser) и изолейцин (Ile). В рассмотренном
ную биологическую функцию происходит в два					примере далее		происходит	присоединение
этапа — транскрипции и трансляции. Такой					глицина и аланина.
поток	генетической	информации		является	В. Этапы трансляции
однонаправленным.		Сначала	информация
из кодирующих последовательностей генов					Трансляция происходит в три этапа. Первый
транскрибируется в промежуточную молеку-					этап называют инициацией (1), когда идет
лу РНК, последовательность которой строго					формирование обеспечивающего инициацию
комплементарна последовательности кодиру-					комплекса из мРНК, рибосомы и тРНК. Для
ющей цепи ДНК (транскрипция). Затем инфор-					него необходимы факторы инициации (IF1,
мация	последовательностей матричной РНК				IF2, IF3 и т. д., на рисунке не представлены).
(мРНК) превращается в соответствующую по-					За инициацией следует элонгация (2), когда
следовательность аминокислот (трансляция).					к цепи присоединяется следующая амино-
У эукариот для того чтобы трансляция стала					кислота, кодируемая следующим				кодоном.
возможна, предшественник РНК преобразует-					Трехфазный	цикл элонгации		предполагает
ся в молекулу мРНК. У прокариот мРНК транс-					распознавание кодона, связывание следую-
крибируется прямо с ДНК.					щего аминокислотного остатка с пептидом
А.Транскрипция					и продвижение		(транслокацию)		рибосомы
					на три азотистых основания дальше в направ-
При транскрипции нуклеотидная последо-					лении 3'-конца мРНК. Трансляция завершается
вательность ДНК транскрибируется в ком-					терминацией (3), когда рибосома достигает
плементарную молекулу РНК (мРНК). Цепи					одного из трех стоп-кодонов мРНК (UAA, UGA
двойной спирали ДНК расходятся благодаря					или UAG). Трансляция (синтез белка) у эука-
большому набору белков (различных ДНК-					риот происходит не в ядре клетки, а на рибо-
хеликаз). Цепь ДНК, развернутая в направле-					сомах цитоплазмы. В этой книге представлено
нии от 3'- к 5'-концу (кодирующая цепь), слу-					сильно упрощенное описание этапов указан-
жит матрицей для транскрипции ДНК в РНК					ных биохимических процессов.
с помощью РНК-полимеразы. Синтез РНК осу-					Г. Структура транспортной РНК
ществляется в направлении от 5'- к 3'-концу.
Такую цепь называют смысловой последова-					Транспортная РНК имеет конформацию «кле-
тельностью РНК. РНК, которая в эксперимен-					верного листа», которая здесь рассмотрена
тальных условиях транскрибируется в обрат-					на примере фенилаланиновой тРНК дрожжей
ном направлении, называют антисмысловой.					(1). У нее есть неспаренные участки, петли,
Обычно такие РНК ингибируют транскрипцию.					четыре двухцепочечных фрагмента и сте-
Б.Трансляция					бель. тРНК имеет сложную пространствунную
					структуру (2), внутри которой можно выделить
Трансляцией называют процесс, при котором					разные функциональные участки — сайт рас-
нуклеотидная последовательность мРНК ис-					познавания кодона мРНК (антикодон) и сайт
пользуется для синтеза аминокислотной по-					связывания	соответствующей		аминокислоты
следовательности (полипептидной				цепочки),	(акцепторный стебель) на 3'-конце (акцептор-
кодируемой соответствующим			фрагментом		ный конец).

ДНК. Трансляция происходит по рамке считывания, которая определяется в начале трансляции (стартовый кодон AUG). Помимо мРНК при трансляции используются еще два типа молекул РНК — транспортные РНК (тРНК) и рибосомные РНК (рРНК). тРНК расшифровывает кодоны. Для каждой аминокислоты существует набор тРНК, обеспечивающих связывание аминокислоты и ее доставку к месту растущей

Поток генетической информации: транскрипция и трансляция

70	Молекулярные основы генетики

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД

Генетический код — правила, в соответствии с которыми последовательность спаренных азотистых оснований ДНК обеспечивает появление соответствующей аминокислотной последовательности. Генетический код состоит из триплетов. Каждый элемент кода (кодон), соответствующий определенной аминокислоте, представляет собой последовательность из трех нуклеотидных пар. Генетический код называют вырожденным, потому что некоторые аминокислоты закодированы сразу несколькими кодонами (обычно двумя–четырь- мя, но у лейцина, серина и аргинина число кодонов может достигать шести). Генетический код также определяет начало (старт-кодон) и конец (стоп-кодон) кодирующей области. Генетический код универсален. Большинство организмов (бактерии и вирусы, растения и животные) использует один и тот же генетический код. Исключение составляют митохондрии и хлоропласты у растений.

A. Генетический код в форме информационной РНК

Первое, второе и третье азотистые основания в направлении от 5'- к 3'-концу образуют кодон для одной из 20 аминокислот. Каждый кодон соответствует единственной аминокислоте. Генетический код в форме информационной РНК (мРНК) отличается от генетического кода ДНК наличием урацила (U) вместо тимина (Т). Избыточность генетического кода можно продемонстрировать на аминокислоте фенилаланин, которая одновременно соответствует кодонам UUU и UUC. Сразу шесть кодонов

кодируют аминокислоту серин — UCU, UCC, UCA, UCG, AGU и AGC. Третья азотистая пара (на 3'-конце триплета) каждого кодона наиболее вариабельна. Метионин (AUG) и триптофан (UGG) — аминокислоты, кодируемые единственными кодонами. Функцию старткодона выполняет AUG (метионин). Стопкодоны — UAA, UAG и UGA.

Правила генетического кода удалось установить в 1966 г., проанализировав процесс передачи информации от генов к белкам через триплеты. Некоторые отклонения от стандартного генетического кода представлены в таблице ниже.

Б. Запись генетического кода

Чтобы сэкономить место, для записи длинных последовательностей аминокислот используют аббревиатуры, обозначая каждую аминокислоту только одной буквой.

В. Перекрывающиеся рамки считывания

Рамка считывания — это нуклеотидная последовательность, которая начинается со старткодона и заканчивается стоп-кодоном. Содержащую генетическую информацию область между старт-кодоном и стоп-кодоном называют открытой рамкой считывания (ORF). Внутри открытой рамки считывания нет других стоп-кодонов. Как правило, рамки считывания не перекрываются. Из трех возможных рамок считывания, А, Б и В, только одна правильная (ORF A). Рамки считывания Б и В прерываются стоп-кодонами после трех или пяти кодонов соотвественно, поэтому не могут быть кодирующими участками (слишком короткие).

Таблица. Отличия от стандартного генетического кода

Кодон	Стандартный генетический	Отличие	Встречаемость
Кодон	код	Отличие	Встречаемость
	код
UGA	Стоп-кодон	Триптофан	Mycoplasma, митохондрии
UGA	Стоп-кодон	Триптофан	некоторых видов
			некоторых видов
CUG	Лейцин	Треонин	Митохондрии дрожжей
UAA, UAG	Стоп-кодон	Глицин	Acetabularia, Tetrahymena,
UAA, UAG	Стоп-кодон	Глицин	Paramecium
			Paramecium
UGA	Стоп-кодон	Цистеин	Euplotes

Генетический код

72	Молекулярные основы генетики

СТРУКТУРА ГЕНА У ЭУКАРИОТ

В генах эукариот кодирующие последовательности прерываются некодирующими последовательностями различной длины. Кодирующие последовательности называют экзонами, а некодирующие — интронами. Эти термины были введены У. Гилбертом в 1978 г. Удаление интронов происходит до начала трансляции (данный процесс называют РНК-процессингом). Некоторые интроны содержат последовательности, необходимые для регуляции активности гена.

A.Экзоны иинтроны

В 1977 г. случайно удалось установить, что ДНК генов эукариот длиннее, чем соответствующая информационная РНК (мРНК). При гибридизации мРНК с комплементарной одноцепочечной ДНК остаются петли одноцепочечной ДНК, которые можно заметить на электронной микрофотографии (1). мРНК гибиридизуется только с определенными фрагментами одноцепочечной ДНК, потому что она короче соответствующей кодирующей цепи ДНК (2). Семь петель (A-G) и восемь гибридизующихся фрагментов представлены на рисунке (1–7, буквой L отмечен начальный фрагмент). Из 7700 азотистых оснований ДНК этого гена (3) только 1825 гибридизуются с мРНК. Каждый гибридизующийся фрагмент представляет собой экзон, здесь таких экзонов семь. Одноцепочечные фрагменты, которые не гибридизуются, представляют собой интроны. Определенный размер и расположение экзонов и интронов характерны для каждого эукариотического гена (экзон-ин- тронная структура). (Электронная микрофотография из: Chambon, 1981.)

Б. Промежуточные последовательности ДНК (интроны)

У прокариот ДНК коллинеарна мРНК и не содержит интронов (1). У эукариот зрелая мРНК комплементарна лишь определенным участкам ДНК, потому что гены содержат интроны (2).

В. Основная структура и процессинг транскрипта эукариотического гена

Экзоны и интроны нумеруют в направлении от 5'- к 3'-концу кодирующей цепи. Как экзоны, так и интроны транскрибируются в предшественник РНК (первичный транскрипт). Первый и последний экзоны обычно содержат нетранслируемые последовательности — это

нетранслируемая область на 5'-конце (5'-UTR) и нетранслируемая область на 3'-конце (3'- UTR) последнего экзона. После транскрипции начинается процессинг РНК, во время которого из первичного транскрипта благодаря механизму, называемому сплайсингом, вырезаются некодирующие фрагменты (интроны). Сплайсинг идет внутри сплайсосомы, его точность обеспечивает поддержание правильной рамки считывания.

Интроны почти всегда начинаются с азотистой пары GT (GU для РНК), а в конце стоит азотистая пара AG (в направлении от 5'- к 3'-концу). Последовательность на 5'-конце интрона, начинающуюся с азотистой пары GT, называют донором сплайсинга. Последовательность, называемая акцептором сплайсинга, расположена на 3'-конце интрона. Дополнительная модификация зрелой мРНК происходит за счет присоединения стабилизирующей структуры (кэпа) к ее 5'-концу и присоединения поли(А)- фрагмента к 3'-концу (полиаденилирование).

Г. Сплайсинг в интронах GU-AG

Сплайсинг происходит в большей степени благодаря молекулам РНК, чем белкам. Сплайсосома состоит из пяти небольших ядерных рибонуклеопротеинов (snRNA) и белков. Каждый из небольших ядерных нуклеопротеинов связывается не менее чем с семью белковыми субъединицами. Основной механизм сплайсинга предполагает автокатилитическое отщепление на 5'-конце интрона, что приводит к образованию структуры типа «лассо» (лариата). Эта промежуточная кольцевая структура образуется за счет присоединения 5'-конце- вого фрагмента (UG) к основанию (А) внутри интрона. Такой фрагмент называют петлей. На следующем этапе благодаря расщеплению на 3'-конце высвобождается интрон в виде лариата. Одновременно происходит сшивание правого экзона (после сплайсинга) с левым экзоном. Лариат линеаризуется и превращается в линейный интрон, который быстро расщепляется. Фрагмент с петлей распознает 3'-конец, обеспечивая точность вырезания акцептора сплайсинга, он находится на 18–40 азотистых основаниях дальше в направлении 5'-конца от 3'-конца участка сплайсинга.

Структура гена у эукариот

74	Анализ ДНК

ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ

ДНК можно разрезать в определенных местах на относительно небольшие фрагменты воспроизводимых размеров с помощью специальных ферментов. Ферменты начинают действовать только при встрече со специфичной нуклеотидной последовательностью (сайтом узнавания или сайтом рестрикции). Такие ферменты, называемые эндонуклеазами рестрикции (или рестриктазами), присутствуют у различных бактерий. Из отдельных бактерий удалось выделить около 400 эндонуклеаз рестрикции. Рестриктазы защищают бактерии от заражения чужеродными ДНК. Размеры фрагментов ДНК, которые можно получить с помощью определенного фермента, зависят от распределения его сайтов рестрикции.

A. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции

Многие рестриктазы разрезают ДНК несимметрично. Из-за этого на обоих концах фрагмента ДНК остаются выступающие одноцепочечные участки. Например, сайт узнавания широко известного рестрикционного фермента EcoRI, который получают из бактерий Escherichia coli, — это 5'-GAATTC-3' (1). Он разрезает ДНК несимметрично, и по краям образуются выступающие однонитевые цепи ДНК («липкие» концы). У одного фрагмента (3'-5') выступающий конец состоит из четырех нуклеотидов (3'-TTAA), а у другого фрагмента (5'-3') присутствует выступающий конец AATT-3' (2). Образующиеся в результате асимметричного расщепления последовательности называются палиндромными, поскольку одинаково читаются в противоположных направлениях. Некоторые рестриктазы, например фермент HaeIII (5'-CGCG-3'), разрезаются строго посередине (3) и обеспечивают образование фрагментов с тупыми концами (4). Одноцепочечные «липкие» концы фрагментов ДНК легко снова соединяются друг с другом.

Б. Примеры эндонуклеаз рестрикции

Рестриктазы можно классифицировать на основании того, какие концы они образуют. Это могут быть (1) выступающие 5'-концы (например, рассмотренный выше фермент EcoR), (2) выступающие 3'-концы (например, PstI), (3) тупые концы (например, AluI, HaeIII, см. выше, HpaI) или (4) непалиндромные концы (MlnI). Некоторые ферменты имеют сайт узнавания с различным количеством нуклеотидов на выступающих концах (например, BstI).

Определенные ферменты, например HindII, нуждаются в том, чтобы два основания в середине были пуриновыми и пиримидиновыми (GTPy-PuAC), при этом неважно, является ли первое основание тимином (Т) или цитозином (С), а последнее аденином (А) или гуанином

(G). Такие сайты узнавания встречаются часто и обеспечивают образование большого количества относительно небольших фрагментов. Другие рестриктазы распознают длинные последовательности, состоящие из 10 и более нуклеотидов. Поэтому они обеспечивают образование более длинных фрагментов. Ряд ферментов обладает ограниченной специфичностью узнавания сайта.

В. Определение местоположения сайтов рестрикции

Так как размеры фрагментов позволяют получить информацию о местоположении разрывов цепи, их можно использовать для описания сегмента ДНК (рестрикционная карта). Например, если сегмент ДНК длиной 10 килобаз (тпн) расщепляют два фермента, А и В, и в результате образуется три фрагмента длиной 2, 3 и 5 тпн, можно определить, в каких местах возникают разрывы цепи. Если фермент А обеспечивает образование двух фрагментов длиной 3 и 7 тпн, а фермент В — двух фрагментов длиной 2 и 8 тпн, то сайты узнавания ферментов А и В должны быть расположены на расстоянии 5 тпн друг от друга. Сайт узнавания фермента А должен быть расположен в 3 тпн от левого конца, а сайт узнавания фермента В должен находиться в 2 тпн от правого конца (обозначены красными стрелками).

Г.Рестрикционная карта

В приведенном на рисунке примере, для того чтобы получить описание сегмента ДНК, анализируют распределение сайтов узнавания для ферментов E (EcoRI) и H (HindIII). Отдельные сайты разделены интервалами, которые определяет размер фрагментов, образовавшихся после обработки ферментом. Рестрикционное картирование играло важную роль в медицинской генетике и эволюционных исследованиях, до того как появилась возможность получать информацию напрямую с помощью секвенирования ДНК.

Эндонуклеазы рестрикции

76	Анализ ДНК

АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК

Внедрение в 1985 г. бесклеточных методов размножения фрагментов ДНК определенного происхождения из сложных смесей позволило вывести молекулярный анализ ДНК и генов на новый уровень. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это быстрый чувствительный автоматизированный бесклеточный метод размножения фрагментов ДНК, требующий минимального количества ДНК. Чувствительность метода настолько высока, что загрязнение нежелательной ДНК происходит очень легко, в связи с чем необходимо соблюдать определенные правила.

A. Полимеразная цепная реакция

Стандартная ПЦР — это in vitro метод амплификации определенной ДНК-мишени, полученной из малого количества ДНК. Для селективной амплификации необходимо предварительно получить информацию о последовательностях ДНК, фланкирующих ДНК-мишень. Чтобы запустить синтез ДНК, используют два олигонуклеотидных праймера (затравки) длиной около 15–25 нуклеотидных пар. Праймеры комплементарны последовательностям, лежащим по краям амплифицируемого фрагмента, и связываются только с этими последовательностями. В каждом из циклов ПЦР происходит денатурация двухцепочечных молекул ДНК, а каждая отдельная цепь используется как матрица для синтеза новой цепи. ПЦР — это цепная реакция, которую проводят в 25–35 циклов. Продолжительность каждого цикла, включающего три точно контролируемые по времени и по температуре реакции, выполняемые в автоматизированном термоцикле, составляет 1–5 мин. Цикл предполагает три этапа: а) денатурация двухцепочечной ДНК при температуре около 93–95 °C (для человеческой ДНК); б) отжиг праймера при температуре 50–70 °C в зависимости от ожидаемой температуры его посадки на матрицу; в) синтез ДНК с использованием термостабильной ДНК-полимеразы (полученной из микроорганизмов, живущих в горячих источниках, например Taq-полимеразы Thermophilus aquaticus) обычно при температуре около 70–75 °C. В каждом последующем цикле матрица (обозначена синим) и ДНК, которая была синтезирована в предшествующем цикле (обозначена красным), служат матрицами для следующего синтеза. Первый цикл приводит к появлению вновь синтезированной ДНК различной длины (показана стрелкой) на 3'-концах, потому

что синтез продолжается за пределами по- следовательности-мишени. Однако цепи ДНК фиксированной длины на обоих концах быстро превосходят по численности цепи переменной длины, потому что синтез не может выйти за конец праймера на противоположной ДНК-матрице. В итоге за 25 циклов образуется не менее 107 копий специфичной последо- вательности-мишени. Их можно визуализировать как отдельную полосу определенного размера, применив электрофоретическое разделение в полиакриламидном геле. В дополнение к стандартной реакции для различных целей было разработано большое количество автоматизированных методов на основе ПЦР. (Рис. из: Alberts et al, 2015.)

Б. ПЦР с обратной транскрипцией

Метод ПЦР с обратной транскрипцией (RTPCR) предполагает использование мРНК в качестве материала для анализа. После связывания с первым праймером синтез новой комплементарной ДНК происходит за счет обратной транскрипции. Полученная кДНК служит матрицей для второй цепи ДНК. Впоследствии благодаря ПЦР образуется множество копий кДНК.

В.Аллель-специфичная ПЦР

Метод позволяет амплифицировать последовательность ДНК лишь одного из аллелей. Если аллель 1 в определенной области содержит пару A-T (1), а аллель 2 содержит пару C-G (2), то два аллеля можно отличить друг от друга методом ПЦР. Аллель-специфичная ПЦР для аллеля 1 с полностью комплементарного прайма проходит нормально (3), при этом для второго аллеля амплификация невозможна (4). Точно так же ПЦР для аллеля 2 может пройти со специфичного праймера нормально (5), а наработка другого аллеля будет невозможна (6). ПЦР с обратной транскриптазой можно применять в тех случаях, когда известные экзонные последовательности внутри гена расположены на большом расстоянии друг от друга. Благодаря применению быстрой амплификации концов комплементарной ДНК (кДНК) можно выделить из кДНК 5'- и 3'-конце- вые фрагменты. Другие разновидности ПЦР — это Alu-ПЦР, заякоренная ПЦР, ПЦР в реальном времени и пр.

Амплификация ДНК

78 Анализ ДНК

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК		Б. Автоматическое
		секвенирование ДНК
С внедрением двух основных методов опре-		Для автоматического секвенирования ДНК ис-
деления	последовательности нуклеотидов	пользуют флуоресцентные метки (в отличие
(секвенирование ДНК) в 1977 г. началась новая		от 32P) и соответствующие системы детекции.
эпоха в генетическом анализе. Один из ме-		Флуоресцентная метка представляет собой
тодов основан на химическом расщеплении		флуорофор,	который	испускает	излучение

и разработан А. М. Максам и У. Гилбертом,		определенной длины волны под действием
другой — ферментный метод, разработанный		УФ-света. Каждая метка связывается с од-
Ф. Сэнгером и его сотрудниками. Метод хими-		ним из четырех азотистых оснований и ис-
ческого расщепления больше не используют,		пускает сигнал, позволяющий идентифици-
в то время как метод Сэнгера имеет широкое		ровать основание. Таким способом можно
применение и в конечном счете лег в основу		четко обозначить каждое из четырех основа-
первого метода автоматического секвениро-		ний. Испускаемый флуоресцентный сигнал ре-
вания.		гистрируют в фиксированной точке, когда ДНК
A. Секвенирование по Сэнгеру		проходит через капилляр с гелем. Для каждого
		дидезоксинуклеотида используют метку свое-
В основе метода лежит механизм обрыва син-		го цвета, например зеленую для ddATP, синюю
теза ДНК при встраивании полимеразой диде-		для ddCTP, черную для ddGTP и красную для
зоксинуклеотида (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP)		ddTTP (1). (В реальности цвета меток могут
вместо нормального дезоксинуклеотида (dATP,		отличаться.) Все цепи, обрывающиеся на аде-
dTTP, dGTP, dCTP). Дидезоксинуклеотид —		нине (А), испускают зеленый сигнал, все цепи,
это аналог нормального дезоксинуклеотида,		обрывающиеся на цитозине (С), испускают си-
но без гидроксильной группы у 3'-атома угле-		ний сигнал и т. д. Реакции секвенирования (2)
рода. Когда в процессе синтеза ДНК в синте-		проводят в специальных капиллярах (3). При
зируемую цепь встраивается дидезоксинукле-		электрофоретическом		разделении	миграция
отид, становится невозможным образование		меченых дидезоксинуклеотидных цепей в геле
связи между его 3'-атомом углерода и следую-		внутри капилляра происходит при их возбуж-
щим нуклеотидом.		дении лазерным лучом, который направлен
Синтез ДНК запускают с помощью прайме-		в определенную точку (4). Детекторная систе-
ра длиной около 20 нуклеотидов и проводят		ма считывает последовательность, записывает
четыре параллельные реакции с участием		ее в электронном виде и визуализирует в виде
всех четырех дезоксинуклеотидов и неболь-		разноцветных пиков, положение которых со-
шой примесью одного дидезоксинуклеотида,		ответствует положению нуклеотидов в после-
фосфатная группа которого снабжена еще		довательности (5). Разработано несколько
и радиоактивной меткой 32Р (1). Когда диде-		различных	методов секвенирования. (Рис.:
зоксинуклеотид ddATP встраивается в новую		N. Wagner, Эссен, с разрешения.)
цепь ДНК, происходит ингибирование даль-
нейшего синтеза. Если использовать доста-
точно низкую концентрацию ddATP, цепь будет
обрываться не на каждом А. У образующихся
фрагментов одинаковые 5'-концевые участки,
однако их 3'-концевые участки имеют разную
длину и каждый из них заканчивается на А (1).
Таким образом, каждый фрагмент ДНК обры-
вается на А в определенной позиции. Так же
происходит в остальных трех реакциях — ра-
стущая цепь ДНК обрывается на G для ddGTP
(2), на С для ddCTP (3) и на Т для ddTTP (4).
Выравнивая концы фрагментов по размеру,
по нуклеотидам на концах фрагментов мож-
но точно	определить последовательность.

Сначала для определения последовательности применяли электрофорез в полиакриламидном геле, а затем автоматическое секвенирование (см. раздел Б).

Секвенирование ДНК

80	Анализ ДНК

ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК (СЕКВЕНИРОВАНИЕ ВТОРОГО И ТРЕТЬЕГО ПОКОЛЕНИЙ)

После 2005 г. появилось несколько принципиально новых методов секвенирования ДНК. Все эти методы в совокупности называют секвенированием нового поколения (NGS). Они принципиально отличаются от дидезоксисеквенирования по Сэнгеру (см. предыдущий рисунок). Методы предполагают подготовку матрицы, секвенирование путем синтеза ДНК без электрофоретического разделения, визуализацию с высоким разрешением, сборку меток и выравнивание последовательностей. Секвенатор проводит автоматическое параллельное определение миллионов последовательностей, позволяя быстро и относительно дешево прочитывать последовательность всего генома (полногеномное секвенирование). Существующие методы NGS помогают прочитывать последовательности разной длины, а также различаются производительностью. В течение нескольких дней можно получить от 1 до 50 гигабаз (109). Далее рассмотрен принцип, лежащий в основе одного из таких методов.

A. Отбор лигированных фрагментов ДНК

Двухцепочечную ДНК фрагментируют (1) и после репарации концов добавляют свисающие молекулы аденина (А) (2). Уникальную адаптерную последовательность лигируют с каждым из фрагментов (3). Таким способом получают библиотеку, содержащую набор фланкированных адаптерами ДНК (4).

Б. Создание кластера методом мостиковой ПЦР (полоний)

Модифицированные адаптером одноцепочечные фрагменты ДНК иммобилизуют на поверхности проточного канала на предметном стекле, называемом проточной ячейкой. Твердофазную амплификацию осуществляют с использованием иммобилизованных праймеров и ДНК-полимеразы. В результате образуется множество (100–200 млн) пространственно разделенных ДНК-кластеров, называемых полониями. После денатурации и разделения цепей каждый кластер (колонию молекул) из этой популяции секвенируют отдельно. Секвенирование начинают со свободного конца, с которым связывается уни-

версальный праймер, обеспечивающий запуск процесса.

В. Секвенирование путем синтеза и визуализации

Секвенирование осуществляется за счет непрерывного синтеза ДНК, а не за счет обрыва цепей, как в методе Сэнгера. Для визуализации реакций синтеза используют четыре цвета, каждый из которых соответствует определенному синтезируемому нуклеотиду. Новую цепь синтезируют на матрице с последовательностью CGAGGC (на рисунке представлена новая цепь GCTCC).

Г. Обзор

Четыре этапа секвенирования: (1) фрагментация ДНК; (2) лигирование адаптера in vitro; (3) создание кластеров (полоний); (4) секвенирование в проточной ячейке. (Рис. из: Illumina Inc., США, с разрешения.)

Секвенирование экзома: этот автоматизированный метод предназначен для анализа всех кодирующих областей генома, экзонов. Из фрагментов геномной ДНК получают библиотеку. Фрагменты из библиотеки фланкируют адаптерными олигонуклеотидами, после чего происходит связывание и обогащение экзомсодержащих фрагментов. Полученные фрагменты экзома амплифицируют и секвенируют.

Высокопроизводительное секвенирование ДНК

82 Анализ ДНК

КЛОНИРОВАНИЕ ДНК			Б. Векторы для клонирования ДНК
			Векторы представляют собой молекулы, по-
Клонирование ДНК предполагает селек-			зволяющие отбирать требуемые фрагмен-
тивную амплификацию специфических по-			ты ДНК. Для клонирования фрагментов ДНК
следовательностей ДНК в виде фрагментов.			определенной	длины существует			большое
Требуемые фрагменты ДНК идентифицируют			количество различных систем ДНК-векторов.
методом	гибридизации с комплементарной		Плазмидные векторы используют для клониро-

одноцепочечной ДНК. Короткий сегмент од-			вания небольших фрагментов. Дизайн экспе-
ноцепочечной ДНК (ДНК-зонд), полученный			римента предполагает, что плазмида со встро-
из исследуемой последовательности, гибри-			енным в нее подлежащим клонированию
дизуется с комплементарными последова-			фрагментом обеспечивает бактерии-хозяину
тельностями одиночной цепи. Таким способом			устойчивость к антибиотику при культивирова-
идентифицируют и отбирают фрагмент для			нии на содержащей антибиотик среде. Одним
анализа. После отделения гибридизованной			из первых был получен плазмидный вектор
последовательности от остальной ДНК ее			pBR322 (Bolivar et al., 1977). Он короткий, со-
можно клонировать.			стоит из 4363 пн. В его состав входят сайт на-
A. Клеточные методы			чала репликации и два гена, ответственные
			за устойчивость к антибиотикам ампициллину
клонирования ДНК			и тетрациклину (1). Вектор сконструировали
Клеточные методы клонирования ДНК пред-			таким образом, чтобы в нем присутствова-
полагают	последовательное	выполнение	ли сайты узнавания нескольких рестриктаз
ряда операций. Сначала из исследуемой ДНК			(см. рис.). Устойчивость к двум антибиотикам
(ДНК-мишень) получают набор различных			(в данном случае ампициллину и тетрацикли-
фрагментов (обозначены номерами 1, 2 и 3),			ну) обеспечивает селективные маркеры. Они
разрезав ее, например, с помощью рестрик-			позволяют отличить содержащие рекомби-
тазы (см. с. 82) (1). Фрагменты с короткими			нантные плазмиды клетки от тех, в которых
одноцепочечными концами, полученные после			присутствуют	нерекомбинантные			плазмиды
обработки рестриктазой, лигируют с фраг-			pBR322. Только бактерии с плазмидами, в ко-
ментами ДНК, содержащими сайты начала			торые в области сайта узнавания BamHI встро-
репликации (ori). Это позволяет обеспечить			илась новая ДНК, теряют устойчивость к тетра-
репликацию фрагмента в присутствии мар-			циклину, потому что подходящий ген встроился
кера, например, гена устойчивости к анти-			в ответственный за устойчивость к антибио-
биотику (2). Рекомбинантные молекулы ДНК			тикам сайт (инсерционная дезактивация) (2).
переносят в клетки-хозяева (бактериальные			Клетки, содержащие нерекомбинантные плаз-
или дрожжевые клетки), где их репликация			миды pBR322, сохраняют устойчивость к те-
может проходить независимо от репликации			трациклину. Если для встраивания фрагмента
генома клетки-хозяина (3). Клетки-хозяева,			используют фермент PstI, происходит потеря
в которых подлежащий клонированию фраг-			устойчивости к ампициллину (бактерии стано-
мент встраивается в геном, трансформиру-			вятся чувствительными к нему), а устойчивость
ются (здесь это фрагмент 1, обозначенный			к тетрациклину сохраняется. Таким образом,
коричневым кружком). Обычно клетка-хозяин			используя метод		отпечатков,	содержащие
поглощает только одну чужеродную молеку-			клонируемый фрагмент ДНК рекомбинантные
лу ДНК. Трансформированные рекомбинант-			плазмиды можно отличить от нерекомбинат-
ной (чужеродной) ДНК клетки культивируют,			ных плазмид по изменению устойчивости к ан-
чтобы увеличить их число (выращивание, 4).			тибиотикам. Клонирование с использованием
Селективное выращивание содержащих тре-			бактериальных плазмид стало менее актуаль-
буемый фрагмент ДНК трансформированных			ным, когда появились значительно более круп-
клеток позволяет получить множественные			ные синтетические		дрожжевые	хромосомы,
копии фрагмента (5). В итоге клоны рекомби-			подходящие для клонирования длинных фраг-
нантной ДНК образуют гомогенную популя-			ментов ДНК.
цию (6). Их используют для создания обшир-
ной коллекции клонированных		фрагментов

ДНК, называемой библиотекой клонов (7) (см. следующую страницу). Используемые для клеточного клонирования молекулы ДНК называют векторами. (Рис. из: Strachan and Read, 2011.)

Клонирование ДНК

84	Анализ ДНК
БИБЛИОТЕКИ ДНК			лая мРНК. У эукариот первичный транскрипт
			РНК подвергается сплайсингу и образует
Библиотека ДНК — это случайным обра-			мРНК (2; см. с. 72). кДНК получают из мРНК пу-
зом сформированная		коллекция отдельных	тем обратной транскрипции (3). Последующие
фрагментов ДНК, которые в совокупности			этапы, такие, как встраивание в вектор и ре-
представляют часть генома или весь геном			пликация в бактериях, соответствуют анало-
организма. В ранний период применения тех-			гичным этапам создания геномной библиотеки

нологии рекомбинантных ДНК такие библиоте-			(4). Клонирование и секвенирование кДНК по-
ки были совершенно необходимы. Существуют			зволяют определить аминокислотную после-
библиотеки ДНК двух типов: а) геномные би-			довательность белка. Кроме того, экспрессия
блиотеки и б) библиотеки комплементарных			клонированного гена в бактериальных и дрож-
ДНК (кДНК). Первый тип представляет собой			жевых клетках позволяет получить большое
коллекцию ДНК-клонов, содержащих все уни-			количество белков (протеомная библиотека).
кальные	нуклеотидные	последовательности	В. Скрининг библиотеки ДНК
генома. Необходимо получить значительное
количество клонов, чтобы каждый участок			Чтобы идентифицировать клоны, которые со-
генома был представлен хотя бы один раз.			держат ген, фрагменты гена или другую инте-
Библиотека кДНК — это коллекция кДНК для			ресующую исследователей ДНК, необходимо
всех образующихся в организме молекул ин-			выполнить скрининг. Возможно	применение
формационных РНК (мРНК).			двух различных подходов: а)	обнаружение
A. Геномная библиотека			с помощью олигонуклеотидных зондов, спо-
			собных связываться с исследуемыми по-
Клоны геномной ДНК — это копии фрагментов			следовательностями; б) обнаружение с ис-
ДНК всех хромосом (1). Они содержат кодиру-			пользованием кодируемого искомым геном
ющие и некодирующие последовательности.			белка. Скрининг при помощи олигонуклеотид-
Эндонуклеазы рестрикции разрезают геном-			ных зондов основан на методе гибридизации.
ную ДНК на множество фрагментов. На ри-			Одноцепочечные молекулы ДНК или РНК спец-
сунке представлены схемы четырех участков,			ифично гибридизуются с комплементарными
содержащих два гена, А и Б (2). Фрагменты			одноцепочечными последовательностями (см.
с генами и окружающей их ДНК встраивают			с. 64). Для этого колонии культивированных
в генноинженерный вектор, например в ДНК			бактерий (1), часть из которых поглотила ре-
фага, и клонируют, используя бактериальные			комбинантный вектор, переносят на фильтро-
или дрожжевые клетки. У эукариот геномная			вальную бумагу или мембрану (2), лизируют
библиотека (3) может содержать от сотен			(3), а их ДНК подвергают денатурации (раз-
тысяч до более чем миллион отдельных ДНК-			деляют на нити). Меченые комплементарные
клонов. Чтобы обнаружить определенный ген,			одноцепочечные ДНК или РНК	используют
необходимо провести скрининг (см. раздел Б).			в качестве зондов. Зонды гибридизуются толь-
Б. Библиотека кДНК			ко с нужной колонией (4). После гибридизации
			на мембране появляется сигнал (5) в месте,
Библиотека кДНК состоит только из кодирую-			где расположена ДНК, комплементарная ме-
щих последовательностей ДНК, поэтому она			ченому зонду; точное местонахождение в куль-
меньше геномной библиотеки. Для ее созда-			туре можно определить по положению сигнала
ния обычно используют целую РНК из опре-			на мембране (5). Из соответствующего участка
деленных тканей или соответствующую опре-			культуры отбирают образец (6). Содержащие
деленной	стадии эмбриогенеза. Сложность		вектор культивированные бактерии выращи-
состоит в том, что мРНК может быть получена			вают на среде с агар-агаром в чашке Петри,
только из тех клеток, в которых происходит			чтобы получить множественные копии (клоны)
транскрипция соответствующего гена, т. е.			требуемых фрагментов ДНК.
в которых идет синтез мРНК (1). В отличие
от геномной библиотеки, которая является
полной и включает как кодирующие, так и не-
кодирующие ДНК, библиотека кДНК содержит
только кодирующие ДНК. Такая специфичность

дает большое преимущество по сравнению с геномной ДНК, но для создания библиотеки кДНК необходимо, чтобы была доступна зре-

Библиотеки ДНК

86	Анализ ДНК

САУЗЕРН-БЛОТ (САУЗЕРНГИБРИДИЗАЦИЯ)

Саузерн-гибридизация — это высокочувствительный метод обнаружения одного или нескольких специфичных фрагментов ДНК в сложной, полученной случайным образом смеси с другими фрагментами ДНК. Он был был разработан в 1975 г. и назван в честь Э. М. Саузерна. Похожий метод анализа РНК называют Нозерн-блот (игра слов SouthernNorthern). Метод иммуноблоттинга (Вестернблот) предназначен для обнаружения белков с помощью антител. Поскольку каждая эндонуклеаза ректрикции разрезает ДНК только там, где присутствует специфическая последовательность узнавания, сайты узнавания распределены неравномерно и фрагменты ДНК различаются по размеру. Сейчас этот метод применяют редко.

A.Саузерн-блот

ДНК выделяют из лейкоцитов крови или других клеток (1), изолируют и расщепляют при помощи рестриктазы (2). Фрагменты сортируют по размеру в геле (обычно агарозном) в электрическом поле, используя электрофорез (3). Наиболее мелкие фрагменты мигрируют быстрее всех в направлении от катода к аноду, а самые крупные фрагменты мигрируют очень медленно. Затем приступают к блоттингу: содержащиеся в геле фрагменты переносят на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану (4). ДНК денатурируют (разделяют на нити) щелочью, затем фиксируют на мембране умеренным нагреванием (80 °C) или методом кросслинкинга под воздействием УФ-излучения. Образец инкубируют с зондом из одноцепочечной ДНК (геномная ДНК или кДНК), комплементарным фрагменту исследуемого гена (5). Зонд гибридизуется только с комплементарным фрагментом. Если зонд снабжен радиоактивной меткой, то на рентгеновской пленке, положенной на мембрану, отображается только сигнал исследуемого фрагмента. Здесь он выглядит как черная полоса, появившаяся на пленке после проявки (авторадиограмма) (6).

Б. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

Различия отдельных последовательностей ДНК приводят к различиям в расположении сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции. Это следует из разницы в размерах фраг-

ментов ДНК, полученных методом Саузернгибридизации (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, ПДРФ). Метод ПДРФ дает хорошие результаты в тех случаях, когда различия в генетическом коде приводят к возникновению или исчезновению сайтов узнавания рестриктаз. Если возникает дополнительный сайт, во время Саузерн-гибридизации появляется два фрагмента размером меньше обычных. Если сайт исчезает, вместо двух небольших фрагментов появляется один более крупный фрагмент.

На рисунке представлена последовательность ДНК длиной 5 тпн. Слева (аллель 1) в центре фрагмента можно увидеть полиморфный сайт узнавания рестриктазы, которого нет у аллеля 2 (рисунок справа).

Саузерн-гибридизация позволяет отличить один аллель от другого. На рисунке слева эндонуклеаза рестрикции разрезает последовательность длиной 5 тпн на два фрагмента. Содержащий сайт зонд гибридизуется с обоими фрагментами — длиной 3 тпн и длиной 2 тпн. На рисунке слева представлен образовавшийся в результате гибридизации единый фрагмент длиной 5 тпн. Таким способом можно обнаружить три варианта генотипа: а) две копии аллеля 1 (гомозигота 1–1); б) один аллель 1 и один аллель 2 (гетерозигота); в) два аллеля 2 (гомозигота 2–2) (определение гомозиготности и гетерозиготности см. на с. 122–130). Указанный метод можно применять для непрямого обнаружения вызывающих заболевания мутаций. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов сам по себе не имеет отношения к мутациям. Он просто позволяет различить фрагменты ДНК разного размера, принадлежащие к одной и той же области. Такие фрагменты можно применять в качестве маркеров для выявления носителей вызывающей заболевание мутации внутри одной семьи.

Медицинская значимость

Саузерн-блот применяют для обнаружения аллелей с вызывающими различные заболевания экспансиями нуклеотидных повторов (см. с. 100, 270–273).

Саузерн-блот (Саузерн-гибридизация)

Б. ОНП, микросателлиты, минисателлиты

На рисунке представлены три распространенных типа полиморфизма ДНК: ОНП, микросателлиты и минисателлиты. Микросателлиты — это вариабельные блоки, содержащие короткие тандемные повторы нуклеотидных последовательностей. Например, повторы СА могут встречаться три раза (5'-CACACA-3'), пять раз (5'-CACACACACA-3'), шесть раз и т. д. Число повторов, например три или четыре, определяет структуру аллеля. Минисателлиты, содержащие переменное число тандемных повторов, состоят из повторяющихся блоков длиной 20–500 пн. Разница в размерах возникает вследствие различий в количестве повторов, что удалось установить благодаря ПЦР. Аллельные варианты с разным количеством тандемно повторяющихся коротких нуклеотидных последовательностей часто встречаются в некодирующих областях ДНК. Их называют короткими тандемичными повторами (см. Геномика).

Каждой полиморфной позиции присвоен уникальный идентификатор, например rs312476 (rs обозначает референсный ОНП, а цифры — уникальный серийный номер). ОНП, представляющий вариацию, например, аденина (А) или гуанина (G), может присутствовать в одном из трех вариантов генотипа, AA, AG или GG, унаследованных от отцовской и материнской хромосом (см. Традиционная генетика). Для обнаружения ОНП можно использовать методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР, см. с. 72), не предполагающие электрофоретического разделения.

A.Однонуклеотидный полиморфизм

Г. CEPH-семьи

Каждый отдельный геном имеет отличную У типичной цепи ДНК изменчивость в наибольот других геномов уникальную нуклеотидную шей степени обусловлена наличием однонупоследовательность ДНК. Если частота встреклеотидного полиморфизма. Минисателлиты чаемости варианта в популяции составляет 1% распределены неравномерно и различаются или более, его называют полиморфизмом ДНК. по плотности. (Рис. из: Cichon et al., 2002.)

В среднем 1 из 300 нуклеотидов полиморфен. Существует три основных типа полиморфизма

ДНК: а) различие в одном нуклеотиде (однонуПаттерны наследования полиморфизма ДНК клеотидный полиморфизм, ОНП); б) короткие лучше всего удалось проследить в семьях, тандемные (простые) повторы (микросател- в которых третье поколение представлено литы); в) тандемные повторы из 10–50 нуклене менее чем восемью детьми. Коллекцию оботидов (минисателлиты). Термин «сателлит» разцов ДНК таких семей удалось создать ценпоявился после обнаружения дополнительных тру Centre d’Еtude du Polymorphisme Humain фракций помимо основного слоя ДНК при гра- (CEPH) в Париже, названному в честь его осдиентном ультрацентрифугировании. нователя Жана Доссе. В центре хранят бес-

смертные клеточные линии для каждой семьи. CEPH-семья состоит из четырех бабушек и дедушек, двух родителей и восьми детей. На схеме представлены паттерны наследования полиморфизма длин рестрикционных фрагментов в такой семье. Четыре присутствующих в данном локусе аллеля, проанализированные методом Саузерн-гибридизации, обозначены A, B, C и D. Начав с бабушек и дедушек, можно проследить, как наследуется каждый аллель. Из четырех бабушек и дедушек трое являются гетерозиготами (AB, CD, BC), а один — гомозиготой (СС). Поскольку родители гетерозиготны по различным аллелям (отец AD и мать ВС), все восемь детей тоже оказались гетерозиготами — BD, AB, AC или CD.

В. Генетическая изменчивость фрагмента длиной 100 000 пн

ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНОМА

		88	Изменчивость ДНК

Изменчивость генома

90	Изменчивость ДНК
ГЕНЫ И МУТАЦИИ			(Gln), а в позиции 177 лейцин (Leu) замещен
			аргинином (Arg). Каждая мутация имеет опре-
Мутация — это термин, предложенный Гуго де			деленную позицию. Аминокислотные замены
Фризом в 1901 г. для обозначения процессов,			зависят от изменений в соответствующих ко-
меняющих структуру и биологическую функ-			донах. В разных молекулах ДНК могут при-
цию генов. Открытие того, что мутации воз-			сутствовать разные мутации в одной позиции
никают также у бактерий и других микроорга-			(одном кодоне). Здесь рассмотрены две раз-
никают также у бактерий и других микроорга-			(одном кодоне). Здесь рассмотрены две раз-
низмов, впоследствии позволило понять связь			личные мутации в позиции 211: глицин (Gly)
между генами и мутациями.			замещен аргинином (Arg) или глутаминовой
Когда удалось обнаружить, что изменения			кислотой (Glu). В норме (дикий тип) кодон 211
(мутации) могут быть не только спонтанными			содержит последовательность GGA и кодирует
(Т. Г. Морган в 1910 г.), но и индуцированны-			глицин. Мутация GGA в AGA делает кодон от-
ми рентгеновским излучением (Г. Дж. Меллер			ветственным за выработку аргинина, а мута-
в 1927 г.), мутационная теория наследствен-			ция в GAA — ответственным за синтез глутами-
ности превратилась в краеугольный камень			новой кислоты.
генетики. Исследование мутаций важно по не-			В. Основные типы мутаций
скольким причинам. Мутации вызывают за-			В. Основные типы мутаций
болевания, в том числе все формы злокаче-			Существует три основных типа мутаций, при
ственных опухолей. Без мутаций формы жизни			которых изменение одного нуклеотида приво-
не могли бы эволюционировать.			дит к появлению отличий от обычного (дикого)
A. Транскрипция и трансляция			типа (точечные мутации): (а) замена (замена
A. Транскрипция и трансляция			одного азотистого основания другим, в ре-
у прокариот и эукариот			зультате которой меняется кодон); (б) делеция
Эффект мутаций может быть разным у одно-			(потеря одного или нескольких оснований); (в)
клеточных		и многоклеточных организмов.	вставка (добавление одного или нескольких
Механизм транскрипции в клетках без ядра,			оснований). Выделяют два типа замен: тран-
таких	как	бактериальные (прокариоты, 1),	зиции (замена одного пуринового или пири-
и в содержащих ядро клетках многоклеточ-			мидинового основания на другое пуриновое
ных организмов (эукариоты, 2) различается.			или пиримидиновое основание) и трансверсии
У прокариот информационная РНК (мРНК)			(замена пуринового основания пиримидино-
сама по себе служит матрицей для трансля-			вым или наоборот). Появление замены может
ции. Соотношение последовательностей ДНК			изменить кодон таким образом, что на этом
и мРНК составляет 1 : 1, указанные последо-			участке появится неправильная аминокислота,
вательности колинеарны. В эукариотических			но рамка считывания не изменится (миссенс-
клетках сначала образуется первичный транс-			мутация). Появление делеции или вставки
крипт РНК. Зрелая мРНК формируется в ре-			приводит к сдвигу рамки считывания (мутация
зультате удаления некодирующих фрагментов			со сдвигом фазы). В этом случае образовав-
из первичного транскрипта до того, как он по-			шаяся последовательность не соответствует
кидает ядро, чтобы стать матрицей для синте-			нормальной последовательности кодонов.
за полипептида (см. процессинг РНК, с. 72).			В результате не происходит синтез функцио-
Б. Мутации возникают			нального продукта гена (нонсенс-мутация).
Б. Мутации возникают
на определенном участке			Г. Разные мутации на одном
Систематический анализ мутаций у микро-			и том же участке
организмов		позволил найти подтверждение	На одном и том же участке могут возникать
тому, что кодирующая ДНК и соответствую-			разные мутации. На рис. Б (позиция 211) гли-
щие ей полипептиды колинеарны. Яновски			цин замещен аргинином или глутаминовой
и его сотрудники (1964) продемонстрировали,			кислотой.
что положение мутации в кодирующем белок
триптофансинтазу А гене Escherichia coli со-
ответствует положению результирующего из-
менения в последовательности аминокислот.
На рисунке представлены мутации в четырех

позициях. В позиции 22 фенилаланин (Phe) замещен лейцином (Leu), в позиции 49 глутаминовая кислота (Glu) замещена глутамином

Гены и мутации

92	Изменчивость ДНК

МУТАЦИИ, СВЯЗАННЫЕ С МОДИФИКАЦИЕЙ АЗОТИСТЫХ ОСНОВАНИЙ

Мутация может возникнуть в результате химического или физического воздействия, приводящего к изменению структуры азотистого основания. Если это событие повлияет на спаривание азотистых оснований, может быть нарушена репликация или транскрипция. Химическое вещество, способное индуцировать такие изменения, называют мутагеном. Мутагены вызывают мутации по-разному. Спонтанное окисление, гидролиз, неконтролируемое метилирование, алкилирование и УФ-облучение приводят к изменениям, на-

рушающим	структуру азотистых		оснований.
Химические	вещества,	взаимодействующие
с ДНК, превращают		азотистые	основания

в другие химические соединения или разрушают их.

A.Дезаминирование иметилирование

Цитозин, аденин и гуанин содержат аминогруппы. В результате удаления таких групп (дезаминирования) образуются модифицированные основания, процесс спаривания которых идет иначе. Обычно удаление аминогруппы является следствием воздействия азотистой кислоты. Спонтанное дезаминирование цитозина происходит с частотой 100 оснований на клетку в день (Alberts et al., 2015).

В рассмотренном примере удалена аминогруппа в позиции 4 (1). В результате образовался урацил (2), который спаривается с аденином вместо гуанина. В норме последствия такого дезаминирования эффективно устраняет урацил-ДНК-гликозилаза. Метилирование атома углерода в позиции 5 цитозина приводит к образованию 5-метилцитозина, содержащего метильную группу в позиции 5 (3). В результате дезаминирования 5-метилцитозина изменяется структура тимина, у него в позиции 4 появляется кислород вместо аминогруппы (4). Метилирование происходит с частотой около 100 азотистых оснований на клетку в день (Alberts et al., 2015). Репарации таких мутаций не происходит, потому что тимин является нормальным основанием. При дезаминировании аденина (5) в позиции 6 образуется гипоксантин, у которого аминогруппу заменяет атом кислорода (6). Гипоксантин спаривается с цитозином вместо тимина, поэтому после репликации в мутантной цепи ДНК появляется цитозин вместо тимина.

Б.Апуринизация

Около 18 000 пуриновых оснований (аденин

игуанин) ежедневно исчезает из ДНК каждой клетки из-за температурных флуктуаций (Alberts et al., 2015). Апуринизация ДНК подразумевает гидролитическое расщепление N-гликозидной связи между дезоксирибозой

иатомом азота в позиции 9 гуанина. В результате образуется апуринизированный сахар. Потеря азотистого основания в отсутствие своевременной репарации приводит к появлению делеции после следующей репликации (см. Репарация ДНК, с. 90).

В. Алкилирование гуанина

Алкилирование гуанина — это реакция с кетогруппой в позиции 6 с образованием 6-метилгуанина. Такое соединение не может образовать водородную связь, поэтому не спаривается с цитозином, а образует пару с тимином. Таким образом, после следующей репликации в мутантной дочерней молекуле исходный цитозин (С) замещается тимином

(Т). Образовавшаяся двухцепочечная молекула содержит аномальную пару GT вместо GC. Важными алкилирующими агентами являются этилнитрозомочевина, этилметансульфонат, диметилнитрозамин и N-метил-N-нитро-N- нитрозогуанидин.

Г. Аналоги азотистых оснований

Аналоги азотистых оснований — это пурины и пиримидины, которые по своим свойствам похожи на нормальные азотистые основания ДНК и поэтому могут встроиться в новую цепь при репликации. 5-Бромдезоксиуридин — аналог тимина. Он содержит атом брома вместо метильной группы в позиции 5. Такое соединение может встраиваться в новую цепь ДНК при репликации, однако присутствие атома брома зачастую приводит к неправильному спариванию оснований.

Д.Тиминовые димеры, индуцированные УФ-облучением

УФ-облучение с длиной волны 260 нм приводит к образованию ковалентных связей между атомами углерода в позициях 5 и 6 соседних тиминов. Если это случается внутри гена, то в отсутствие репарации мешает нормальной репликации и транскрипции.

Мутации, связанные с модификацией азотистых оснований

94	Изменчивость ДНК
МУТАЦИИ, ВОЗНИКАЮЩИЕ				с их функциональными последствиями (мо-
В РЕЗУЛЬТАТЕ ОШИБОК				лекулярная патология). Основная задача ис-
РЕПЛИКАЦИИ				следователя — понять связь между генотипом
РЕПЛИКАЦИИ				и фенотипом. Это называют соотношением ге-
				и фенотипом. Это называют соотношением ге-
				нотип-фенотип (часто применяют некоррект-
Во время репликации часто возникают ошиб-				ный термин «корреляция»). Преобладающий
ки. В отсутствие репарации они могут при-				вариант — это мутации, приводящие к потере
ки. В отсутствие репарации они могут при-				вариант — это мутации, приводящие к потере
вести к появлению различных типов мутаций.				функции нормального аллеля, когда продукт
Ошибки репликации возникают с частотой око-				гена вырабатывается в недостаточном коли-
ло 1 : 105. Системы репарации (см. следующую				честве или не выполняет свою функцию. Если
страницу) уменьшают частоту таких ошибок				для нормального функционирования необ-
до 1 : 107 или 1 : 109. Важным механизмом яв-				ходимы оба аллеля, но один инактивируется
ляется сдвиг рамки считывания при реплика-				из-за мутации, возникает гаплонедостаточ-
ции в областях с повторяющимися нуклеотид-				ность. Противоположный тип — это мутация,
ными последовательностями.				при которой образуется новый продукт гена,
A. Последствия ошибок репликации				выполняющий нежелательную функцию. Этот
A. Последствия ошибок репликации				эффект называют доминантно-негативным.
Если ошибка репликации происходит перед				Чрезмерная экспрессия продукта нормально-
следующим делением клетки,			она может,	го гена, вызывающая нежелательный эффект,
к примеру, привести к замене аденина (А)				возникает из-за мутаций усиления функции.
на цитозин (С) в пятой нуклеотидной паре (см.				Эпигенетические изменения вызваны иными
рис.). Если ошибка останется незамеченной,				причинами, нежели изменение последова-
при следующем (втором) делении появится				тельности ДНК. Причиной динамических му-
мутантная молекула ДНК, содержащая пару				таций являются аномальные экспансии азоти-
CG вместо пары АТ в этой позиции (голубое				стых повторов (см. с. 100).
поле). Такая мутация будет передана всем до-				Медицинская значимость
черним клеткам.				Медицинская значимость
Б. Сдвиг рамки считывания				Мутации вызывают более 3000 (на сегодняш-
Б. Сдвиг рамки считывания				ний день 7000. — Прим. ред.) различных за-
Многие типы мутаций не связаны с измене-				болеваний (см. OMIM). Микросателлитная
нием отдельных нуклеотидов, они являются				нестабильность служит причиной наслед-
результатом неправильного выравнивания ал-				ственного неполипозного рака толстой киш-
лельных и неаллельных последовательностей				ки (HNPCC). HNPCC — это генетически гете-
ДНК при репликации. Если матрица содержит				рогенная группа заболеваний, вызываемых
короткие тандемные повторы, например по-				мутациями не менее чем семи генов (OMIM
вторы CA в виде микросателлитов (см. главу				120435, 614331). Примерно в 15% случаев
о полиморфизме ДНК), то вновь образовав-				при карциномах толстой кишки, желудка и эн-
шаяся и матричная цепи могут сместиться от-				дометрия имеет место микросателлитная не-
носительно друг друга (микросателлитная не-				стабильность. Необходимо различать сдвиг
стабильность). При сдвиге (проскальзывании)				рамки считывания и кроссинговер при мейозе.
полимеразы, приводящем к		неправильному		Последний возникает в результате рекомбина-
спариванию повторов, некоторые повторы ко-				ции соседних последовательностей гомоло-
пируются дважды, а некоторые не копируются				гичных хромосом.
вообще в зависимости от направления сдвига.
Таким образом, можно выделить сдвиги рамки
считывания вперед и назад относительно ре-
плицируемой цепи. Сдвиг рамки считывания
новой цепи назад приводит к появлению ну-
клеотидных вставок. В результате сдвига рам-
ки считывания вперед в новой цепи ДНК воз-
никают делеции (потеря нуклеотидов).
В. Функциональные
последствия мутаций
Помимо	молекулярной структуры, мутации
можно	классифицировать	в	соответствии

Мутации, возникающие в результате ошибок репликации

96	Обработка ДНК
РЕПАРАЦИЯ ДНК			с особыми димерными белками 80 и 90 кДа
			(Ku80 и Ku90). Другие репарационные белки
Повреждения ДНК		могут быть распознаны	образуют репарационный комплекс (комплекс
и устранены благодаря существованию раз-			Artemis, состоящий из рекомбинантного бел-
личных механизмов репарации ДНК, направ-			ка V (D) J, мутантная форма которого присут-
ленных на устранение определенных типов			ствует у людей с тяжелым комбинированным
повреждений и предполагающих участие боль-			иммунодефицитом, ДНК-зависимой проте-
шого количества белков. Три основных типа			инкиназы и кофактора XRCC4), а также белка,
репарации: а) эксцизионная репарация; б) ре-			связывающего р53 (см. с. 334). Данный меха-

парация неправильно спаренных нуклеотидов;			низм репарации допускает потерю или добав-

в) репарация разрывов двухцепочечной ДНК.			ление нуклеотидов.
Кроме того, существует репарация разрывов			Г.Репарация засчет
ДНК.
A.Эксцизионная репарация			гомологичной рекомбинации
			Гомологичная рекомбинация	обеспечивает
Данный	механизм	обеспечивает удаление	устранение двухцепочечных разрывов с помо-
из поврежденной цепи 27–29 нуклеотидов			щью нескольких репарационных белков: ATM,
(около 12–13 у прокариот). Механизм рас-			BRCA1, BRCA2, RAD51 и др., например бел-
познает поврежденную цепь ДНК, например			ков анемии Фанкони (см. с. 340). Активация
ту, в которой присутствуют тиминовые диме-			ATM присходит в ответ на повреждение ДНК
ры, образовавшиеся из-за УФ-облучения. Три			(1). Она, в свою очередь, вызывает актива-
белка, XPA, XPB и XPC у человека (UvrA, UvrB			цию BRCA1 путем фосфорилирования (2).
и UvrC у прокариот), находят поврежденный			Фосфорилирование BRCA1 индуцирует гомо-
участок и формируют репарационный белко-			логичную рекомбинацию совместно с BRCA2
вый комплекс. Эндонуклеазы XPC и XPG раз-			и RAD51, представляющим собой встреча-
резают поврежденную цепь в двух местах.			ющийся у млекопитающих гомолог репа-
Синтез ДНК с участием поли(АДФ-рибоза)-			рационного белка RecA Escherichia coli (3).
полимеразы 1 обеспечивает восстановление			Фосфорилированный белок	BRCA1 также
поврежденного участка, а ДНК-лигаза устра-			принимает участие в транскрипции и свя-
няет разрыв цепи.			занной с транскрипцией репарации ДНК (4).
Б. Репарация неправильно			Идентичная сестринская хроматида использу-
			ется для выравнивания поврежденных концов
спаренных нуклеотидов			и восстановления утраченной информации.
Репарация неправильно спаренных нуклеоти-			Медицинская значимость
дов — механизм, запуск которого происходит
в области разрыва, расположенного на рас-			В результате мутаций генов, кодирующих ре-
стоянии 100–1000 азотистых оснований от не-			парационные белки, возникают три важные
правильно спаренных нуклеотидов. Данный			гетерогенные группы заболеваний, связанных
механизм исправляет ошибки репликации (см.			с нарушением эксцизионной репарации, и за-
предыдущую страницу). Наиболее важными			болеваний, повышающих риск развития зло-
белками, принимающими участие в репарации			качественных опухолей (см. с. 348). Это раз-
неправильно спаренных нуклеотидов у чело-			личные типы пигментной ксеродермы (OMIM
века, являются MSH1, MSH2, MSH3 и MSH6,			278700–278780), синдром Коккейна типов А
MLH1 (гомологичен MutH, MutL и MutS у бакте-			и В (OMIM 216400, 133540), а также триходи-
рий) и PMS2 (постмейотическая сегрегация 2).			строфия (OMIM 601675).
MSH2 и MLH1 связываются с неправильно
спаренными нуклеотидами, а остальные белки
разрезают ДНК и удаляют дефектный фраг-
мент. ДНК-полимераза III обеспечивает замену
фрагмента поврежденной цепи.

В. Негомологичное соединение концов

При репарации двухцепочечной ДНК происходит соединение двух концов ДНК, расположенных по краям разрыва. Концы связываются

Репарация ДНК

98 Обработка ДНК

ТРАНСПОЗИЦИЯ					В.Транспозиция ретроэлементов
					Транспозицию используют РНК-вирусы (РНК-
Транспозиция — это способность некоторых					ретровирусы), чтобы встраиваться в ДНК ге-
фрагментов ДНК перемещаться с одного ме-					нома хозяина (ретротранспозиция) за счет
ста на другое; в совокупности такие фрагменты					обратной транскрипции из РНК в ДНК (фер-
называют транспозонами (Tn) или мобильны-					мент обратная транскриптаза). Для этого не-
ми генетическими элементами. Впервые такие					обходим синтез РНК-копии встраиваемого ре-
элементы были описаны Барбарой Макклинток					троэлемента. Ретровирусы, в том числе вирус
в 1951 г. Специфичный фермент транспоза-					иммунодефицита человека (ВИЧ) и опухоле-

за, кодируемый транспозоном, обеспечивает					вые РНК-вирусы, представляют собой важные

встраивание элемента в новый участок ДНК.					ретроэлементы. На первом этапе при ретро-
В этом разделе рассмотрены три примера раз-					транспозиции происходит синтез РНК-копии
личных типов транспозонов. Транспозоны —					ретроэлемента	с последующей обратной
одна из основных причин генетической измен-					транскрипцией вплоть до последовательности
чивости. Они играют важную роль в эволюции					полиаденилирования в длинном 3'-концевом
геномов.					повторе (LTR). На рисунке представлены три
А.Инсерционные последовательности					важных класса транспозонов млекопитаю-
					щих, которые подвергаются или подвергались
(IS) и транспозоны (Tn)					ретротранспозиции через РНК-посредника.
ДНК-хозяин содержит сайт-мишень из при-					Эндогенные ретровирусы (1) — это последо-
мерно 4–10 пн (1). Выбор сайта-мишени мо-					вательности,	напоминающие ретровирусы,
жет быть как случайным, так и направленным.					но не способные инфицировать новые клетки
Инсерционная последовательность (IS) со-					и ограничивающиеся одним геномом. У не-
стоит из 700–1500 пн в зависимости от типа.					вирусных ретротранспозонов (2) отсутствуют
Ген	транспозазы	кодирует		ответственный	длинные концевые повторы и иногда другие
за транспозицию фермент. Его фланкируют					структурные элементы ретровирусов. Оба
инвертированные повторы длиной около 9 пн.					типа содержат обратную транскриптазу, по-
Это	характерная	особенность		транспозиции	этому обладают способностью к независимой
с участием инсерционных последователь-					транспозиции. В процессированных псевдо-
ностей. Инсерционная			последовательность		генах (3) и ретропсевдогенах отсутствует об-
встраивается в сайт-мишень благодаря ак-					ратная транскриптаза, поэтому независимая
тивности транспозазы (2). Транспозоны (Tn)					транспозиция невозможна. Указанные эле-
могут содержать и другие гены, например					менты делят на две группы: а) процессирован-
гены устойчивости к антибиотикам, а также					ные псевдогены с малым количеством повто-
прямые (3) или инвертированные (4) повторы					ров, транскрибируемые РНК-полимеразой II;
на концах. Прямые повторы — это ориенти-					б) последовательности млекопитающих SINE
рованные в одном направлении идентичные					с большим количеством повторов, такие как
(или	очень похожие)		последовательности.		семейство Alu-повторов у человека и семей-
Инвертированные повторы развернуты в про-					ство B1-повторов у мышей. Считается, что
тивоположных направлениях.					одна из 600 мутаций возникает из-за ретро-
Б. Репликативная и нерепликативная					транспозиции.

транспозиции					Медицинская значимость
При репликативной транспозиции (1) донор-					Транспозиция может стать причиной структур-
ский траспозон остается на месте и создает					ных изменений генов, вызывая заболевания.
новую копию самого себя, после чего эта копия

встраивается в новое место последовательности реципиента. Данный механизм приводит к увеличению числа копий транспозона в геноме. Репликативная траспозиция предполагает использование двух ферментов — транспозазы, действующей на концах исходного транспозона, и ресольвазы, действующей на копии транспозона. При нерепликативной транспозиции (2) мобильный генетический элемент сам перемещается в другой участок генома.

Транспозиция 99

100	Обработка ДНК
ЭКСПАНСИЯ ТРИНУКЛЕОТИДНЫХ		фицируют в соответствии с типами тринуклео-
ПОВТОРОВ		тидных повторов (последовательности из трех
		нуклеотидов, расположение относительно
		гена, клинические проявления). Указанные за-
Возможна аномальная экспансия (рост числа)		болевания всегда сопровождаются поражени-
нуклеотидных повторов, вызывающая большое		ем центральной или периферической нервной
количество различных заболеваний, в первую		системы. Тринуклеотидные заболевания 1-го
очередь заболеваний нервной системы. Такие		типа связаны с возникновением экспансий
экспансии составляют новый класс мутаций,		тринуклеотидных повторов CAG в кодирующих

открытый в 1991 г. Они представляют собой па-		областях различных генов. Кодирующий глута-

тогенные варианты микросателлитов, которые		мин триплет CAG обычно присутствует в виде
могут становиться нестабильными (нестабиль-		20 повторов. Поэтому продукт гена содержит
ные мутации). В геноме человека присутствует		около 20 глутаминовых остатков. К появлению
множество коротких тандемных повторов, со-		заболевания приводит значительное увели-
стоящих из трех (тринуклеотиды, или трипле-		чение числа глутаминовых остатков в белке.
ты) или более нуклеотидов. При аномальной		По этой причине заболевания этой группы в со-
экспансии, как в пределах определенных ге-		вокупности называют полиглутаминовыми за-
нов, так и вне их, нарушается экспрессия генов		болеваниями.
(нарушения, связанные с экспансией трину-		Тринуклеотидные заболевания 2-го типа свя-
клеотидных повторов). Как правило, триплеты		заны с возникновением экспансий тринукле-
встречаются в группах из 5–35 повторов, од-		отидных повторов CTG, GAA, GCC или CGG
нако число повторов может меняться в зависи-		в некодирующей части 5'-нетранслируемой
мости от расположения в геноме. Обычно они		области (нетранслируемой области экзона
стабильны, но иногда становятся нестабильны-		1 [CGG при синдроме ломкой X-хромосомы
ми и образуют фрагменты аномальной длины.		типа A, FRAXA]), в 3'-нетранслируемой обла-
При отклонении от нормальной длины число		сти (CGG при синдроме ломкой X-хромосомы
повторов имеет тенденцию увеличиваться при		FRAXE; CTG при миотонической дистрофии)
передаче из поколения в поколение. Это при-		или нетранслируемой области интрона (GAA
водит к более раннему появлению симптомов		при атаксии Фридрейха). Краткий обзор забо-
заболевания у последующих поколений. Такое		леваний этой группы см. на с. 380.
явление называют антиципацией.		В. Лабораторная диагностика
A. Различные типы экспансии
		При	лабораторной диагностике проводят
тринуклеотидных повторов		сравнение размеров участков с тринуклео-
Тринуклеотидные повторы можно классифи-		тидными повторами двух аллелей гена мето-
цировать в соответствии с их расположени-		дом Саузерн-гибридизации (см. с. 86). На ри-
ем по отношению к гену. Очень длинные экс-		сунке представлены 11 дорожек, которые
пансии возникают в интронах (1). Увеличение		соответствуют разным пациентам: контроль-
числа повторов может быть лавинообразным,		ной группе (дорожки 1–3) и пациентам с хо-
до 1000 или более. Первые шаги экспансии		реей Хантингтона (дорожки 4–7 и 10). Членам
обычно не приводят к появлению симптомов		семьи соответствуют дорожки 7–11: больной
заболевания, однако создают предпосылки		отец (дорожка 7), больной сын (дорожка 10),
к наращиванию экспансии повторов у потом-		здоровая мать (дорожка 11) и двое здоровых
ства носителя (премутация). В кодирующих		детей: сын (дорожка 8) и дочь (дорожка 9).
областях, экзонах, экспансии более умерен-		Размер маркеров указан слева. Каждая до-
ные (2). Однако они оказывают сильнейшее		рожка воспроизводит миграцию амплифици-
влияние на организм, которое становится оче-		рованного методом ПЦР повтора CAG локуса
видным при определенных тяжелых неврологи-		хореи Хантингтона в полиакриламидном геле
ческих заболеваниях, поскольку в результате		при	электрофоретическом разделении. Для
экспансии зачастую появляется большое коли-		каждого из пациентов на рисунке приведены
чество кодирующих глутамин тринуклеотидов		два аллеля. У пациентов с заболеванием по-
(CAG).		лоса, соответствующая аномальному аллелю,
Б. Заболевания		расположена выше порога области экспансии
		(в реальности на практике полосы могут быть
Заболевания, вызванные патологической экс-		размытыми, поскольку размеры участков с по-
пансией	тринуклеотидных повторов, класси-	вторами в ДНК разных клеток различаются).

Экспансия тринуклеотидных повторов

101

102	Эукариотические клетки
МЕЖКЛЕТОЧНАЯ КОММУНИКАЦИЯ						руемая молекула выходит во внеклеточное
						пространство. Она воздействует на располо-
Многоклеточные			организмы		используют	женные поблизости клетки на коротком рас-
сложные		механизмы,		благодаря которым		стоянии. Так действуют многие факторы роста
клетки взаимодействуют друг с другом.						и дифференцировки. Медиаторами передачи
Взаимодействие клеток обеспечивает множе-						некоторых сигналов на большом расстоя-
ство разнообразных внеклеточных сигнальных						нии служат содержащиеся в крови гормоны
белков,	выполняющих			функцию медиаторов		(3, эндокринная сигнализация). При таком
специфичных внутриклеточных ответов, в том						типе передачи информации специализиро-
числе и на большом расстоянии. Среди таких						ванные клетки, называемые эндокринными
белков	внеклеточные			сигнальные	молекулы,	клетками, секретируют вещество — гормон,
поверхностные мембранные рецепторы, вну-						поступающее в кровь. Оно может достичь кле-
поверхностные мембранные рецепторы, вну-						поступающее в кровь. Оно может достичь кле-
триклеточные рецепторы и внутриклеточные						ток-мишеней, расположенных в отдалении,
сигнальные молекулы, обеспечивающие пере-						например в другой части тела. Нервные или
дачу сигналов. Указанные сигналы регулируют						мышечные клетки используют синаптическую
рост (в том числе эмбриональное развитие),						передачу сигнала (4). Специализированная
клеточную дифференцировку в один из 200						клетка (нервная клетка, или нейрон) пере-
различных типов клеток, клеточный цикл и дру-						дает электрический импульс через отросток
гие клеточные функции.						клетки — аксон, который может быть доволь-
A. Механизм передачи						но длинным. На конце аксона секретируется
A. Механизм передачи						сигнальная молекула, называемая нейро-
сигнала (трансдукция)						трансмиттером, и передается через соедине-
Получение		сигнала вызывает специфичный				ние (синапс) от испускающей сигнал нервной
ответ клетки. Мембранный рецептор клетки,						клетки (нейрона) к постсинаптической клетке-
состоящий из внеклеточной и внутриклеточ-						мишени. В некоторых случаях паракринный,
ной частей (доменов), обеспечивает ее ответ						эндокринный и синаптический типы передачи
на сигнальную молекулу. Специфичность отве-						сигнала используют одни и те же типы сиг-
та обусловлена связыванием конкретной сиг-						нальных молекул. (Рис. из: Lodish et al., 2016.)
нальной молекулы (лиганда) с внеклеточным						Термин «гормон» произошел от греческо-
доменом мембранного рецептора. Это связы-						го слова «гормон», означающего «двигаю»,
вание, в свою очередь, запускает последова-						«побуждаю». Впервые он был использован
тельную передачу сигнала другими сигналь-						в 1904 г. У. Бейлиссом и Э. Старлингом для
ными белками. Каждый активированный белок						описания функции секретируемой молеку-
активирует следущий белок посредством хи-						лы. Можно выделить пять основных классов
мической реакции, запуская сигнальный ка-						гормонов: а) производные аминокислот (на-
скад. На рисунке представлены лишь два бел-						пример, катехоламин, дофамин, тироксин);
ка (сигнальные белки 1 и 2), однако во многих						б) короткие нейропептиды (например, тирео-
случаях в процесс проведения сигнала вовле-						либерин, соматостатин, вазопрессин); в) бел-
чено намного большее их число. В конце кон-						ки (например, инсулин, лютеинизирующий
цов сигнал достигает белка-мишени и вызыва-						гормон); г) стероидные гормоны, являющи-
ет требуемый клеточный ответ. Внеклеточные						еся производными холестерола (например,
сигнальные молекулы обычно работают при						кортизол, половые гормоны); д) производные
очень низкой концентрации, около 10–8 Моль.						витаминов (например, ретиноиды (витамин A),
Б. Типы клеточной сигнализации						пептидные гормоны роста).
Б. Типы клеточной сигнализации						Медицинская значимость
Существует несколько типов клеточных сигна-						Медицинская значимость
лов. Часто они формируют сигнальный путь,						Мутации в генах, кодирующих белки, необхо-
обеспечивающий передачу сигнала на мишень						димые для передачи сигнала, вызывают широ-
через	несколько		посредников.		Сигнальная	кий спектр различных генетических заболева-
молекула при взаимодействии с клеткой-ми-						ний человека.
шенью может оставаться связанной с поверх-
ностью подающей сигнал клетки (1, контактная
передача сигнала). Такой тип сигнализации
обычно участвует в эмбриональном развитии

и используется клетками иммунной системы. При паракринной сигнализации (2) секрети-

Межклеточная коммуникация

103

104 Эукариотические клетки

ГАПЛОИДНЫЕ И ДИПЛОИДНЫЕ ДРОЖЖЕВЫЕ КЛЕТКИ

Почкующиеся дрожжи (пекарские дрожжи

Saccharomyces cerevisiae) — это модельный организм, широко используемый в генетических исследованиях. Дрожжи легко выращивать и обрабатывать. Они способны образовывать клетки различных типов: две гаплоидные и одну диплоидную. Дрожжи — это одноклеточный эукариотический гриб. Внутри дрожжевой клетки находятся органеллы: ядро, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, митохондрии, пероксисомы и вакуоль, аналогичная лизосоме. Известно около 1500 различных видов дрожжей. У пекарских дрожжей овальные клетки диаметром около 5 мкм. При наличии достаточного количества питательных веществ клетка может делиться почкованием каждые 90 мин. Делящиеся дрожжи

Schizosaccharomyces pombe имеют палочкообразные клетки, которые, удлиняясь, делятся пополам, сохраняя свою форму. Гаплоидный геном S. cerevisiae содержит примерно 6200 генов в 1,4 107 пн ДНК, распределенных по 16 хромосомам (Goffeau et al., 1996). Гены отвечают за ряд функций: клеточная структура — 250 генов (4%), метаболизм ДНК — 175 генов (3%), транскрипция и трансляция — 750 генов (13%), производство и хранение энергии — 175 генов (3%), биохимический метаболизм — 650 генов (11%), транспортная функция — 250 генов (4%). Геном S. cerevisiae очень компактный по сравнению с другими эукариотическими геномами, с одним геном на каждые 2 тпн. Аминокислотные последовательности примерно половины человеческих белков, дефекты которых связаны с наследственными заболеваниями, имеют сходство с аминокислотными последовательностями дрожжевых белков.

A. Жизненный цикл дрожжей

Жизненный цикл дрожжей состоит из гаплоидной и диплоидной фаз. Гаплоидные клетки противоположных типов могут сливаться (конъюгировать), образуя диплоидную клетку. Гаплоидные клетки демонстрируют один из двух возможных типов спаривания, называемых a и α. За спаривание отвечает короткий секретируемый полипептид, называемый феромоном или половым фактором. Поверхностный рецептор клетки распознает секретируемый клетками противоположного типа половой фактор. Рецепторы а-клеток свя-

зываются только с α-фактором, а рецепторы α-клеток — только с а-фактором. Конъюгация и последующие митотические деления происходят в благоприятных для роста условиях. В условиях недостатка питательных веществ диплодная дрожжевая клетка претерпевает мейотическое деление и образует четыре гаплоидные споры — две споры типа а и две споры типа α.

Б. Переключение типа спаривания

Переключение типа спаривания инициирует двухцепочечный разрыв ДНК в локусе МАТ (реципиент) и может предполагать связывание с фланкирующим донорским локусом (HMR или HML). Медиатором является эндонуклеаза НО, обеспечивающая сайт-специфичное расщепление ДНК.

В. Кассетная модель переключения типа спаривания

Переключение типа спаривания регулируют три локуса, расположенные поблизости от центромеры хромосомы III S. cerevisiae. Центральный локус, или МАТ (mating-type locus), фланкируют локусы HMLα (слева)

иHMRa (справа). Активен и транскрибируется в мРНК только локус МАТ. Факторы транскрип-

ции регулируют другие гены, ответственные за фенотип a или α. Локусы HMLα и HMRa на-

ходятся в неактивном состоянии (сайленсинг). Последовательности ДНК локусов HMLα

иHMLa переносятся в локус МАТ однократно при образовании каждой новой клетки благодаря специфической рекомбинации (конвер-

сия генов). Присутствие последовательностей HMRα в локусе МАТ определяет фенотип клет-

ки. Если происходит перенос последовательностей HMRα (переключение на α-кассету), фенотип переключается на α. Подавление активности гена можно наблюдать в том случае, если он располагается рядом с ослабляющим его действие генетическим элементом.

Гаплоидные и диплоидные дрожжевые клетки

105

106 Эукариотические клетки

РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

Деление клеток приводит к появлению двух идентичных дочерних клеток, содержащих одинаковые наборы хромосом. Клеточный цикл, как установили Говард и Пелк в 1953 г., состоит из двух основных фаз — интерфазы и митоза. Сложный набор регуляторных макромолекул обеспечивает переход клетки из одной фазы цикла в другой. Регуляторные системы могут обнаруживать и устранять ошибки, а также дефектные клетки.

A. Дрожжевые клетки

Все клетки эукариот имеют одинаковый клеточный цикл и схожие системы его регуляции. Генетические исследования на дрожжевых клетках позволили получить важную информацию о регуляции клеточного цикла. Почкующиеся дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) и делящиеся дрожжи (Schizosaccharomyces pombe) используют механизмы регуляции клеточного цикла, аналогичные регуляторным механизмам высших эукариот.

Б. Дрожжевые модели клеточного цикла

Митотическое деление почкующихся дрожжей (пекарские дрожжи) приводит к появлению одной большой и одной маленькой дочерних клеток. Поскольку веретено митоза из микротрубочек формируется очень рано в S-фазе, фаза G2 практически отсутствует (1). У делящихся дрожжей (S. pombe) все наоборот: веретено митоза формируется в конце фазы G2, после чего клетка делится, образуя две дочерние клетки одинакового размера (2). В отличие от клеток позвоночных, у дрожжей во время митоза оболочка ядра остается неповрежденной. Важным регулятором деления дрожжевых клеток служит белок cdc2 (cell division cycle 2). Отсутствие активности cdc2 (мутантный cdc2) у S. pombe приводит к остановке цикла и препятствует митозу (3). В результате образуется слишком большая клетка, у которой только одно ядро. Повышение активности cdc2 (доминантная мутация cdcD) приводит к преждевременному входу в митоз с образованием слишком мелких клеток (фенотип wee — от шотл. «маленький»).

В. Системы регуляции клеточного цикла

Клеточный цикл состоит из четырех фаз: M, G1, S и G2. За фазой M (митоз) следует фаза G1 (gap1), в фазе S происходит синтез ДНК.

После завершения синтеза ДНК клетка входит

вфазу G2. Фазы G1, S и G2 составляют интерфазу. Несколько различных белков и факторов роста инициируют деление клетки. Другие системы обнаруживают повреждения ДНК или клетки и запускают различные репаративные механизмы (см. с. 96). Клетки эукариот проходят клеточный цикл благодаря регуляторным молекулам, которые представляют собой набор взаимодействующих белков, называемых циклин-зависимыми киназами. Важный представитель этого семейства белков — белок cdc2 (известный также как Cdk1). Остановку клеточного цикла инициируют многие белки, активируемые в результате повреждения ДНК. Белок р53 (см. с. 334) играет ведущую роль

вобнаружении повреждений ДНК и последующей остановке клеточного цикла.

В начале фазы G1 белок cdc2 неактивен. Его активация происходит в конце фазы G1 благодаря действию циклинов, например циклина Е. После того как клетка проходит контрольную

точку G1, циклин Е расщепляется и клетка входит в фазу S. Помимо других механизмов, это происходит за счет связывания циклина А с Cdk2 и фосфорилирования белка ретинобластомы (RB) (см. с. 342). Клетка может преодолеть контрольную точку митоза в том случае, если в ней отсутствуют повреждения. Связывание белка Cdc2 (Cdk1) с митотическими циклинами А и В приводит к формированию и активации комплекса стимуляции митоза. Во время митоза циклины А и В расщепляются, образуется комплекс стимуляции анафазы (не представлен на рисунке). После завершения митоза происходит инактивация белка cdc2 дрожжевым ингибитором S-фазы Sic1. В то же время идет дефосфорилирование белка RB. Клетки могут перейти в следующую фазу клеточного цикла только в том случае, если регуляторные системы обеспечат целостность генома.

Медицинская значимость

Мутации любого из многих контролирующих клеточный цикл генов могут приводить к развитию различных форм рака.

Регуляция клеточного цикла

107

108	Эукариотические клетки
ДЕЛЕНИЕ КЛЕТКИ: МИТОЗ		называют теломерами. Точку прикрепления
		к нитям веретена деления называют кинето-
Митоз — это процесс деления клетки. Термин		хором.
предложенный в 1882 г. У. Флемингом, произо-		В. Роль конденсинов
шел от греч. μíτoς (mitos) — нить. Нитевидные		В. Роль конденсинов
структуры в делящихся клетках были впервые		Постепенное сжатие хромосом при входе
обнаружены Флемингом в 1879 г. В 1884 г.		в митоз называют конденсацией хроматина.
Э. Страсбургер предложил термины «профа-		Митотическая хромосома в сравнении с ин-
за», «метафаза» и «анафаза» для обозначения		терфазной становится короче примерно в 50
различных этапов деления клеток. Во время		раз. Таким образом, ее можно увидеть под ми-
митоза	вновь образовавшиеся хромосомы	кроскопом. Конденсация хроматина становит-
распределяются равномерно по разным по-		ся возможной благодаря действию белков, на-
распределяются равномерно по разным по-		ся возможной благодаря действию белков, на-
люсам клетки и переходят в новые клетки. Это		зываемых конденсинами. Каждый такой белок
приводит к появлению двух генетически иден-		состоит из пяти субъединиц (не представлены
тичных дочерних клеток.		на рисунке). Визуализация конденсинов воз-
A. Митоз		можна на митотических хромосомах.
A. Митоз		После дупликации хромосом в S-фазе две ко-
Деление клетки происходит последовательно		пии одной хромосомы остаются связанными
в четыре этапа. У эукариот деление каждой		друг с другом как сестринские хроматиды.
клетки начинается с фазы синтеза ДНК, про-		Их удерживают вместе состоящие из несколь-
должительность которой составляет около 8 ч		ких субъединиц белки когезины. Когезины,
(S-фаза). Затем наступает фаза G2 продолжи-		каждый из которых состоит из четырех субъ-
тельностью около 4 ч, после чего происходит		единиц, по свой структуре похожи на конден-
запуск митоза (М). Митоз у эукариот длит-		сины. Они регулируют процесс разделения
ся примерно 1 ч. За ним следует интерфаза		сестринских хроматид. Мутации когезинов
(G1), продолжительность которой варьирует.		у делящихся дрожжей приводят нарушению
Клетки,	потерявшие способность делиться,	процесса митотического деления.
находятся в фазе G0. Во время перехода от ин-		Медицинская значимость
терфазы к митозу становятся видны хромо-		Медицинская значимость
сомы в виде длинных нитевидных структур.		Мутации любого из пяти генов, кодирующих
В поздней профазе хромосомы сжимаются,		субъединицы конденсина, приводят к тяжелым
становясь короче и толще (конденсация хро-		нарушениям роста и формированию пороков
матина). После исчезновения ядерной мем-		развития: синдрому Робертса (OMIM 268300;
браны в поздней профазе наступает метафаза.		Vega et al., 2005). Обзор заболеваний, связан-
Хромосомы выстраиваются в экваториальной		ных с нарушением структуры когезинов, при-
плоскости клетки, однако спаривания гомо-		веден на с. 262.
логичных хромосом не происходит. В позд-
ней метафазе во время перехода к анафазе
хромосомы делятся в области центромеры.
Сестринские хроматиды каждой из хромо-
сом расходятся к противоположным полюсам
клетки, после чего клетка вступает в телофазу,
началом	которой становится формирование

ядерной оболочки. В конце митоза происходит деление цитоплазмы (цитокинез). В ранней интерфазе отдельные хромосомы снова становятся невидимыми внутри клеточного ядра.

Б. Хромосомы в метафазе

В 1888 г. Валдейер предложил термин «хромосома» для обозначения окрашенных нитевидных структур, которые можно было увидеть во время митоза. Метафазная хромосома состоит из двух хроматид (сестринские хроматиды) и центромеры, удерживающей хроматиды вместе. Участки на обоих концах хромосомы

Деление клетки: митоз

109

110 Эукариотические клетки

МЕЙОЗ В ЗАРОДЫШЕВЫХ КЛЕТКАХ

Мейоз (от древнегреч. μειоω — уменьшение) — это особый тип деления клеток, который у большинства эукариот приводит к образованию гаплоидных гамет (яйцеклеток и сперматозоидов). Термин предложен Страсбургером в 1884 г. Мейоз предполагает два этапа деления ядра, но только один раунд репликации ДНК. Образующиеся в результате четыре дочерние клетки гаплоидны, т. е. содержат по одной хромосоме из каждой пары.

Мейоз отличается от митоза как генетически, так и цитологически. Во-первых, в профазе первого деления происходит спаривание гомологичных хромосом. Во-вторых, регулярно происходит обмен участками между гомологичными хромосомами (кроссинговер). В результате все новые хромосомы содержат сегменты, унаследованные как от материнского, так и от отцовского организма. Процесс образования новых комбинаций генетических элементов называют генетической рекомбинацией. В-третьих, хромосомный набор уменьшается вдвое во время первого деления (мейоз I).

Мейоз — это сложный биохимический процесс. События в клетке и их генетические последствия не совпадают по времени. Генетический процесс, происходящий в одной фазе, на уровне клетки дает видимые результаты в более поздней фазе.

A.Мейоз I

Образующая гаметы клетка в мейозе проходит через два этапа деления: мейоз I и мейоз II. Генетически значимые события — рекомбинация посредством кроссинговера и уменьшение хромосомного набора — происходят в мейозе I. Мейоз начинается с репликации ДНК. В начале профазы I происходит спаривание хромосом. Спаривание делает возможным обмен генетической информацией между гомологичными хромосомами (кроссинговер) при соприкосновении друг с другом гомологичных хроматид. В определенных точках образуются хиазмы. В результате кроссинговера происходит обмен материнским и отцовским генетическим материалом между двумя хроматидами гомологичных хромосом. В анафазе I происходит миграция гомологичных хромосом к противоположным полюсам клетки.

Б. Мейоз II

В мейозе II происходят продольное разделение удвоенных хромосом (хроматид) и после-

дующее деление тела клетки. Каждая из дочерних клеток является гаплоидной и содержит только одну хромосому из пары. На каждой хромосоме можно идентифицировать рекомбинантные и нерекомбинантные фрагменты. Генетические события, приводящие к таким изменениям, происходят в профазе мейоза I (см. следующую страницу).

Во время мейоза набор специфичных белков когезинового комплекса обеспечивает правильность спаривания и последующего разделения сестринских хроматид.

Медицинская значимость

Независимое распределение хромосом в мейозе позволяет объяснить сегрегацию наблюдаемых признаков в соответствии с законами Менделя (см. с. 126). Ошибки при распределении хромосом, называемые нерасхождением, приводят к образованию гамет с дополнительными или недостающими хромосомами. В результате после оплодотворения зигота может содержать либо три гомологичные хромосомы (трисомия), либо только одну хромосому (моносомия) (см. Хромосомные заболевания, с. 172, 398).

Мейоз в зародышевых клетках

111

112 Эукариотические клетки

МЕЙОЗ, ПРОФАЗА I

В профазе мейоза I происходят решающие цитологические и генетические события. Именно в профазе благодаря кроссинговеру гомологичные хромосомы обмениваются генетической информацией. В 1912 г. для обозначения механизма, в ходе которого материнские и отцовские хромосомы могут совершать обмен фрагментами ДНК, Т. Морган предложил термин «кроссинговер». В результате обмена возникают новые сочетания участков хромосом (генетическая рекомбинация).

A. Профаза, мейоз I

Профаза мейоза I состоит из пяти стадий. В первую стадию, лептотену, хромосомы впервые становятся видимыми тонкими нитевидными структурами (на рисунке представлена только одна пара хромосом). Затем следует зиготена: в результате репликации ДНК перед началом профазы все хромосомы образуют видимые парные структуры. После дупликации каждая хромосома состоит из двух идентичных хроматид (сестринских хроматид), соединенных друг с другом в области центромеры. Каждая хроматида содержит двойную спираль ДНК. После спаривания гомологичные хромосомы называют тетрадами или бивалентами. В пахитене биваленты становятся толще и короче. В диплотене происходит разделение двух гомологичных хромосом, однако они по-прежнему соединены друг с другом в нескольких точках, каждую из которых называют хиазмой (см. следующую страницу). В фазе диакинеза идет дальнейшее разделение хромосомных пар, но их концы все еще остаются соединенными. Хиазма возникает на том участке, где ранее имел место кроссинговер. Однако в позднем диакинезе хиазмы перемещаются к теломерам, такой процесс называют терминализацией хиазм. Стадии мейоза II аналогичны стадиям митоза. Четко разграничить стадии мейоза II не представляется возможным.

Б.Синаптонемный комплекс

Д. Фоусетт и М. Дж. Мозес в 1956 г. независимо друг от друга обнаружили в сперматоцитах синаптонемный комплекс. Формирование этой сложной структуры происходит в профазе I мейоза. Она состоит из двух хроматид (1 и 2), унаследованных от материнского организма (mat), и двух хроматид (3 и 4), унаследованных от отцовского организма (pat). Комплекс инициирует процесс формирования хиазмы

и создает условия для кроссинговера и последующей рекомбинации. Появление двухцепочечных разрывов в гомологичных хромосомах предшествует образованию синаптонемного комплекса. (Рис. из: Alberts et al., 2015.)

В. Образование хиазм

Термин «хиазма» был предложен Ф. Янссенсом в 1909 г. для описания цитологических проявлений кроссинговера в профазе I мейоза. Хиазма соединяет одну материнскую хроматиду (на рисунке хроматиды 1 и 2) с одной отцовской хроматидой (хроматиды 3 и 4). Любая из двух хроматид одной хромосомы может обмениваться генетической информацией с одной из хроматид гомологичной хромосомы (1 и 3, 2 и 4 и т. д.).

Г. Генетическая рекомбинация

Благодаря кроссинговеру появляются новые комбинации сегментов хромосом (рекомбинация). Рекомбинантные и нерекомбинантные хромосомные сегменты отличаются друг от друга. Области А–Е одной хромосомы (обозначены розовым) и соответствующие области а–е гомологичной хромосомы (обозначены голубым) превращаются в области a–b–C–D–E и A–B–c–d–e соответственно.

Д.Пахитена идиакинез под микроскопом

Рисунок демонстрирует, как выглядит диакинез под световым микроскопом (1) и пахитена под электронным микроскопом (2). Красной стрелкой на рисунке (1) отмечена дополнительная хромосома 21, которая присутствует у мужчины с трисомией. Хромосомы X и Y спарены, их концы соединены друг с другом (см. с. 246). На рисунке (2) видны утолщенные в результате дупликации хромосомы и бивалент XY. (Фотографии: R. Johannisson, Любек, Германия, с разрешения. Рис. (1) из: Johsnnisson et al., 1983.)

Мейоз, профаза I

113

114 Эукариотические клетки

ГАМЕТОГЕНЕЗ

Гаметы (половые клетки) — это клетки, передающие генетическую информацию от одного поколения к другому. Они образуются в гонадах. Процесс формирования женских половых клеток называют оогенезом (образование ооцитов), а мужских половых клеток — сперматогенезом (образование сперматозоидов). В раннем периоде эмбрионального развития первичные половые клетки мигрируют из половых тяжей в гонады, где продолжается их митотическое деление. Процесс формирования собственно половых клеток (гаметогенез) начинается с мейоза. Гаметогенез у мужских и женских организмов различается по продолжительности и результатам.

A.Сперматогенез

После миграции в зачаток гонады первичные половые клетки образуют диплоидные сперматогонии, претерпевающие митотическое деление. Сперматоциты первого порядка появляются в результате первого мейотического деления, которое происходит после наступления периода полового созревания. По завершении мейоза I один сперматоцит первого порядка дает начало двум сперматоцитам второго порядка. Каждый из них, в свою очередь, содержит гаплоидный набор удвоенных хромосом. Во время мейоза II каждый сперматоцит второго порядка делится, образуя две сперматиды. Таким образом, из сперматоцита первого порядка получается четыре сперматиды, каждая из которых содержит гаплоидный хромосомный набор. Сперматиды дифференцируют в зрелые сперматозоиды в течение примерно шести недель. Сперматогенез — это непрерывный процесс. Человеческому сперматогонию необходимо около 90 дней, чтобы превратиться в зрелый сперматозоид.

Б.Оогенез

В раннем периоде эмбрионального развития при оогенезе первичные половые клетки мигрируют из половых тяжей в яичники, где в результате нескольких митотических делений образуются оогонии. Ооцит первого порядка появляется после первого мейотического деления оогония. У женщин мейоз I начинается примерно за четыре недели до рождения. Чуть позже мейоз I останавливается в диктиотене профазы. Ооцит первого порядка остается в этом состоянии до тех пор, пока не наступает половое созревание девочки (овуляция), тогда мейоз I возобновляется. У ооцитов первого по-

рядка цитоплазма делится несимметрично как при мейозе I, так и при мейозе II. Это приводит к образованию двух клеток разного размера. Более крупная клетка становится яйцеклеткой, а меньшая по размерам клетка — полярным тельцем (а не половой клеткой). При делении ооцита второго порядка одна дочерняя клетка превращается в ооцит, а другая — в полярное тельце II. Полярные тельца дегенерируют и не развиваются. Каждая хромосома ооцита второго порядка по-прежнему состоит из двух сестринских хроматид, которые разделяются в мейозе II. Во время овуляции ооцит второго порядка выходит из яичника. Если происходит оплодотворение, образуется зигота.

Медицинская значимость

Неправильное распределение хромосом (нерасхождение) в мейозе I или мейозе II служит причиной хромосомных аберраций (см. с. 398).

Анализ полярных телец позволяет определить наличие генетической аномалии у плода. В редких случаях происходит оплодотворение полярных телец, в результате которого может появиться недоразвитый близнец.

Частоты мутаций, связанных с оогенезом и сперматогенезом, различаются. Разница во времени, необходимом для формирования гамет при оогенезе и сперматогенезе, связана с разницей в количестве делений зародышевых клеток. В среднем к 30 годам в клетках — предшественниках сперматозоидов — происходит около 380 эпизодов репликации хромосом, а к 40 годам — около 610 эпизодов репликации. В целом число делений клеток при сперматогенезе в 25 раз превышает число делений клеток при оогенезе (Crow, 2000). По-видимому, это связано с более высокой частотой мутаций у мужчин, особенно у мужчин старшего возраста. У женщин до начала мейоза происходит 22 митотических деления, т. е. всего имеет место 23 эпизода репликации хромосом.

Общее количество половых клеток в яичниках человеческого плода к пятому месяцу беременности достигает 6,8 106, к моменту родов сокращается до 2 106, а к началу полового созревания половых клеток остается примерно 200 000. Из них примерно 400 в итоге проходят овуляцию.

Гаметогенез 115

116

Эукариотические клетки

ПРОГРАММИРУЕМАЯ ГИБЕЛЬ

друга в

определенной последовательности.

КЛЕТКИ

Связывание Fas-лиганда

цитотоксической

Т-клетки

(см. главу об иммунной системе)

с Fas-рецептором, известным также как CD95,

На определенных этапах развития много-

приводит к активации внеклеточного адап-

клеточного

организма

некоторые

клетки

терного белка FADD (белок, взаимодейству-

должны гибнуть, а не дифференцироваться.

ющий с доменом смерти Fas-рецептора).

Самостоятельную

гибель клеток называют

Указанный белок, в свою очередь, связывается

апоптозом

или программируемой

гибелью

с прокаспазой 8, образуя активную каспазу 8.

клеток (от греч. apo — из или без и ptosis —

Каспаза 8 вызывает высвобождение цитохро-

падение). Термин был предложен Дж. Керром

ма в митохондриях (см. с. 248) и активирует

в 1972 г. Важность этого биологического фе-

несколько разных эффекторных каспаз. В ге-

номена стала очевидна после исследования

номах мыши и человека содержится 13 генов

земляной

нематоды

Caenorhabditis

elegans

каспаз (1–12). У человека каспазы 3 и 6–10

(см. с. 218). Существует несколько меха-

участвуют в апоптозе, а остальные — в раз-

низмов регуляции апоптоза, в которых уча-

витии воспаления. Каспаза 8 выполняет также

ствуют белки, способные индуцировать или

функцию селективного переносчика сигнала

предотвращать апоптоз. Регуляция апоптоза

к ядерному фактору каппа В при формирова-

может осуществляться как вне клетки (внеш-

нии первичного иммунного ответа на антиген.

ний путь), так и внутри ее (внутренний путь).

В регуляции апоптоза участвуют и белки се-

A. Важность апоптоза

мейства Bcl-2.

Медицинская значимость

Апоптоз прежде всего работает во время эм-

брионального развития. Например,

пальцы

Мутации

генов,

кодирующих

ингибиторы

у растущего эмбриона млекопитающих появ-

апоптоза или индуцирующие апоптоз факто-

ляются благодаря апоптозу (1). Лапы (руки)

ры, приводят к появлению различных видов

формируются из

лопатообразных структур.

злокачественных

опухолей

(см.

«apoptosis»

Для того чтобы пальцы могли образоваться,

в OMIM). Например, В-клеточную лимфому

клетки между ними должны погибнуть (на ри-

(OMIM 151430) вызывает дефектный белок Bcl,

сунке такие клетки обозначены ярко-зелены-

к появлению которого приводит мутация гена

ми точками). Еще большее количество клеток

BCL2.

гибнет в процессе развития нервной систе-

мы у позвоночных. В норме примерно поло-

вина клеток гибнет вскоре после появления.

Если у мышиного эмбриона отсутствует один

из важных генов-регуляторов апоптоза (ген

каспазы 9, см. ниже), то возникает избыточ-

ная пролиферация нейронов, и мозг выпячи-

вается наружу (2). (Рис. из: Alberts et al., 2015;

Gilbert & Barresi, 2016.)

Б. Что происходит с клеткой

при апоптозе

Первыми видимыми признаками апоптоза яв-

ляются конденсация хроматина и «кипение»

клетки. Плазматическая

мембрана образует

вздутия (блеббинг), и клетка начинает раз-

рушаться (распад ядра, фрагментация ДНК).

Из останков разрушенной клетки формируют-

ся апоптатические тельца, поглощаемые дру-

гими клетками в процессе фагоцитоза.

В.Регуляция апоптоза

Специализированные

цистеинсодержащие

аспартатпротеиназы,

называемые

каспа-

зами,

активируют

или

инактивируют друг

Программируемая гибель клетки

117

118	Эукариотические клетки
КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК			или подвергнув воздействию вируса Сендай.
			Слияние родительских клеток разных видов
Клетки животных и растений могут расти и раз-			позволяет получить межвидовые гибриды (ги-
множаться вне организма в клеточной культуре.			бриды разных видов животных). Гибридные
Обычно используют культуры недифференци-			клетки можно отличить от родительских кле-
рованных клеток, фибробластов. Из них можно			ток, если использовать родительские клетки
создать колонии идентичных клеток (клонирова-			с дефицитом тимидинкиназы (TK–) или гипок-
ние клеток), получив источник гомогенных кле-			сантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT–).
ток. Клеточные культуры позволяют проводить			При совместном культивировании (сокульти-
эксперименты, которые невозможно провести			вирование, 3) клеток типа A (TK–, 1) и типа B
на целых организмах. Использовать культу-			(HPRT–, 2) некоторые клетки сливаются (4).
ры клеток начали 1940 г., когда У. Эрлу удалось			На селективной среде, содержащей гипок-
ры клеток начали 1940 г., когда У. Эрлу удалось			На селективной среде, содержащей гипок-
получить клеточную линию мышей, а Т. Паку			сантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT;
и его сотрудникам удалось вырастить клоны			Littlefield, 1964), могут расти только слившие-
человеческих клеток in vitro. В 1965 г. это спо-			ся клетки с ядрами от каждой из родительских
собствовало развитию генетики соматических			клеток (1 и 2). Клетки, которые не слились,
клеток. Срок жизни культивируемых in vitro кле-			не вырастают на среде HAT (5). Это проис-
ток ограничен, так же как и у клеток in vivo (см.			ходит из-за того, что клетки TK– не способны
«Генетические основы процесса старения»).			синтезировать тимидинмонофосфат, а клетки
A.Культивирование			HPRTне могут синтезировать монофосфаты
A.Культивирование			пуриновых нуклеозидов. Два ядра сливших-
человеческих фибробластов			ся клеток (гетерокарион) тоже сливаются (6).
Для создания стандартной клеточной культуры			В результате образуется гибридная клетка
необходима чашка со средой, имеющей темпе-			(7). Такие клетки можно культивировать для
ратуру 37 °C, в состав которой входят витами-			дальнейших исследований (8). Изучение ги-
ны, сахар, сыворотка (содержащая множество			бридных клеток позволило получить важную
факторов роста и гормонов), девять незаме-			информацию о генетических основах функций
нимых для позвоночных аминокислот и обычно			клеток.
глутамин или цистеин. Основным типом клеток,			В.Радиационные гибриды
которые можно вырастить из фрагмента ткани			В.Радиационные гибриды
млекопитающих в культуре, являются фибро-			Фрагменты человеческих хромосом (1), вы-
бласты. Чтобы создать культуру, небольшой ку-			деленные из клеток после летальной дозы
сочек кожи (2 4 мм), полученный в стерильных			рентгеновского облучения (3–8 Гр), смеша-
условиях, нарезают еще мельче и помещают			ли с клетками грызунов, содержащими не-
в чашку для культивирования, где фрагменты			поврежденные хромосомы (2). Некоторые
прикрепляются ко дну (адгезионная культу-			фрагменты человеческих хромосом встраива-
ра). Через 8–14 дней клетки вырастают и об-			ются в хромосомы грызунов (3). Клетки, в ко-
разуют монослой. Они прекращают деление			торых присутствует человеческая ДНК, можно
из-за контактного ингибирования (механизм,			идентифицировать с помощью специфичных
который не работает в опухолевых клетках).			зондов после культивирования на селектив-
После переноса в новые чашки для культиви-			ной среде. Случайная выборка фрагментов
рования (субкультура) клетки продолжат расти,			человеческой ДНК из панели радиационных
пока снова не соприкоснутся друг с другом.			гибридов была использована для построения
Используя серию субкультур, можно вырастить			хромосомных карт.
несколько миллионов клеток для эксперимен-
та. Культивированные клетки очень чувстви-
тельны к повышению температуры и гибнут при
температуре около 39 °C. При этом их можно
заморозить живыми и хранить в жидком азоте
при температуре –196 °C много лет или деся-
тилетий, а потом снова использовать для куль-
тивирования.
Б.Гибридные клетки
Культивируемые клетки		можно заставить
слиться,	обработав их	полиэтиленгликолем

Культуры клеток

119

120 Общая генетика

МЕНДЕЛЕВСКИЕ ПРИЗНАКИ

Научно обосновать закономерности, лежащие в основе наследования признаков, удалось монаху-августинцу Грегору Менделю в 1865 г. Он описал свои наблюдения в докладе брюннскому Обществу естествоиспытателей, который был опубликован в 1866 г. В своей работе «Опыты над растительными гибридами» Мендель писал, что некоторые признаки гороха посевного (Pisum sativum) наследуются независимо друг от друга в соответствии с определенными правилами. Только в 1900 г. Де Фриз, К. Корренс и Э. Чермак-Зейзенегг независимо друг от друга признали важность открытий Менделя для биологии.

А. Горох посевной (Pisum sativum)

Обычно воспроизводство у гороха посевного происходит за счет самоопыления. При самоопылении пыльца с пыльника попадает на рыльце пестика того же цветка. Однако пыльцу одного цветка можно перенести на рыльце пестика другого цветка гороха (перекрестное опыление). Растение (рисунок слева) состоит из стебля, листьев, цветков

ибобов. Внутри цветка (рисунок справа) можно увидеть женские и мужские органы полового размножения. Гинецей состоит из рыльца, пестика и семязачатков. Мужской орган полового размножения — это тычинка, состоящая из пыльника и тычиночной нити. Чтобы опылить растение, Мендель открывал цветки

иудалял пыльники, таким образом исключая самоопыление. Затем он переносил пыльцу одного растения прямо на рыльце пестика другого растения.

Б. Признаки, которые изучал Мендель

Мендель изучал семь признаков (фенотипов): высоту растений (1а, б), расположение цветков на стебле растения (2а, б), цвет бобов (3), форму бобов (4), форму семян (5), цвет семян (6) и цвет оболочки семян (7). Расщепление признаков у следующего поколения растений происходило по определенной схеме.

Отклонения от законов Менделя

Возможно отклонение от ожидаемого по законам Менделя расщепления. Эпистаз — это нереципрокное взаимодействие неаллельных генов. В результате такого взаимодействия один из генов подавляет фенотипические проявления другого гена. В 1902 г. У. Бэйтсон описал это явление на примере рецессивного гена apterous (ap) дрозофилы. Гомозиготы не име-

ют крыльев, однако этот ген подавляет и другие влияющие на морфологию крыла гены, например ген curled wing (ген ap эпистатичен по отношению к гену curled wing). Другим примером является бомбейская группа крови (Bhende et al., 1952; Race and Sanger, 1975).

Мейотический дрейф предполагает преимущественное наследование одного из аллелей. В результате один признак встречается у потомства чаще других. Примерами мейотического дрейфа служат наследование Т-локуса

умышей (~99% вместо 50% потомства гетерозиготного t/+ самца мыши тоже является гетерозиготным) и нарушение расщепления

удрозофилы.

Геномный импринтинг (см. с. 198) — это еще одна причина отклонений от менделевского наследования.

Медицинская значимость

Наследование нескольких тысяч заболеваний человека или предрасположенности к ним происходит в соответствии с законами Менделя, описание которых приведено на следующих страницах.

Менделевские признаки

121

122 Общая генетика

ПЕРЕДАЧА ПРИЗНАКОВ СЛЕДУЮЩЕМУ ПОКОЛЕНИЮ

Мендель заметил, что наследование признаков следующим поколением гороха посевного (Pisum sativum) происходит в соответствии с некими правилами. Признаки проявлялись у следующего поколения растения в определенном соотношении (генетическое расщепление). Описанные Менделем принципы наследования признаков позднее были названы законами Менделя.

A. Расщепление доминантных и рецессивных признаков

Мендель скрещивал родительские растения (поколение Р), имевшие семена разной формы (гладкие или морщинистые) и цвета (желтые или зеленые). Он обнаружил, что в первом поколении (F1) все растения имели гладкие желтые семена. В следующем поколении (F2), полученном в результате самоопыления, снова появились все признаки, присутствовавшие у растений поколения Р (гладкие, морщинистые, желтые, зеленые). Из 7324 семян, полученных во время одного эксперимента, 5474 были гладкими, а 1850 — морщинистыми. Из 8023 семян поколения F2 6022 были желтыми, а 2001 — зелеными. В обоих случаях соотношение составляло 3 : 1. Признаки, которые Мендель наблюдал у растений поколения F1, он назвал доминантными. Признаки, отсутствовавшие в поколении F1 (морщинистые или зеленые), Мендель назвал рецессивными. Наблюдение, что доминантный и рецессивный признаки расщепляются во втором поколении F2 в соотношении 3 : 1, легло в основу первого закона Менделя.

Б. Скрещивание гибрида F1 с родительским растением

Когда Мендель скрещивал растения F1 с родительскими растениями, имевшими морщинистые семена (рецессивный признак, 1), у растений следующего поколения оба признака встречались в соотношении 1 : 1 (106 растений имели гладкие семена и 102 растения — морщинистые). Этот закон назвали вторым законом Менделя.

Эксперимент (2) Мендель интерпретировал следующим образом: у растения F1 присутствует два фактора — один соответствует гладким семенам (R, доминантный по отношению к r), а другой соответствует морщинистым (r, рецессивный по отношению к R). Растение

F1 является гетерозиготным (Rr), поэтому может образовывать гаметы двух типов (R и r). Другое растение является гомозиготным (rr)

иимеет морщинистые семена (r). У него образуются гаметы только одного типа (r, морщинистые). Половина потомства гетерозиготного растения наследует доминантный признак (R, гладкие), а другая половина — рецессивный признак (r, морщинистые). В итоге признаки R

иr расщепляются в соотношении 1 : 1, т. е. 50% для каждого. Наблюдаемый признак называют фенотипом. Сочетание двух факторов (генов) R и r, (Rr) или (rr) называют генотипом. Альтернативные формы признака (здесь гладкие и морщинистые) называют аллелями. Они возникают из-за присутствия разной генетической информации в локусе одного конкретного гена. При наличии двух разных аллелей генотип является гетерозиготным. Если аллели одинаковые, генотип гомозиготный (это утверждение всегда верно для одного конкретного локуса гена).

Соотношения, представленные в части А настоящего раздела, подверг сомнению знаменитый статистик и генетик Р. Фишер. В 1936 г. он предположил, что результаты экспериментов Менделя недостоверны и не учитывают статистические флуктуации. Фишер поднял вопрос о том, что Мендель мог подгонять свои эксперименты под описанные соотношения, пусть даже и неосознанно. А. Пирес

иЖ. Бранко создали статистическую модель, которая позволила объяснить результаты экспериментов Менделя, исключив манипуляции данными с его стороны.

Передача признаков следующему поколению

123

124 Общая генетика

НЕЗАВИСИМОЕ НАСЛЕДОВАНИЕ ПРИЗНАКОВ

В ходе дальнейших экспериментов Мендель установил, что наследование двух различных признаков (гладкие/морщинистые, желтые/зеленые) происходило независимо. Каждая пара из двух доминантных и рецессивных признаков демонстрировала расщепление 3 : 1 в поколении F2, как было описано ранее. Расщепление двух пар признаков также происходило в установленном соотношении.

A. Независимое наследование двух признаков

Когда Мендель скрестил растения, имевшие гладкие желтые семена, с растениями, у которых семена были морщинистыми и зелеными, в поколении F1 ему удалось получить только растения с гладкими желтыми семенами. У 556 растений в поколении F2 он наблюдал следующее расщепление по двум парам признаков: 315 растений имели желтые гладкие семена, 108 растений — желтые морщинистые семена, 101 растение — зеленые гладкие семена, 32 растения — зеленые морщинистые семена. Это соответствует расщеплению 9 : 3 : 3 : 1. Такая закономерность была названа третьим законом Менделя.

Б. Интерпретация результатов эксперимента

Наблюдения Менделя можно интерпретировать следующим образом. Если обозначить прописной буквой G доминантный ген (желтые семена), строчной буквой g рецессивный ген (зеленые семена), прописной буквой R доминантный ген (гладкие семена) и строчной буквой r рецессивный ген (морщинистые семена), то можно получить следующие девять генотипов: GGRR, GGRr, GgRR, GgRr (желтые гладкие), GGrr, Ggrr (желтые морщинистые), ggRR, ggRr (зеленые гладкие) и ggrr (зеленые морщинистые). Расщепление признаков в соотношении, представленном в разделе А, — это результат образования гамет различных типов (по набору содержащихся в них генов).

Соотношение доминантного признака (желтые семена, G) и рецессивного признака (зеленые семена, g), составляет 12 : 4, т. е. 3 : 1.

Результаты можно визуализировать с помощью схемы, называемой решеткой Пеннета. Это метод определения типов зигот, образующихся при слиянии двух гамет с определенным генотипом. Впервые он был предложен

Р. К. Пеннетом в 1907 г. во втором издании его книги «Менделизм». Квадрат демонстрирует девять различных генотипов у зиготы после оплодотворения. В общей сложности это 9/16 желтых гладких семян (GRGR, GRGr, GrGR, GRgR, gRGR, GRgr, GrgR, gRGr, grGR), 3/16 зеленых гладких семян (gRgR, gRgr, grgR), 3/16 желтых морщинистых семян (GrGr, Grgr, grGr) и 1/16 зеленых морщинистых семян (grgr). Каждая пара признаков (доминантный, желтые семена, и рецессивный, зеленые семена, доминантный, гладкие семена, и рецессивный, морщинистые семена) наследуется в соотношении 3 : 1 (доминантный по отношению к рецессивному).

Эксперименты Менделя радикально отличались от других попыток понять принципы наследственности, сделанных в XIX в. Во-первых, Мендель упростил эксперимент, выбрав признаки, передачу которых легко проследить. Во-вторых, он дал количественную оценку механизма передачи признаков от одного поколения к другому. В-третьих, он сумел правильно интерпретировать результаты, заметив, что наследование каждой пары признаков происходило независимо от других пар признаков предсказуемым образом. Значимость его открытия не признавали до 1900 г., когда трое ученых — Гуго де Фриз (Амстердам), Эрих Чермак-Зейзенегг (Вена) и Карл Корренс (Тюбинген) — независимо друг от друга признали фундаментальность выводов Менделя.

Сейчас нам известно, что независимое наследование генетически детерминированных признаков (расщепление) возможно только в том случае, если ответственные за эти признаки гены расположены на разных хромосомах или лежат достаточно далеко друг от друга на одной хромосоме, чтобы разделяться при рекомбинации. В противном случае расщепление может отсутствовать (см. Сцепление генов, с. 132).

Независимое наследование признаков

125

126 Общая генетика

ФЕНОТИП И ГЕНОТИП: ПРИМЕНЕНИЕ В ГЕНЕТИЧЕСКОМ КОНСУЛЬТИРОВАНИИ

Законы Менделя применяют для оценки риска появления наследственного заболевания у членов отдельной семьи при генетическом консультировании. Для этого исследуют генетические связи между членами семьи, представленными на родословном древе (анализ родословной). Наблюдаемым фенотипом может быть заболевание, группа крови, вариант белка, особенность показателей лабораторных анализов или любой другой признак.

A. Символы, используемые для построения генеалогической схемы

Приведенные в настоящей книге символы обычно используют для построения генеалогических схем. Как правило, на генеалогической схеме присутствует не менее трех поколений. На рисунке представлено только два поколения. Мужчины обозначены квадратами, а женщины — кругами. Индивиды, пол которых неизвестен (например, из-за недостатка информации), обозначены ромбами. В медицинской генетике необходимо указывать степень достоверности определения фенотипа, например наличия или отсутствия заболевания. В каждом случае также необходимо указывать, какой фенотип (например, какое заболевание) является предметом анализа. Следует различать подтвержденный диагноз (данных достаточно), возможный диагноз (данных недостаточно) и диагноз под вопросом (на основании устных свидетельств или при сомнительных данных).

Б.Генотип ифенотип

Определения генотипа и фенотипа относятся к определенному локусу гена. Различные формы генетической информации в одном и том же генном локусе называют аллелями. У диплоидных организмов, всех животных и многих растений при наличии двух аллелей в любом из локусов возможно три варианта генотипа: а) гомозиготный с двумя идентичными аллелями; б) гетерозиготный с двумя различными аллелями; в) гомозиготный с двумя другими идентичными аллелями.

Если аллель проявляет свое действие в гетерозиготном состоянии, его называют доминантным. Если фенотип реализуется только у гомозигот, то аллель является рецессивным. Если в геторозиготном состоянии проявляют

свое действие оба аллеля, это называют кодоминированием (например, аллели А и В в системе групп крови АВ0; 0 является рецессивным аллелем по отношению к А и В). Термины «доминантный» и «рецессивный» относятся только к наблюдаемым проявлениям и неприменимы на молекулярном уровне.

Медицинская значимость

Менделевское наследование составляет основу генетического консультирования пациентов с моногенными заболеваниями. Генетическое консультирование — это коммуникационный процесс, касающийся аспектов возникновения генетического заболевания, в частности диагностики и оценки вероятности возникновения такого заболевания у членов отдельной семьи и их родственников. Больного, чья болезнь привлекает внимание к генеалогии семьи, называют индексным пациентом. Лицо, с которого начинают составлять родословную, называют пробандом. Индексный пациент и пробанд часто являются разными людьми.

Основная цель генетического консультирования — предоставить исчерпывающую информацию об ожидаемом течении заболевания, медицинской помощи и возможных методах лечения или объяснить причины, по которым лечение невозможно. Генетическое консультирование также предполагает планирование семьи с учетом риска развития наследственных заболеваний у потомства. При консультировании необходимо соблюдать конфиденциальность. Консультант не вправе принимать решения. Растущая доступность информации о заболеваниях, основанная на тестах ДНК (предиктивном тестировании ДНК) до возникновения клинических проявлений, требует предельной осторожности при принятии решения о том, будет ли проведение теста в интересах пациента или нет.

Фенотип и генотип: применение в генетическом консультировании

127

128 Общая генетика

РАСЩЕПЛЕНИЕ ПО ГЕНОТИПУ

Расщепление (распределение) генотипов родителей (родительских генотипов) у их потомства зависит от того, какие комбинации аллелей присутствуют у родителей. Учитывая влияние генотипа на фенотип в гетерозиготном состоянии, аллели делят на доминантные и рецессивные. Существует три основных типа наследования: а) аутосомно-доминантный; б) аутосомно-рецессивный; в) Х-сцепленный. Среди генов Х-хромосомы обычно нет необходимости выделять доминантные и рецессивные (см. следующую страницу). Поскольку Y-хромосома содержит крайне малое число сцепленных с заболеваниями генов, наследование по Y-хромосоме при исследовании моногенных заболеваний обычно можно не рассматривать.

A. Возможные варианты генотипов

Б. Ожидаемое распределение генотипов у потомства родителей с двумя аллелями А и а

При наличии трех типов скрещивания родительских организмов для двух аллелей А (доминирует над а) и а (рецессивный по отношению к А) образуются три комбинации, приводящие к сегрегации (разделению при мейозе) аллельных генов. Они соответствуют родительским комбинациям 1, 2 и 3 (см. А). При скрещивании 1 и 2 один из родителей является гетерозиготой (Аа), а другой — гомозиготой (аа). Ожидаемое соотношение генотипов у потомства составляет 1 : 1, т. е. 50% (0,50) гетерозиготны, Аа, а остальные 50% (0,50) гомозиготны, аа.

Если оба родителя являются гетерозиготами Aa (тип скрещивания 3 на рис. A), ожидаемое соотношение генотипов у потомства (AA, Aa, aa) составляет 1 : 2 : 1 (25% : 50% : 25%).

Для генного локуса с двумя аллелями возмож-	В. Распределение генотипов
но шесть вариантов родительских генотипов	Один доминантный аллель (на первой генеало-
(1–6). На рисунке представлены два аллеля,	гической схеме А присутствует у отца) должен
синий (bl) и красный (r), при этом синий до-	быть унаследован у 50% потомства. Если оба
минантен по отношению к красному. В трех	родителя гетерозиготны, 25% потомства будут
вариантах комбинаций родительских геноти-	гомозиготами (аа). Если оба родителя гомози-
пов (1, 3, 4) никто из родителей не гомозиго-	готны, один по доминантному аллелю А, а дру-
тен по рецессивному аллелю (красный). В трех	гой по рецессивному аллелю а, то все потомки
вариантах комбинаций родительских гено-	будут облигатными гетерозиготами (т. е. обя-
типов (2, 5, 6) у одного или обоих родителей	зательно должны быть гетерозиготны).
присутствуют проявления рецессивного ал-	Медицинская значимость
леля, поскольку они являются гомозиготами.	Медицинская значимость
Схема распределения генотипов и фенотипов	Определение типа наследования заболевания
у потомства таких родителей представлена	(анализ родословной) является важным фун-
на рис. Б. В приведенных примерах не учтен	даментальным методом в генетической диа-
пол родителей.	гностике и консультировании.

Таблица. Ожидаемое распределение генотипов у потомства для различных комбинаций родительских генотипов

Родители	Потомство		Ожидаемое соотношение генотипов
AA × AA	AA	1 (100%)
AA × Aa	AA, Aa	1	: 1 (50% для каждого)
Aa × Aa	AA, Aa, aa	1	: 2 : 1 (25, 50, 25%)
AA × aa	Aa	1 (100%)
Aa × aa	Aa, aa	1	: 1 (50% для каждого)
aa × aa	aa	1 (100%)

Расщепление по генотипу

129

130 Общая генетика

МОНОГЕННОЕ НАСЛЕДОВАНИЕ

Существует четыре типа моногенного наследования: аутосомно-доминантный, аутосомнорецессивный, Х-сцепленный и Y-сцепленный. При анализе человеческих родословных поколения последовательно обозначают римскими цифрами, начиная с I для первого поколения, о котором имеется некоторая информация, а каждого человека в пределах одного поколения обозначают арабской цифрой. Для проведения компьютерной обработки данных можно применять неперекрывающиеся численные идентификаторы.

A.Аутосомно-доминантное наследование

Аутосомно-доминантный тип наследования имеет следующие особенности: а) пораженные лица связаны родством в одном или нескольких последовательных поколениях; б) ожидаемое соотношение пораженного и здорового потомств пораженного лица составляет 1 : 1 (0,50, или 50%) (1). Первый заболевший, как правило, появляется в результате мутации de novo (2, 3). При некоторых заболеваниях с аутосомно-доминантным типом наследования у носителей мутации отсутствуют симптомы заболевания. Это называют неполной пенетрантностью. Возможна значительная вариабельность клинических проявлений в пределах одной семьи. Такое явление называют варьирующей экспрессивностью.

Б.Аутосомно-рецессивное наследование

Аутосомно-рецессивный тип наследования имеет следующие особенности: а) лица мужского и женского пола поражены в соотношении 1 : 1; б) здоровые родители. Распределение генотипов детей гетерозиготных родителей происходит в соотношении 1 : 2 : 1 (25% нормальных гомозигот, 50% гетерозигот и 25% пораженных гомозигот). Таким образом, гетерозиготные родители имеют 25%-й риск рождения потомства с заболеванием. В приведенных примерах в родословной 1 здоровые родители (II-3 и II-4), по-видимому, гетерозиготны. В родословной 2 предков пораженного ребенка (IV-2) можно проследить до общего предка (I-1 или I-2) обоих родителей (III-1 и III- 2), которые приходятся друг другу двоюродными братом и сестрой (присутствует кровное родство). Двойной линией на схеме обозначено кровное родство между родителями.

В.X-сцепленное наследование

Поскольку у мужчин только одна X-хромосома, все дочери всегда наследуют отцовскую Х-хромосому в дополнение к Х-хромосоме

матери.	Сыновья	наследуют	отцов-
скую Y-хромосому		и одну из материнских

Х-хромосом. Таким образом, Х-сцепленное наследование имеет следующие особенности: а) поражены только лица мужского пола; б) пораженные лица мужского пола наследуют мутантный аллель только от матери; в) отсутствует передача от отца к сыну. Следовательно, женщина, гетерозиготная по Х-хромосомной мутации, имеет 50%-ный риск рождения больного сына. У гетерозиготных лиц женского пола могут присутствовать небольшие клинические проявления Х-сцепленного заболевания из-за неполной инактивации Х-хромосомы (см. с. 200). В отдельных случаях иногда сложно определить, является ли Х-сцепленное заболевание результатом передачи мутантного аллеля от матери или результатом возникновения новой мутации. Поэтому важно различать три указанные ситуации.

Лица женского пола, у которых есть пораженный сын и брат или два пораженных сына, должны быть гетерозиготами, их называют облигатными гетерозиготами. Тех, кто может оказаться гетерозиготой называют факультативными гетерозиготами (например, III-5 и IV-2).

Медицинская значимость

Заболевания человека, наследуемые в соответствии с одной из указанных схем, называют менделевскими заболеваниями (полный перечень можно найти в базе OMIM).

Моногенное наследование

131

132 Общая генетика

СЦЕПЛЕНИЕ ГЕНОВ И РЕКОМБИНАЦИЯ

Генетическое сцепление — это вариант отклонения от независимого распределения признаков. Ключевым фактором является нахождение генов рядом друг с другом на одной и той же хромосоме. Если гены сцеплены, они часто передаются вместе в зависимости от того, насколько далеко расположены друг от друга. Сцепление было впервые открыто в 1902 г. К. Корренсом, а затем его существование подтвердили У. Бэйтсон с сотрудниками, исследовавшие гены растений. Генные локусы, расположенные на одной хромосоме и наследуемые вместе, называют гаплотипом. Термин «сцепление» относится к локусам генов, а не к отдельным аллелям. Синтения (Г. Дж. Ренвик в 1971 г.) — это расположение генных локусов на одной хромосоме без учета сцепления или расстояния между ними.

A. Выявление рекомбинации

Рекомбинация представляет собой событие в клетке (1), приводящее к определенному генетическому результату (2).

Наличие или отсутствие кроссинговера определяет, останутся соседние гены одной родительской хромосомы вместе (сцепление) или разделятся (рекомбинация) (см. Мейоз, с. 110). Если родительские хромосомы содержат две пары аллелей Aa и Bb, их распределение в следующем поколении может различаться. При отсутствии кроссинговера генотипы остаются неизменными (нерекомбинантные), а при его наличии происходит их перестройка (рекомбинация).

Возможны два варианта генетического результата (2) для двух соседних генных локусов A и B одной и той же хромосомы: нерекомбинантный (генотип гамет совпадает с родительским) или рекомбинантный (новая комбинация). Указанные варианты можно различить, только если родители являются гетерозиготами (Aa и Bb).

Б. Использование сцепления генов

Сцепление генов широко используют для оценки возможного наличия или отсутствия вызывающего заболевание аллеля, который невозможно определить напрямую (косвенная генетическая диагностика). Если аутосомнорецессивное или Х-сцепленное заболевание, вызванное мутацией (локус заболевания), невозможно обнаружить напрямую, о его при-

сутствии можно судить по результатам анализа одного или нескольких связанных локусов (маркерный локус). Для анализа генотипа в локусе заболевания используют полиморфные аллели одного или нескольких маркерных локусов. На рисунке представлены две родословные. В одной из них отсутствует рекомбинация (1), а в другой присутствует (2).

В первом примере (1) отец и три сына (красные символы на схеме) больны (дети обозначены ромбами, их пол не имеет значения). Поскольку у всех троих пораженных детей и у их отца присутствует маркерный аллель А, можно утверждать, что аллель В в локусе заболевания является мутантным аллелем. У здоровых детей присутствует отцовский маркерный локус а. Это значит, что b в локусе заболевания не является мутантным аллелем. Следовательно, рекомбинация отсутствует. Ситуация, когда рекомбинация имела место, представлена на втором рисунке. Пораженный член семьи унаследовал аллели а и В от отца вместо аллелей А и В. Здоровый член семьи унаследовал аллель А и аллель b. Такая ситуация может сложиться только в том случае, если отец (больной родитель) гетерозиготен по маркерному локусу (Аа).

Медицинская значимость

Анализ ДНК локусов полиморфных маркеров, связанных с локусом заболевания, можно использовать, чтобы определить, унаследовали ли здоровые члены семьи мутантный аллель, о котором известно, что он присутствует у пораженного члена семьи (косвенная ДНКдиагностика). Сейчас это можно определить напрямую, используя молекулярно-генетиче- ский анализ.

Сцепление генов и рекомбинация

133

134	Общая генетика
СЦЕПЛЕНИЕ ГЕНОВ И АНАЛИЗ				емых гаплотипом. На рисунке представлены
СОПРЯЖЕННОСТИ				три ОНП-маркера, расположенные вдоль ко-
				роткого отрезка ДНК (1), полученные от трех
				не связанных родством индивидов (хромосо-
Количественный анализ сцепления генов по-				мы 1–4). Три ОНП различаются полиморфны-
зволяет определить расстояние между двумя				ми аллелями (A/G, T/C, C/G соответственно).
или более локусами, а также соседними об-				Это определяет наличие четырех гаплотипов
ластями ДНК одной хромосомы. Физическое				(2). Генотипирование с использованием только
расстояние выражается в количестве пар				трех ОНП (маркерные ОНП) позволяет иден-
оснований, а		генетическое	расстояние —	тифицировать гаплотипы (3). Например, ACG
в частоте рекомбинации. Генетическая ас-				определяет гаплотип 2. (Рис. из: HapMap,
социация — это статистическое отношение				2003.)
социация — это статистическое отношение				2003.)
между конкретными аллелями и фенотипом.				В.Неравновесное сцепление
Некоторые аллели в разных локусах наследу-				В.Неравновесное сцепление
ются вместе чаще или реже, чем можно ожи-				Неравновесное сцепление можно графиче-
дать, исходя из их индивидуальной частоты.				ски представить в виде блоков, чтобы попар-
Это называют неравновесным сцеплением.				но сравнить все ОНП в исследуемой области
A. Кривые количественных				ДНК. На рисунке это показано на примере 10
A. Кривые количественных				ОНП (от rs7190220 вверху слева до rs9931018
показателей и анализ сцепления генов				справа). Первый квадрат в верхнем левом
Количественный анализ сцепления генов по-				углу демонстрирует соотношение между па-
зволяет определить, как часто два или более				рами 39 и 40 (ОНП rs7190220 и rs178023041).
генных локуса наследуются вместе, а не раз-				Нижний квадрат соответствует паре 39 и 49,
деляются в результате рекомбинации. Это				и т. д. Неравновесное сцепление между пара-
соотношение,		называемое	рекомбинацион-	ми показано цветом, который соответствует
ной фракцией, обозначают греческой буквой				типу сцепления. Красный квадрат без номе-
тета (Θ). Его используют для измерения ге-				ра указывает на полное сцепление, тогда как
нетического расстояния. Значение Θ для ло-				белый квадрат указывает на его отсутствие.
кусов, которые не сцеплены, составляет 0,5.				Числа в квадратах — это процентное соотно-
Если значение Θ равно нулю, локусы идентич-				шение между парами локусов. В приведенном
ны. Предполагают, что сцепление двух генных				примере пары от 42 (ОНП rs11863156) до 49
локусов есть, если вероятность сцепления,				(rs9931018) образуют блок неравновесного
деленная на вероятность отсутствия сцепле-				сцепления между парами 86 и 100 (ярко-крас-
ния, составляет 1000 : 1 или более. Логарифм				ный квадрат без номера).
этого отношения называют			количественным	Если такой блок встречается с большей ча-
показателем сцепления.				стотой в группе пациентов с заболеванием
Четыре кривые		количественного показателя		по сравнению с контролем, можно предполо-
сцепления представляют графическое ото-				жить, что соответствующая область отвечает
бражение	результатов анализа сцепления.			за восприимчивость к изучаемому заболева-
Кривая а соответствует отсутствию сцепления,				нию. (Рис. из: T. Berulava, Эссен, 2013 г., с раз-
кривая б	соответствует рекомбинационной			решения.)
фракции Θ = 0,15 (15% рекомбинации), кри-

вая в соответствует вероятному отсутствию сцепления, а кривая г — неокончательному сцеплению. (Рис. из: Emery, 1986.)

Б. Использование гаплотипов для анализа сопряженности

Анализ генетической сопряженности позволяет определить, наследуются ли определенные аллели чаще, чем должны, исходя из их частоты в популяции. Такое отклонение называют неравновесным сцеплением. Его можно определить, используя набор связанных полиморфных вариантов ДНК (однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП), см. с. 88), называ-

Сцепление генов и анализ сопряженности

135

136 Общая генетика

ГЕНЕТИКА КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПРИЗНАКОВ

Многие фенотипы представляют собой не качественные различия, а количественные признаки, например рост, артериальное давление и др. Имеет место и взаимодействие с факторами внешней среды. За такие признаки отвечает не один локус гена, а два, три или более локусов (их называют локусами количественных признаков). В таких случаях говорят о многофакторном (комплексном) наследовании. Количественные признаки имеют непрерывное распределение у разных индивидов. Наследование кодирующих такие признаки генов невозможно проследить по отдельности. Ф. Гальтон (1822–1911) в 1883 г. предложил концепцию количественных методов изучения наследственности, которая радикально отличалась от методов Менделя, основанных на изучении качественных различий фенотипов.

A. Длина венчика Nicotiana longiflora

Табак Nicotiana longiflora представляет собой пример модельного объекта для изучения наследования количественных признаков. При скрещивании родительских растений, длина венчиков которых составляет 40 и 90 см, в следующем поколении (F1) у растений венчики более длинные, чем у родительского растения с коротким венчиком, и более короткие, чем у родительского растения с длинным венчиком. В поколении F2 можно наблюдать все варианты длины венчика — от самых коротких до самых длинных. Если скрестить растения всех типов (с коротким, средним и длинным венчиками), распределение длин венчиков в поколении F3 будет таким же, как у родительских растений. У них будут короткие венчики (рисунок слева), длинные венчики (справа) или средние венчики (в центре). Это можно объяснить различиями в распределении генов, обеспечивающих изменчивость признака. (Рис. из: Ayala & Kieger, 1984.)

Б. Влияние числа генных локусов на количественный признак

Для родительского поколения P показаны четыре ситуации с 1, 2, 3 и 4 локусами и двумя парами аллелей A и a. Гипотетические генотипы aa и AA, aabb и AABB, aabbcc/AABBCC и т. д. в поколении F1 выглядят одинаково. В поколении F2 количество различающихся групп зависит от количества вовлеченных генов (один для 1, два для 2, три для 3, четыре или более

для 4). Если признак кодируют четыре локуса или более, численность групп различается незначительно. Это напоминает непрерывное распределение, как показано в нижней части правого рисунка. Кривая распределения соответствует нормальному распределению (распределению Гаусса). Фенотипическая дисперсия (VP) представляет собой сумму генетической дисперсии (VG) и экологической дисперсии (VE). Отношение VG/VT называют наследуемостью. Однако во многих случаях такие типы отклонений проанализировать невозможно, особенно у человека.

Медицинская значимость

Многие сравнительно часто встречающиеся заболевания и связанные с ухудшением здоровья состояния обусловлены взаимодействием количественных признаков и факторов окружающей среды. Примерами стандартных количественных генетических характеристик у человека служат рост, масса тела, цвет глаз

икожи, артериальное давление, концентрация глюкозы и липидов в плазме, интеллектуальные способности, поведенческие паттерны

идр. Сахарный диабет, повышенное артериальное давление, ишемическая болезнь сердца, психические расстройства и некоторые врожденные аномалии — это примеры связанных с количественными признаками заболеваний.

При таких заболеваниях риск их возникновения у сиблингов или потомства невозможно оценить, используя законы Менделя. Для оценки используют эмпирические популяционные методы.

Генетика количественных признаков

137

138	Общая генетика
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЛЕЛЕЙ				лей в популяции используют простое биноми-
В ПОПУЛЯЦИИ				альное выражение (p + q)2 = 1. Соответственно
				распределение генотипов в популяции можно
				рассчитать с помощью уравнения p2 + 2pq +
Распределение генотипов у потомков роди-				+ q2 = 1, где p2 соответствует частоте гомози-
телей с разными аллелями, рассмотренными				гот AA, 2pq соответствует частоте гетерозигот
на с. 128, может различаться в зависимости				Aa, а q2 — частоте гомозигот aa. Такое урав-
от их относительной частоты в популяции.				нение назвали законом	Харди–Вайнберга.
Исследование генетического состава попу-				Если частота аллеля известна, частоту опре-
ляции — это часть популяционной генетики.				деленного генотипа можно рассчитать сле-
Основная задача подобных исследований со-				дующим образом: при условии, что частота
стоит в том, чтобы оценить частоту аллелей				p аллеля A равна 0,6 (60%), частота q аллеля

различных генных локусов в природных попу-				а будет равна 0,4 (40%, получено из равенства
ляциях и сделать выводы о их возможном из-				q = 1 – p или 1 – 0,6). Таким образом, частота
бирательном влиянии, что может объяснить				генотипа AA равна 0,36, частота генотипа Aa
наблюдаемые		различия. Популяцию можно		равна 2 0,24 = 0,48, а частота генотипа аа со-
охарактеризовать, основываясь на частоте ал-				ставляет 0,16 (2). Если возможно определить
лелей в определенных генных локусах. Сейчас				только гомозиготы аа (например, при наличии
такую информацию получают путем полно-				заболевания, наследуемого по аутосомно-
геномного секвенирования ДНК			множества	рецессивному типу), то q2 (в данном примере
представителей популяции.				это 0,16) соответствует частоте заболевания.
A. Ожидаемая частота генотипов				По формуле p = 1 – q также можно определить
				частоту гетерозигот (2pq) и частоту здоровых
у детей, родители которых				гомозигот (p2).
имеют разные генотипы				Медицинская значимость
Для пары аллелей A (доминантный) и a (ре-
цессивный)		возможны шесть	вариантов	При генетическом консультировании генотип
комбинаций родительских генотипов (1–6).				здорового сиблинга лица с аутосомно-ре-
У каждого из них распределение генотипов				цессивным заболеванием	можно оценить,
у потомства происходит в соответствии с за-				исходя из распределения генотипов 1 : 2 : 1.
конами Менделя (см. рис.). Такое распреде-				Поскольку здоровый сиблинг не может быть
ление можно наблюдать только в том случае,				гомозиготным по мутантному аллелю, вероят-
если в скрещивании принимают участие все				ность гетерозиготности составит 2/3 (66%), что
генотипы и ни один из них не элиминирован				следует из соотношения 2 : 1.
из-за тяжелого заболевания. Частота каждого
типа скрещивания зависит от частоты аллелей
в популяции.

Б. Частота аллелей

Частота аллеля — это доля определенного аллеля в определенном локусе в популяции. Если на аллель приходится 20% от всех аллелей, присутствующих (в данном локусе) в популяции, его частота составляет 0,20. Частота аллелей определяет частоту генотипов в популяции.

Например, для генного локуса с двумя аллелями А и а возможны три варианта генотипов: АА, Аа и аа. Суммарная частота для обоих аллелей (p — частота аллеля A, q — частота аллеля a) составляет 1,0 (100%). Если два аллеля А и а встречаются одинаково часто (доля каждого составляет 0,5), то частота p = 0,5 для аллеля А и q = 0,5 для аллеля а (1). Таким образом, уравнение p + q = 1 определяет популяцию для данного локуса. Для расчета частот двух алле-

Распределение аллелей в популяции

139

140 Общая генетика

ЗАКОН ХАРДИ–ВАЙНБЕРГА

При случайном скрещивании менделевское расщепление аллелей обеспечивает постоянство частоты генотипов в каждом новом поколении. Это называют законом Харди– Вайнберга, который сформулировали независимо друг от друга британский математик Г. Х. Харди и немецкий врач В. Вайнберг в 1908 г. Однако, если спаривание неслучайно, частоты будут увеличиваться или уменьшаться.

A. Постоянство частоты встречаемости аллеля

Аллель, наследуемый по аутосомно-рецес- сивному типу (аллель а), который у гомозигот вызывает тяжелое заболевание, не проявляется у гетерозигот в популяции. Можно выявить только гомозиготы (аа) вследствие развития заболевания. Частота пораженных индивидов (гомозиготы аа) зависит от частоты аллеля в популяции (q). Частоту трех генотипов рассчитывают по формуле (p + q)2 = 1, где р — это частота аллеля А, а q — частота аллеля а (см. предыдущую страницу). Гомозиготы аа элиминируются из-за заболевания в одном из поколений, на смену им приходят новые мутации. Таким образом, элиминация из-за заболевания и частота мутации находятся в равновесии.

Б. Некоторые факторы, способные повлиять на частоту встречаемости аллеля

Равновесие Харди–Вайнберга наступает только при определенных условиях. Во-первых, должен отсутствовать отбор по какому-либо генотипу (случайное скрещивание). Отбор, при котором в популяции увеличивается доля определенных гомозигот, приводит к повышению частоты имеющего преимущество аллеля (см. следующую страницу). Во-вторых, неслучайное скрещивание также меняет частоту аллеля (соотношение между p и q). В-третьих, рост частоты мутаций приводит к увеличению частоты мутантного аллеля. В-четвертых, в пределах небольшой популяции изменение частоты может происходить вследствие случайных флуктуаций. Это называют дрейфом генов.

Частота аллеля может измениться и по другим причинам. Если численность в популяции резко сократилась (эффект бутылочного горлышка), а затем снова начала увеличиваться, то частота редко встречавшегося в прошлом аллеля

может случайным образом начать расти, и он может стать относительно распространенным. Такое явление называют эффектом основателя. (Фотография из: Coney Idland 1938, с разрешения A. Felling.)

Медицинская значимость

Уравнение Харди–Вайнберга позволяет рассчитать частоту гетерозигот по аутосом- но-рецессивному заболеванию (p + q = 1). Например, если частота заболевания равна 1 : 10 000 (0,01%), то q2 = 1/10 000, а q = 1/100. Поскольку 2pq — это частота гетерозигот, она составляет 1 : 50, так как 2pq = 2 1 1/100. В замкнутых человеческих популяциях часто наблюдается эффект основателя в отношении некоторых редких аутосомно-рецессивных заболеваний.

Закон Харди–Вайнберга

141

142	Общая генетика
ГЕОГРАФИЧЕСКОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ		распространена в тропических и субтропиче-
АЛЛЕЛЕЙ		ских регионах (1). Раньше ее считали обычным
		заболеванием для Средиземноморского ре-
		гиона, однако здесь частоту малярии удалось
Человеческие популяции из разных географи-		снизить благодаря успешной профилактике.
ческих регионов различаются по частоте мно-		В других эндемичных по малярии регионах
гих аллелей. Это результат миграции наших		распространено несколько типов гемоглоби-
предков в разные части света в процессе эво-		нопатий (2, 3). Типичные примеры таких за-
люции. Генетическое разнообразие определя-		болеваний — серповидноклеточная анемия
ют различия в частоте полиморфных последо-		(OMIM 141900) и различные типы талассемии
вательностей ДНК и в частоте определенных		(OMIM 187550). В 1954 г. Э. Эллисон предпо-
аллелей в различных генных локусах. Частота		ложил, что люди, гетерозиготные по вызыва-
аллелей в различных генных локусах. Частота		ложил, что люди, гетерозиготные по вызыва-
некоторых мутантных аллелей может сильно		ющей серповидноклеточную анемию мутации,
варьировать. Таким образом, аутосомно-ре-		менее восприимчивы к малярии. Это был пер-
цессивные заболевания, распространенные		вый и наиболее яркий пример эволюционного
в одной популяции, могут редко встречаться		преимущества гетерозигот у человека.
в других популяциях. Это результат как случай-		Вызывающая серповидноклеточную анемию
ных флуктуаций частоты некоторых аллелей,		мутация появилась независимо не менее чем
так и отбора в пользу определенного аллеля.		в четырех регионах и закрепилась благодаря
A. Различия в частоте аллелей		эволюционному преимуществу гетерозигот.
A. Различия в частоте аллелей		Существуют и другие связанные с аномалиями
Финляндия представляет собой пример не-		эритроцитов заболевания, обеспечивающие
большой популяции, в которой некоторые ред-		устойчивость гетерозигот к малярии: недо-
кие рецессивные заболевания встречаются		статочность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
чаще, чем где-либо еще. Наиболее вероятной		(OMIM 305900) и X-сцепленная анемия, кото-
причиной этого может быть эффект основа-		рая приводит развитию тяжелой анемии у муж-
теля в сочетании с генетической изоляцией.		чин, в то время как гетерозиготные женщины
Вот три заболевания, высокая частота которых		остаются здоровыми и получают защиту от ма-
характерна для разных регионов Финляндии:		лярии. Отбор в пользу гетерозигот при указан-
врожденная дистрофия роговицы (врожденная		ных генетически детерминированных заболе-
дистрофия роговицы 2-го типа, OMIM 217300)		ваниях происходит из-за того, что в их крови,
для западной части страны (1); врожденный		в отличие от крови здоровых гомозигот, соз-
нефротический синдром (OMIM 256300) для		даются неблагоприятные условия для размно-
юго-западной части страны (2); диастрофи-		жения малярийного паразита. Такую защиту
ческая дисплазия (OMIM 222600) для юго-вос-		гетерозиготы получают за счет пораженных
точных областей (3). Вызывающие указанные		гомозигот, страдающих от одного или несколь-
заболевания рецессивные мутантные алле-		ких видов гемоглобинопатий. Преимущества
ли, по-видимому, возникли независимо друг		становятся очевидными на уровне популяции.
от друга в разных регионах, где жили предки
заболевших. Объяснить, каким образом такие
аллели у гетерозигот получили преимущество
при отборе и почему они встречаются с та-
кой частотой, не представляется возможным.
Различия	в распространенности позволяют

предположить лишь время и место возникновения мутации. Схожие примеры можно привести для многих других регионов и популяций. (Рис. из: Norio, 1981.)

Б. Малярия и заболевания, связанные с нарушением структуры гемоглобина

Распространенность паразитического заболевания малярии тесно связана с распространенностью различных типов генетических заболеваний, обусловленных нарушением структуры гемоглобина (см. с. 366). Малярия широко

Географическое распределение аллелей

143

144 Общая генетика

БЛИЗКОРОДСТВЕННОЕ

СКРЕЩИВАНИЕ

Близкородственное скрещивание у человека — это браки между лицами, состоящими

вкровном родстве друг с другом. Если у родителей есть хотя бы один общий предок

впоследних двух–четырех поколениях, велика вероятность того, что аллель, при-

сутствующий в гетерозиготном состоянии у обоих родителей, станет гомозиготным у их потомка. Это называют кровосмешением (т. е. родители «одной крови»). Из-за того что аллели унаследованы от общего предка, их называют идентичными по происхождению. Показатели, характеризующие степень близкородственности, — это коэффициент отношения (r) и коэффициент инбридинга (F). Коэффициент отношения (r) служит мерой оценки степени кровного родства у двух людей. Коэффициент инбридинга — это показатель вероятности появления в популяции гомозигот по двум аллеям.

A. Простые типы родственных браков

Браки между братом и сестрой или отцом и дочерью называют инцестом (1). Для обозначенных как А и В двух аллелей, наследуемых от обоих родителей, вероятность их передачи каждому из двух потомков (C и D) составляет 0,5. Сиблинги (C и D) наследуют половину родительских генов, что соответствует коэффициенту отношения 1/2. Вероятность гомозиготности по данному локусу у их потомков составляет 1/4 (по 1/2 от C и D к E).

Доля общих генов у двоюродных родственников составляет 1/8 (2), а у троюродных — 1/32. Вероятность гомозиготности у потомства двоюродных родственников равна 1/16. Браку между дядей и племянницей (3) соответствует коэффициент отношения r = 1/4, поскольку у них присутствует 1/4 общих генов. Для их потомства вероятность гомозиготности составляет 1/8. Возможность передачи мутантного аллеля в этом локусе от не связанного родством индивида можно не принимать во внимание.

Б. Идентичность по происхождению

Данный термин применяют к областям генома, которые идентичны, потому что унаследованы от общего предка. Например, при наличии двух аллелей А и В у предка I и аллелей C и D у предка II вероятность наследования следующим поколением равна 0,5 (1/2) для каждого

аллеля. Это относится и к следующему поколению, представленному индивидами III и IV. В итоге вероятность передачи аллеля от III к V

иот IV к V также равна 0,5, или 1/2. Число шагов (вероятность передачи) от I к III и от I к IV составляет (1/2)2. Однако, для того чтобы обеспечить гомозиготность индивида V, необходимо, чтобы оба аллеля были переданы от I к III

ик IV. Это соответствует вероятности передачи (1/2)4. Чтобы индивид V был гомозиготен из-за идентичности по происхождению, вероятности (1/2)4 нужно сложить и умножить на вероятность (1/2), что в итоге дает 1/16.

Медицинская значимость

Родственные браки приводят к возникновению гомозиготности по вызывающему заболевание аллелю, который присутствует у гетерозиготных родителей. Вероятность появления гомозиготного потомства у двоюродных родственников, имеющих коэффициент отношения r = 1/8 (0,125), составляет 0,312 (3,12%). Хотя на первый взгляд вероятность кажется высокой, на уровне всей популяции он ничтожно мал. В целом риск развития какого-либо заболевания у новорожденного оценивают как 1–2%. Несмотря на то что кровные браки широко распространены в некоторых популяциях, где они могут составлять от 25 до 40% браков, обычно этот показатель также не превышает 1–2%.

Близкородственное скрещивание

145

146	Общая генетика
БЛИЗНЕЦЫ ИПРОЦЕСС				встречаются	у монозиготных близнецов
ИХ ОБРАЗОВАНИЯ				(по сравнению с дизиготными). Аномалии
				можно разделить на три группы: (1) неполное
				или позднее разделение (торакопаги, близ-
У человека близнецов выявляют при ультразву-				нецы соединены в разной степени); (2) общая
ковом исследовании в одном случае на 40 бере-				кровеносная система за счет соединения шун-
менностей, однако живорожденные близнецы				том; (3) отсутствие сердца у одного из пары
появляются на свет в одном случае из 80 бере-				(акардиус). Сдавливание внутри матки из-за
менностей. Такая разница возникает из-за вну-				нехватки места может привести к появлению
триутробной гибели одного близнеца из пары				различных деформаций.
на ранних сроках беременности с последу-				В. Конкордантность у близнецов
ющей резорбцией («исчезающий» близнец).

Частота появления близнецов в разных регио-				Монозиготных и дизиготных близнецов раз-
нах сильно варьирует. Это примерно 6 из 1000				личают по частоте встречаемости у них общих
родов в Азии, 10–20 из 1000 родов в Европе				признаков (конкордантности). Когда у обоих
и 40 из 1000 родов в Африке. Близнецы могут				близнецов присутствует один и тот же при-
появиться как из одной оплодотворенной яйце-				знак, их называют конкордантными. Если
клетки (генетически идентичные монозиготные				близнецы различаются, они являются дискор-
близнецы, МЗ), так и из двух различных яйце-				дантными.	Систематические исследования
клеток (дизиготные близнецы, ДЗ). Впервые				конкордантности монозиготных и дизиготных
их различия описал К. Дарест в 1874 г. Частота				близнецов позволилои оценить относитель-
появления на свет монозиготных близнецов				ный вклад генетических факторов в этиологию
практически не меняется.				комплексных признаков. (По данным: Connor &
A. Типы монозиготных				Ferguson-Smith, 1991.)

близнецов у человека				Г. Фармакогенетические
Монозиготные		близнецы	разделяются	особенности близнецов
на очень ранних стадиях эмбрионального раз-				Дизиготных и монозиготных близнецов разли-
вития в результате разделения внутренней				чают также биохимически. Из-за генетических
клеточной массы эмбриона. Возможны сле-				различий многие химические вещества, ис-
дующие варианты разделения: (1) разделение				пользуемые в терапии, усваиваются или выво-
после образования трофобласта, приводящее				дятся с разной скоростью вследствие различ-
к формированию близнецов с отдельными за-				ной активности соответствующих ферментов.
родышевыми оболочками и общим хорионом;				Фенилбутазон выводится с одинаковой скоро-
(2) разделение после образования зароды-				стью у идентичных близнецов, в то время как
шевой оболочки, в результате которого фор-				скорость его выведения у дизиготных близне-
мируются близнецы с общим хорионом и об-				цов или сиблингов различается (Vesell, 1978).
щей зародышевой оболочкой; (3) разделение

до образования трофобласта, когда у каждого из близнецов присутствуют собственный хорион и собственная зародышевая оболочка.

У каждого из дизиготных близнецов имеются собственный хорион и одна зародышевая оболочка. В зависимости от времени разделения примерно у 66% монозиготных близнецов присутствуют общий хорион и две зародышевые оболочки (разделение после образования хориона на 5-й день, но до образования зародышевой оболочки на 9-й день). Примерно 33% монозиготных близнецов имеют два отдельных хориона и общую зародышевую оболочку.

Б. Патологические состояния у близнецов

Для близнецов характерны различные типы структурных аномалий. Такие аномалии чаще

Близнецы и процесс их образования

147

148 Хромосомы

ХРОМОСОМЫ И ГЕНЫ

В начале XX в. было установлено, что названные генами в 1909 г. наследственные факторы и окрашивающиеся в темный цвет нитевидные структуры внутри ядра эукариотической клетки, названные хромосомами в 1888 г., по сути одно и то же. Однако цитология и генетика (термин предложен в 1906 г.) как науки продолжали существовать раздельно. В 1912 г. Томас Г. Морган и его сотрудники, работавшие в Колумбийском университете в Нью-Йорке, обнаружили, что гены расположены на хромосомах в определенном порядке (генетическая карта). Это впервые удалось продемонстрировать Стертеванту в 1913 г.

A.Политенные хромосомы

Четыре представленные на рисунке хромосомы дрозофилы (хромосомы 1–3, X и Y) содержат примерно 5000 полос, специфичных для каждой хромосомы и окрашивающихся в светлый или темный цвет. Хромосомы слюнной железы дрозофилы демонстрируют определенный тип окрашивания (рис. А, внизу).

Политенные хромосомы (из множества нитей) встречаются в клетках и тканях некоторых насекомых и амфибий. Они образуются в результате многократной репликации ДНК в отсутствие деления клетки. Такие хромосомы, впервые обнаруженные Е. Бальбиани в 1881 г. в слюнных железах насекомых (Drosophila melanogaster и Chironomus), содержат области со вздутиями, названные пуфами или кольцами Бальбиани. (Рис. из: Alberts et al., 2015; Painter 1934.)

Б. Функциональные стадии политенных хромосом

Вздутия (пуфы) появляются и исчезают в определенных областях на определенных стадиях формирования политенных хромосом (1). Расширенные сегменты представляют собой содержащие активные гены области, где происходит транскрипция. Расположение и размеры пуфов меняются в зависимости от стадии эмбрионального развития. Включение в РНК радиоактивной метки (2) позволяет продемонстрировать, что в этих областях происходит активный синтез РНК как признак работы гена (транскрипции).

В. Хромосомы типа ламповых щеток в ооцитах

В ооцитах некоторых животных в диплотене мейоза на хромосомах появляются тонкие

петли (см. с. 110). Из-за их вида хромосомы с такими петлями в 1882 г. У. Флемминг назвал ламповыми щетками. Они представляют собой сильно деконденсированные хромосомные биваленты, образующиеся на стадии диплотены профазы мейоза (1). Мейотический бивалент, состоящий из двух пар сестринских хроматид, которые можно увидеть под световым микроскопом, соединяется в точках образования хиазм (2). (Микрофотография из: Gall, 1956.)

Г. Визуализация транскрипции кластеров генов рибосомной РНК

На рисунке представлены тандемные повторы генов рибосомной РНК (рРНК), транскрибируемые в ядрышке амфибии Triturus viridescens. РНК-полимераза I обеспечивает синтез множества молекул рРНК вдоль последовательности гена. Растущие молекулы РНК расположены по бокам от ДНК-оси. (Микрофотография из: Miller, 1973.)

Хромосомы и гены

149

150 Хромосомы

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ХРОМОСОМ

Структурные организации хромосом в интерфазе и митозе различаются. Как отдельные структуры хромосомы можно увидеть только во время митоза. В интерфазе они локализованы внутри ядра в виде скопления вещества, называемого хроматином. Под световым микроскопом можно увидеть области светло- и темноокрашенного хроматина разной плотности. Это гетерохроматин и эухроматин (Э. Хайц, 1928). Эухроматин — это активные гены, а гетерохроматин — молчащие гены.

A. Хроматиновые нити

Скелет метафазной хромосомы, окруженный окрашенными в темный цвет спутанными нитями, находится в центре (1). Из хромосомы были удалены гистоновые белки (см. с. 154). Нити образуют ореол из ДНК (нити темного цвета). При большем увеличении (2) можно увидеть, что ДНК состоит из одной непрерывной цепочки. (Фотографии из: Paulson & Laemmli, 1977.)

Б. Уровни структурной организации хромосом

Увеличивая масштаб, можно различить несколько уровней структурной организации, от хромосомы до ее цепи ДНК. Общая длина ДНК гаплоидной клетки человека к моменту деления составляет около 1 м. Во время митоза все эти молекулы должны быть упакованы в 23 хромосомы длиной от 3 до 7 мкм. При десятикратном увеличении плеча хромосомы (1), составляющего 10% от ее величины, становится видно, что хромосомная область такой длины может содержать около 40 генов в зависимости от хромосомного сегмента (2; представлено 8 генов). При последующем увеличении одной десятой части указанной области еще в десять раз (3) появляется область, содержащая 3–4 гена (на рисунке изображено 3 гена). При дальнейшем увеличении можно перейти на уровень отдельного гена (4), который представлен на рисунке 7 экзонами (Е1–Е7). Последний уровень структурной организации (5) — это нуклеотидная последовательность.

В. Гетерохроматин и эухроматин

В 1928 г. Э. Хайц обнаружил, что некоторые части хромосом мха Pellia epiphylla в интерфазе остаются утолщенными и сохраняют темную

окраску. Он назвал такие структуры гетерохроматином. Более светлые фрагменты, которые становились невидимыми в поздней телофазе и следующей за ней интерфазе, он назвал эухроматином. Дальнейшие исследования показали, что гетерохроматин состоит из участков с малым количеством активных генов или без них, в то время как эухроматин содержит области с активными генами. (Рис. из: Heitz, 1928.)

Г. Структурный гетерохроматин (C-окрашивание), локализованный в центромерах

Центромеры хромосом эукариот содержат повторяющиеся последовательности ДНК, называемые α-сателлитами. Они специфичны для каждой хромосомы. Такие последовательности можно увидеть в области центромеры (структурный гетерохроматин). Для их обнаружения применяют дифференциальное окрашивание (С-окрашивание). Гетерохроматин в центромерах хромосом 1, 9 и 16, а также гетерохроматин длинного плеча Y-хромосомы у разных людей имеют разную длину (хромосомный полиморфизм). (Фотография из: Verma & Babu, 1989.)

Структурная организация хромосом

151

152 Хромосомы

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ХРОМОСОМ

Эукариотическую хромосому как инструмент сегрегации описал Бенджамин Льюин в 2008 г. Во время митоза должно произойти удвоение и расхождение следующих структур: а) последовательности центромер (CEN); б) автономно реплицирующихся последовательностей (ARS, точки начала репликации); в) последовательностей теломер (TEL). Вклад каждого из указанных трех типов структурных элементов хромосом рассмотрен на примере мутантных дрожжевых клеток (пекарские дрожжи

Saccharomyces cerevisiae). Используя представленную информацию, можно сконструировать искусственные хромосомы.

A. Основные особенности хромосом эукариот

Наличие центромеры и двух теломер (по концам) является отличительным признаком хромосомы. Центромера обеспечивает прикрепление хромосомы к веретену деления во время митоза. ДНК центромеры (CEN) содержит повторяющиеся последовательности, называемые α-сателлитной ДНК. Наиболее распространенным типом являются длинные тандемные повторы мономерной последовательности из 170 пн. Общая длина ДНК центромер составляет 300–5000 тпн. Клонированные α-сателлитные фрагменты специфично гибридизуются с отдельными хромосомами, поэтому их можно применять для идентификации хромосом. Субтеломерные последовательности, расположенные поблизости от последовательностей теломер (TEN), содержат общие для разных хромосом гомологичные фрагменты (см. с. 158). Каждая хромосома имеет уникальный рисунок из темных и светлых полос (исчерченность хромосом).

Б. Функции автономно реплицируемых последовательностей

Автономно реплицируемые последовательности обеспечивают инициацию репликации ДНК

уэукариот. Это можно увидеть на примере мутантных дрожжевых клеток. Мутантные клетки,

укоторых отсутствует ответственный за синтез лейцина ген Leu, не могут расти на среде, в которой не хватает лейцина. Даже если добавить на плазмиде ген лейцина, репликация плазмиды будет невозможна из-за отсутствия автономно реплицируемой последовательности (1). Если ввести автономно реплицируемую

последовательность вместе с кодирующим лейцин геном, репликация плазмиды будет происходить в 5–20% клеток, однако расхождение плазмид по дочерним клеткам произойдет неправильно (2).

В. Последовательности центромер

Последовательности центромер необходимы для правильного распределения хромосом после удвоения в митозе. В этом можно убедиться, добавив дрожжевые центромерные последовательности в плазмиду вместе с геном Leu и автономно реплицируемой последовательностью — около 90% потомства сможет расти на среде Leu- (1), поскольку сегрегация в митозе идет нормально (2). Таким образом, последовательности центромер обеспечивают нормальное расхождение хромосом в митозе (см. с. 108).

Г. Последовательности теломер

После трансфекции дрожжевых клеток линейной плазмидой (1), содержащей ген Leu вместе с автономно реплицируемой последовательностью и последовательностью центромеры, такие клетки по-прежнему не растут (2). Это происходит из-за того, что в линейной плазмиде отсутствуют теломерные последовательности. Однако, если к обоим концам плазмиды присоединить теломерные последовательности (3) до того, как плазмида попадет в клетку (4), репликация и разделение в митозе будут происходить нормально (4). При наличии теломерных последовательностей линейная плазмида ведет себя как полноценная хромосома. (Рис. Б, В, Г из: Lodsih et al., 2016.)

Медицинская значимость

Потери или перестройки субтеломерных последовательностей являются важными причинами нарушений развития у человека, они присутствуют примерно у 5% пациентов с умственной отсталостью. (De Vries et al., 2003; Knight and Flint., 2000.)

Функциональные элементы хромосом

153

154	Хромосомы
НУКЛЕОСОМЫ		ный), менее конденсированный (частично упа-
		кованный) и декомпактизованный			хроматин
Нуклосомы — это элементарные структур-		(эухроматин). После выделения из клеточного
ные единицы хромосом эукариот. Впервые		ядра и помещения в изотонический буферный
они были описаны Р. Корнбергом, Д. Олинсом		раствор хроматин имеет вид нитей диаметром
и А. Олинсом в 1974 г. Нуклеосома содержит		около 30 нм. На электронной микрофотогра-
связывающие ДНК белки, которые принадле-		фии справа представлены конденсирован-
жат к двум классам: гистоновым и негистоно-		ный (упакованный) хроматин,		образующий
вым. ДНК оборачивается вокруг нуклеосомы.		компактные структуры размером 300–500 Å
Двойная спираль ДНК, обмотанная вокруг каж-		(вверху), частично упакованные		нити 250 Å
дой нуклеосомы, обеспечивает упаковку ДНК		(в центре) и хроматиновое волокно в виде бу-
с плотностью около 1 : 10 000.		син на нити 100 Å (внизу). (Электронная микро-
A. Нуклеосома — элементарная		фотография из: Thoma et al., 1979.)


единица упаковки хроматина		Г. Хроматиновые сегменты

Нуклеосома содержит сердцевину, представля-		Хроматин встречается в виде сегментов раз-
ющую собой гистонный октамер, в состав кото-		ной плотности. Это третий уровень структур-
рого входят по две копии H2A, H2B, H3 и H4 (1).		ной организации хроматина, упаковка нити
Вокруг бочонка из гистонов 1,7 раза оборачи-		диаметром 30 нм. Коэффициент упаковки
вается цепь ДНК (2) длиной 140–150 пн (147 пн		эухроматина	составляет 1000	(хромосомы
у человека). Линкерная ДНК длиной 8–114 пн		в интерфазе имеют примерно такой же коэф-
связывает две соседние нуклеосомы друг с дру-		фициент упаковки), а коэффициент упаковки
гом. Линкерная ДНК связана с гистоном Н1.		гетерохроматина достигает 10 000 как в ин-
Вместе накрученная и линкерная ДНК дают		терфазе, так и в митозе. (Рис. Б из: Luger et al.,
повтор длиной 157–240 пн. Четыре гистона		1997, с разрешения T. J. Richmond. Рис. Г из:
представляют собой небольшие белковые мо-		Alberts et al., 2015.)
лекулы, состоящие из 102–135 аминокислот.		Медицинская значимость
Гистоны сердцевины более чем на одну пятую
состоят из аминокислот лизина или аргинина,		Нарушения	структуры хроматина		вызывают
имеющих основные радикалы. Их положитель-		различные заболевания, в том числе некото-
ные заряды обеспечивают нейтрализацию от-		рые формы рака (см. с. 254, 328).
рицательно заряженного каркаса ДНК. Каждый
гистон сердцевины содержит N-концевую це-

почку аминокислот, выходящую за пределы каркаса из ДНК и гистонов. Чтобы стали возможны трансляция и репарация, необходимо ослабить связь между гистонами и ДНК (см. с. 196). Н4 и Н3 относятся к группе наиболее консервативных в эволюционном смысле белков. Н2А и Н2В присутствуют у всех эукариот, однако их последовательности у разных видов различаются.

Б. Пространственная структура

Трехмерная структура нуклеосомы (вид сверху), созданная на основе рентгеновской дифракционной структуры с высоким разрешением (2,8 Å), демонстрирует, что ДНК обмотана вокруг гистонового ядра. Одна цепь ДНК обозначена зеленым цветом, другая — коричневым. В центре находятся показанные разными цветами гистоны.

В. Структурно-функциональные состояния хроматина

Существует несколько уровней упаковки хроматина: конденсированный (плотно упакован-

Нуклеосомы

155

156	Хромосомы
УПАКОВКА ДНК В ХРОМОСОМАХ			держание структуры хроматина, необходимой
			для правильного функционирования клеточ-
Общая длина ДНК эукариотической клетки			ного ядра. Числами на рисунке слева (1) обо-
составляет около 1 м. Во время митоза ДНК			значены различные степени деконденсации
должна быть упакована в хромосомы длиной			хромосом (метод Монте-Карло, шаг 200, 1000
всего лишь 3–7 мкм. Это равнозначно попытке			и 400 000). (Рис. из: Bolzer et al., 2005; предо-
упаковать 401 км лондонской подземки в не-			ставлены Т. Cremer, Мюнхен, Германия.)
большой чемодан (Kakui & Uhlmann, 2017).
ДНК упакована чрезвычайно компактно. Для
изменения структуры хроматина при перехо-
де от интерфазы к митозу необходимы особые
белки, называемые конденсинами. Такие бел-
ки используют энергию гидролиза аденозин-
трифосфата (АТФ), чтобы подготовить каждую
трифосфата (АТФ), чтобы подготовить каждую
интерфазную хромосому к митозу. Две из пяти
интерфазную хромосому к митозу. Две из пяти
субъединиц конденсина		взаимодействуют
с АТФ и ДНК. Белок клеточного цикла cdc2 (см.
Регуляция клеточного цикла, с. 106) необхо-
дим для конденсации хроматина как в интер-
фазе, так и в митозе.
A. Модель упаковки ДНК
В метафазной хромосоме можно различить
шесть уровней компактизации ДНК. Все они
представлены на рисунке, от высшего уровня
к низшему. Шестой уровень — это петли с кон-
денсированными участками на метафазной
хромосоме (1400 нм). Пятый уровень — види-
мая при большем увеличении структура кон-
денсированного участка (700 нм). Четвертый
уровень — петли ДНК из хромосомного скеле-
та (разрешение 300 нм). Третий уровень — это
отдельная петля, представляющая собой хро-
матиновую нить диаметром 30 нм с плотно на-
низанными нуклеосомами. Второй уровень —
это «бусины на нитке» (11 нм). Первый уровень
компактизации хроматина — собственно двой-
ная спираль ДНК. (Рис. из: Alberts et al., 2015
и Lodish, 2016.)
Б. Расположение хромосом
в интерфазном ядре
В интерфазе отдельные хромосомы располо-
жены на определенных местах внутри ядра (2).
Т. Кремер и его сотрудники (Bolzer et al., 2005)
продемонстрировали, что хромосомы малых
размеров	располагаются	преимущественно
в центре ядра фибробласта, в то время как
крупные хромосомы находятся ближе к ядер-
ной оболочке. Измерение оптических осей
человеческих хромосом 18 и 19 показало, что
содержащая малое количество генов хромо-
сома 18 находится ближе к оболочке ядра, чем
хромосома 19. Вероятно, действуют на разных
уровнях сложные генетические и эпигенети-
ческие механизмы, чтобы		обеспечить под-

Упаковка ДНК в хромосомах

157

158 Хромосомы

ТЕЛОМЕРА

Теломеры, расположенные по концам линейных хромосом эукариот, содержат особые повторяющиеся последовательности ДНК. Последовательности состоят примерно из 2500 повторов TTAGGG. Теломеры не позволяют разным хромосомам соединяться между собой концами. Кроме того, они обеспечивают правильное завершение репликации хромосомы: поскольку синтез ДНК идет только в направлении от 5'- к 3'-концу, непрерывный синтез может происходить только на матрице 3'-5'. Это значит, что на конце матрицы 5'- 3' (отстающая цепь) синтез ДНК невозможен из-за невозможности связывания последнего РНК-праймера. Фрагмент одноцепочечной ДНК на 3'-конце, где не происходит синтез, может быть утрачен в процессе деления клетки. Справиться с этой проблемой помогает расположенный в области теломер крупный комплекс из белков и РНК, называемый теломе-

разой. Термин «теломера» произошел от греч. telos (τε_λος — конец) и merοs (μ_ρος — корень).

A. Структура теломер

Теломеры метафазных хромосом можно визуализировать методами гибридизации in situ (1). В концевой области хромосомы (длиной 6–10 тпн) можно отличить теломеру от граничащих с ней последовательностей, содержащих гены (2). Последовательности ДНК образуют одноцепочечные концы, а ферментный комплекс теломераза препятствует этому. (Рис. из: www.ucsf.edu, 29 августа 2016 г.)

Б. Репликация с участием теломеразы

Специфичные связывающие ДНК белки служат мишенью для теломеразы. Она связывается со свободным 3'-концом одноцепочечной теломерной ДНК (1) и обеспечивает элонгацию

внаправлении от 5'- к 3'-концу за счет синтеза ДНК, при котором РНК теломеразы выступает

вроли матрицы (2). После удлинения родительской цепи синтез отстающей цепи завершают соответствующие ДНК-полимеразы, действующие в обратном направлении (3).

В. Структура теломеразы

Теломераза похожа на другие обратные транскриптазы, она синтезирует ДНК на РНКматрице. Многочисленные ассоциированные с теломеразой белки («пальцы») стабилизируют область, в которой РНК работает как матрица для синтеза ДНК (см. Заболевания, связанные с дефектами теломер, с. 258). На конце

теломеры ДНК образует петлю (t-петля). Ее 3'-конец замещает 5'-конец и внедряется в двухцепочечную теломерную ДНК (не показано на рисунке). Функция теломеразы поддерживается в стволовых клетках, способных к активной пролиферации. В клетках других типов активность теломеразы снижена или отсутствует, а потери теломерной ДНК происходят при каждом делении клеток. Поэтому со временем теломеры становятся короче. Изза этого число делений, которые может претерпевать клетка, ограничено. В конце концов клетка перестает делиться и переходит в фазу репликативного старения. При этом происходит также распад защитных белков. (Рис. Б и В из: Alberts et al., 2015.)

Медицинская значимость

Смотрите главу «Заболевания, связанные с дефектами теломер» (с. 258).

Теломера

159

160 Хромосомы

ХРОМОСОМЫ В МЕТАФАЗЕ

У эукариот генетический материал клетки упакован в хромосомы. Каждая хромосома содержит непрерывную нить, представляющую собой двойную спираль ДНК. Термин

«хромосома» произошел от греческих слов χρωμα (chrōma — цвет) и σωμα (sōma — тело),

впервые его применил Г. Вальдейер в 1888 г. У прокариот единственная хромосома обычно имеет кольцевую структуру. В эукариотических клетках хромосомы расположены внутри ядра

вопределенных областях. Как впервые установил У. Флемминг в 1879 г., хромосомы можно увидеть в виде отдельных структур под световым микроскопом во время митоза. В 1956 г. Тио и Леван в Лунде, а также Форд и Хэмертон

вОксфорде установили, что у человека 46 хромосом (а не 48, как считали ранее). У каждого организма определенное число хромосом, имеющих ряд морфологических особенностей (кариотип).

A. Метафазные хромосомы человека под микроскопом

На рисунке представлено изображение метафазных хромосом человека, полученное при увеличении в 1200 раз. У диплоидных организмов хромосомы представленны парами, где одна унаследована от матери, а другая — от отца. Каждую хромосомную пару отличают длина, положение центромеры, а также размер и расположение чередующихся светлых и темных полос (исчерченность). Отдельные участки хромосомы также можно идентифицировать благодаря исчерченности. Стандартный препарат метафазных хромосом позволяет рассмотреть 400–550 отдельных полос. В прометафазе хромосомы длиннее, чем в метафазе, поэтому на них видно больше полос. По этой причине иногда хромосомы исследуют и в прометафазе. Существует целый ряд методов дифференциального окрашивания хромосом.

Б. Типы метафазных хромосом

Каждая хромосома может быть субметацентрической, метацентрической или акроцентрической в зависимости от расположения центромеры. Центромера — это точка прикрепления к веретену деления в митозе. Центромера делит субметацентрическую хромосому на короткое плечо (p — плечо, от франц. petit) и длинное плечо (q, следующая буква после «р»). У метацентрических хромосом короткое и длинное плечи имеют практически равную длину. Короткое плечо (р) акро-

центрических хромосом содержит на конце плотный участок без генов, называемый сателлитом (не следует путать с сателлитной ДНК).

В.Кариограмма

Кариограмма — это графическое изображение кариотипа. Она демонстрирует все хромосомы в виде гомологичных пар, выстроенные друг за другом в соответствии с длиной

ирасположением центромер. Пронумерованы 22 хромосомные пары (аутосомы, пары 1–22) помимо двух Х-хромосом у женщин или Х-

иY-хромосом у мужчин (кариотип 46 XX или 46 XY соответственно). 22 пары аутосом у человека делятся на семь групп (A–G). Сходство

иразличие кариотипов различных видов животных зависит от их эволюционного родства.

Медицинская значимость

Анализ хромосом в метафазе (или прометафазе) — это важный диагностический инструмент, поскольку хромосомные аберрации, связанные с изменением числа или структуры хромосом, встречаются у 1 из 400 новорожденных.

			Хромосомы в метафазе	161

162	Хромосомы
ИДЕОГРАММА ХРОМОСОМ		мального к дистальному концу (к теломере).
ЧЕЛОВЕКА		Номер полосы следует за номером области.
		Например, полосы 2 и 3 области 2 обозначены
		как 22 и 23 соответственно, а полосы 1–6 об-
Методы	дифференциального окрашивания,	ласти 3 обозначены как 31, 32, 33, 34, 35 и 36.
появившиеся в 1971 г., позволяют воспроиз-		Обозначение каждой из полос должно содер-
водимым способом визуализировать хромо-		жать информацию о хромосоме, плече и об-
сомы в метафазе или прометафазе благодаря		ласти, в которых она располагается. Таким об-
образующемуся паттерну из интенсивно и ме-		разом, 1p23 соответствует области 2, полосе 3
нее интенсивно окрашенных областей (полос).		короткого плеча хромосомы 1. Для обозначе-
Таким способом можно обнаружить структур-		ния полос, видимых при более высоком раз-
ные аберрации или генные локусы в опреде-		решении, используют десятичные знаки: если
ленных областях хромосомы. Когда в 1956 г.		в 1p21 присутствуют дополнительные полосы,
Тио и Леван, а также Форд и Хэмертон неза-		их обозначают как 1p21,1, 1p21,2, 1p21,3 и т. д.
Тио и Леван, а также Форд и Хэмертон неза-		их обозначают как 1p21,1, 1p21,2, 1p21,3 и т. д.
висимо друг от друга определили, что число		Такая система подробно описана (McGowan-
висимо друг от друга определили, что число		Такая система подробно описана (McGowan-
хромосом у человека равно 46, многие хромо-		Jordan et al., 2016). Под каждой хромосомой
сомные пары определить не удалось. Полный		указан ее размер в миллионах нуклеотидных
набор хромосом отдельного индивида или		пар.
вида называют кариотипом. На кариограмме		Медицинская значимость
хромосомы располагают в виде гомологичных		Медицинская значимость
пар. Наиболее популярный метод дифферен-		Исчерченность хромосом используют для об-
циального окрашивания — это G-окрашивание		наружения структурных аберраций и генов
(также называемое GTG-окрашиванием). Оно		методом световой микроскопии (карта генных
получило свое название от красителя Гимза,		локусов, связанных с моногенными заболева-
который наносят на препарат после обработ-		ниями, представлена на с. 408).

ки протеолитическим ферментом трипсином. К другим методам дифференциального окрашивания относят Q-окрашивание (хинакрин), R-окрашивание, С-окрашивание (структурный гетерохроматин центромер), Т-окрашивание (теломеры) и др. (см. McGowan-Jordan et al., 2016 и Приложение, табл. 1).

A.Идеограмма хромосом человека 1–12

Полоса — это область хромосомы, которая явно отличается от соседней области и после окрашивания имеет цвет другой интенсивности. На рисунке представлена схема исчерченности человеческих хромосом 1–12 (хромосомы 13–22, X и Y представлены на следующей странице), полученная в результате G-окрашивания. При стандартном разрешении в гаплоидном наборе хромосом человека можно различить около 450 отдельных полос. Существуют методы с более высокой разрешающей способностью (800 полос). Каждая хромосома делится на области, сосредоточенные в коротком (р) или длинном (q) плече. Области нумеруют в направлении от центромеры к теломерам. Например, на проксимальном коротком плече хромосомы 1 область 1, содержащая темную и светлую полосы, находится рядом с центромерой. За ней следуют области 2 и 3. Нумерация полос внутри каждой области идет в направлении от прокси-

Идеограмма хромосом человека

163

164 Хромосомы

КАРИОТИПЫ ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ

У человека 22 пары хромосом объединены в семь групп (A–G). Группа A состоит из трех пар, хромосом 1–3 — крупных субметацентрических хромосом. Группа В (хромосомы 4–5) состоит из двух пар довольно длинных субметацентрических хромосом, которые чуть короче хромосом группы А. Группа С (хромосомы 6–12) состоит только из субметацентрических хромосом. Группа D (хромосомы 13–15) содержит акроцентрические хромосомы. Группа Е (хромосомы 16–18) состоит из субметацентрических хромосом. В группе F (хромосомы 19–20) они метацентрические, а в групе G (хромосомы 21–22) короткие акроцентрические. Хромосомы X и Y не включают в группу.

A. Идеограмма хромосом человека 13–22, X и Y

На рисунке представлено продолжение схемы кариотипа человека (см. предыдущую страницу).

Б. Кариотип мыши

Умыши (Mus musculus) присутствует 20 хромосомных пар, каждая из которых имеет специфичный рисунок полос (1). Все хромосомы, за исключением Х, акроцентрические,

сцентромерами на концах.

Унекоторых линий мышей кариотип включает метацентрические хромосомы. Они образуются в результате слияния двух акроцентрических хромосом (2). На рисунке изображено слияние хромосомных пар 4 и 2 (4/2), 8 и 3, 7 и 6, 13 и 5, 12 и 10, 14 и 9, 18 и 11, 17 и 16. Хромосомные пары 1, 15 и 19 не меняются и остаются такими же, как и в стандартном кариотипе. Слившиеся хромосомы присутствуют у всех мышей из соответствующей популяции. Они представляют собой пример эволюции хромосом в результате слияния. (Рис. 1 из: Traut, 1991; рис. 2: H. Winking, Любек, Германия.)

Номенклатура хромосом человека

Номенклатура для описания сложных хромосомных изменений кратко изложена в издании «International System for Human Cytogenetic Nomenclature» (ISCN 2016; McGowan-Jordan et al.). Наиболее важные примеры приведены в Приложении (см. табл. 2).

Примеры использования номенклатуры:

46,XY — нормальный мужской кариотип; 46,XX — нормальный женский кариотип;

47,XXY —	дополнительная	Х-хромосома
в мужском	кариотипе; 45,X	— отсутствие

X- или Y-хромосомы; 47,XY,+21 — дополнительная хромосома 21 в мужском кариотипе; 2q — отсутствует фрагмент длинного плеча хромосомы 2 («+» обозначает дополнительный фрагмент); t (2;5) (q21;q31) — реципрокная транслокация между хромосомами 2 и 5 с разрывами в области 2q21 и 5q31; t (13q14q) — слияние хромосом 13 и 14; del — делеция; dup — дупликация; inv — инверсия; ins — вставка; ins (5;2) (p14;q21) — вставка фрагмента q21 хромосомы 2 в область p14 хромосомы 5; mat-, pat- — материнское или отцовское происхождение хромосомы; der — производное хромосомы, образовавшееся в результате структурных изменений; I — изохромосома; r — кольцевая хромосома; h — гетерохроматин.

Кариотипы человека и мыши

165

166 Хромосомы

ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА МЕТАФАЗНЫХ ХРОМОСОМ ДЛЯ АНАЛИЗА

Анализ окрашенных хромосом возможен только в метафазе (иногда в прометафазе). Хромосомы обычно получают из культуры лимфоцитов периферической крови. Метафазные хромосомы выделяют из культивированных фибробластов кожи, амниоцитов амниотической жидкости, а также ворсинок хориона. Клетки костного мозга в метафазе можно исследовать, не прибегая к культивированию. Лимфоциты выращивают в суспензионной культуре, стимулируя деление фитогемагглютинином — растительным лектином, способным индуцировать деление Т-лимфоцитов. Продолжительность жизни лимфоцитов ограничена несколькими делениями. Однако воздействие на культуру вирусом Эпштейна–Барр позволяет трансформировать клетки в постоянно растущую лимфобластную клеточную линию (см. с. 118).

покровным стеклом (8). Подходящие для анализа хромосомы выбирают под микроскопом при 100-кратном увеличении, а затем исследуют, применив 1250-кратное увеличение (9). Необходимо исследовать более одной клетки. В зависимости от цели исследуют 5–100 метафазных клеток (обычно 10–20). Некоторые хромосомы фотографируют и затем вырезают из фотографии (кариотипирование). Таким образом из фотографий метафазных клеток получают кариограмму (10). Анализ хромосом обычно занимает 3–4 ч в зависимости от цели исследования. Временные затраты можно значительно сократить благодаря использованию компьютерных методов.

Дополнительные методы анализа хромосом: существует широкий спектр методов, не требующих использования метафазных хромосом. Например, флуоресцентная гибридизация in situ в интерфазе (FISH), сравнительная геномная гибридизация (CGH, см. с. 234), метод Fiber FISH, сортировка хромосом методом проточной цитометрии и др.

Медицинская значимость

A. Кариотипирование клеток крови		Цитогенетические методы хромосомного ана-
Анализ	состоит из пяти основных этапов:	лиза — важный диагностический инструмент,
а) культивирования лимфоцитов; б) получения		позволяющий выявить ряд генетических за-
метафазных хромосом; в) получения препа-		болеваний с помощью светового микроскопа.
рата хромосом; г) окрашивания специальны-		При определенных обстоятельствах анализ
ми красителями для хромосом (и хроматина);		метафазных хромосом можно заменить мо-
д) исследования под микроскопом, которое		лекулярными методами, например микрома-
теперь дополняют компьютерным анализом.		тричной сравнительной геномной гибридиза-
Для анализа необходимо 2–3 мл цельной кро-		цией (см. с. 234).
ви с добавлением гепарина в пропорции 0,1
от объема крови. Гепарин добавляют, чтобы
не допустить свертывания крови. После сти-
муляции	фитогемагглютинином лимфоциты

культивируют в течение 72 ч при температуре 37 °C, чтобы они перешли в метафазу после двух делений. Митоз останавливают в метафазе, добавив производное колхицина (колцемид) за 2 ч до отбора клеток. Рост останавливается, и из культуры отбирают метафазные клетки (1). Для этого ее подвергают центрифугированию (2), добавляют гипотонический раствор хлорида калия (0,075 М) и оставляют на 20 мин (3), после чего клетки фиксируют специальным раствором (метиловый спирт и ледяная уксусная кислота в соотношении 3 : 1) (4). Фиксированные клетки отбирают с помощью пипетки, помещают на чистое обезжиренное предметное стекло и высушивают на воздухе (5). Препарат обрабатывают, чтобы получить требуемый тип полос (6), окрашивают (7), после чего накрывают препарат

Получение препарата метафазных хромосом для анализа

167

168 Хромосомы

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ			В. FISH-анализ в интерфазе
IN SITU			Интерфазное	ядро обеспечивает появление
			двух зеленых и трех красных сигналов. Наличие
			трех красных сигналов свидетельствует о при-
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)			сутствии трех хромосом 21 при трисомии 21
представляет собой сочетание цитогенетиче-			(зонды, специфичные для области 21q22.13).
ских методов с молекулярным анализом ДНК			Зеленый сигнал появляется из-за гибридиза-
(молекулярно-цитогенетический метод). ДНК			ции с хромосомными областями 13q14.2.
денатурируют (превращают в одноцепочеч-			Г. FISH-анализ транслокации
ную), после чего полученную цепь подверга-
ют гибридизации с одноцепочечным зондом,			На рисунке показана реципрокная транслока-
который гибридизуется только с комплемен-			ция между длинным плечом хромосомы 8 и ко-
тарными последовательностями. Метод был			ротким плечом хромосомы 4. Транслокация
разработан Мэри-Лу Парду и Дж. Галлом			приводит к появлению двух производных хро-

из Йельского университета в 1969 г. На его			мосом, der4 и der8. Область хромосомы 8,

основе было создано большое количество мо-			в которой произошел разрыв (q24), была по-
лекулярно-генетических методов анализа хро-			мечена с помощью искусственной дрожжевой
мосом в метафазе и интерфазе. Такой подход			хромосомы длиной 1700 кб. В результате по-
называют	молекулярно-цитогенетическим.		является три сигнала: один соответствует нор-
Традиционный метод анализа		метафазных	мальной хромосоме 8, второй — измененной
хромосом позволяет выявить потери хромо-			хромосоме 8 (der8), а третий — измененной
сомного материала примерно в 4 млн пн или			хромосоме 4 (der4). Для идентификации всех
более, в то время как FISH обеспечивает обна-			четырех хромосом были использованы специ-
ружение значительно меньших перестроек.			фичные для центромерных участков зонды.
A. Принципы FISH			(Фотография: H. J. Lüdecke, Эссен, Германия,
			с разрешения.)
Метафазные	хромосомы или	интерфазные	Д. FISH-анализ комплексных
клетки, зафиксированные на		предметном
стекле (in situ), подвергают денатурации (1а),			хромосомных перестроек
чтобы получить одноцепочечную ДНК (2).			На этом рисунке короткое плечо хромосо-
Применение меченого ДНК-зонда (1б) по-			мы 5 (5р) светится зеленым, а длинное плечо
зволяет обнаружить гибридизацию со специ-			(5q) — оранжевым. Короткое плечо хромосо-
фичным сайтом (3). Для визуализации			мы 11 (11р) окрашено в голубой, а длинное
применяют темнопольную микроскопию с ис-			плечо (11q) — в красный. В результате реци-
пользованием снабженного флуоресцентной			прокной транслокации		между	хромосомами
меткой антитела, помеченного с помощью			5 и 11 появляются производное хромосомы
биотина (4). С первичным антителом (здесь			11 (Т1) и производное хромосомы 5 (Т2) с пе-
это биотинилированное антиавидиновое ан-			рицентрической инверсией.			Используемые
титело) связывается вторичное антитело (5).			специфичные зонды гибридизуют с исследу-
Усиление результирующего сигнала обеспе-			емыми фрагментами		хромосом. Остальные
чивает применение дополнительных меченых			хромосомы	окрашены	DAPI.	(Фотографии:
антител (6).			Б — A. Scheduikat & G. Siegert, Лейпциг; В —
Б. FISH-анализ в метафазе			А. K. Teichmann, Лейпциг; Г — H. J. Lüdecke,
			Дюссельдорф, ранее Эссен; Д — G. Schwanitz,
Две метафазные хромосомы 22 гибридизуют			Бонн.)
с зондом, специфичным по отношению к цен-
тромерной области хромосомы 22 (зеленые
сигналы) и хромосомной области 22q11 (крас-
ные сигналы). Наличие двух красных сигналов
свидетельствует о присутствии нормальной

области в каждой хромосоме. В случае делеции отсутствие сигнала говорит о потере информации пораженной хромосомой. В случае дупликации появится три красных сигнала. Все прочие метафазные хромосомы окрашивают DAPI (4',6-диамидин-2-фенилиндол).

Флуоресцентная гибридизация in situ

169

170 Хромосомы

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ХРОМОСОМ МЕТОДОМ МНОГОЦВЕТНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ IN SITU

Компьютерные методы позволяют идентифицировать каждую пару хромосом в отдельности и выявлять небольшие перестройки, что невозможно при традиционном анализе метафазных хромосом. При связывании набора специфичных зондов со всей хромосомой или отдельными ее фрагментами происходит окрашивание хромосомы в определенный цвет. Чтобы исследовать больше хромосом за один раз, применяют комбинацию меток (ДНК-зонды, помеченные более чем одним флуорофором) и различные сочетания меток. Обнаружить получившиеся цвета позволяет автоматизированный цифровой анализ изображений. Особенно хорошо зарекомендовали себя два метода: многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ (FISH; Speicher et al., 1996) и спектральное кариотипирование (Schröck et al., 1996). Существуют и другие методы, например метод с использованием фибрилл ДНК (Fiber FISH).

ми флуорофоров (зонды SKY). При последующей денатурации ДНК при 37 °C в течение 24–72 ч происходит связывание зондов SKY с денатурированной (одноцепочечной) ДНК хромосомы.

Интерферометр и камеру с ПЗС-матрицей (Spectra-Cube) устанавливают на эпифлуоресцентный микроскоп, чтобы визуализировать зонды SKY. Испускаемый свет проходит через интерферометр Sagnac и фокусируется на ПЗС-матрице камеры. Так получают интерферограмму, основанную на разнице оптических путей разделенного светового луча, измеренной для каждого пикселя изображения. Итоговый уникальный спектр каждой хромосомы, полученный из необработанной спектральной информации, отображают в виде RGB-изображения (красный, зеленый, синий) метафазы и используют для автоматической классификации хромосом. Все пиксели изображения с одинаковыми спектрами обозначают определенным цветом, что позволяет выявить структурные и численные хромосомные аберрации. Спектральное кариотипирование широко используют для диагностики в клинической и онкологической цитогенетике.

Медицинская значимость

A.Многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ (М-FISH)

Многоцветная FISH (Speicher et al., 1996) предполагает применение наборов специфичных зондов, гибридизующихся с денатурированными метафазными хромосомами. Каждый зонд заключен в искусственную дрожжевую хромосому и помечен при помощи комбинации связывающихся с ДНК флуоресцентных красителей, специфичных для каждой хромосомы. Использование пяти различных флуорофоров дает 24 сочетания для анализа методом эпифлуоресцентной микроскопии с применением снабженной ПЗС-матрицей камеры. Специальное программное обеспечение формирует псевдоцветное изображение каждой хромосомы.

Б. Спектральное кариотипирование

Метод спектрального кариотипирования (SKY; Schröck et al., 1996) представляет собой комбинацию из световой микроскопии, Фурьеспектроскопии и применения камеры с ПЗСматрицей.

Сначала все 24 хромосомы человека (хромосомы 1–22, X и Y) разделяют проточным способом, после чего обрабатывают одной или несколькими (по возможности пятью) смеся-

Компьютерный цитогенетический анализ широко используют для выявления структурных хромосомных аберраций в тех случаях, когда разрешающей способности световой микроскопии недостаточно.

Идентификация хромосом методом многоцветной флуоресцентной гибридизации

171

172	Хромосомы
АНЕУПЛОИДИЯ		одна дочерняя клетка получает две хромосомы
		вместо одной, в то время как другая дочерняя
Термин «анеуплоидия», предложенный Так-		клетка остается без хромосом (на рисунке изо-
хольмом в 1922 г., обозначает отклонение		бражена лишь одна пара хромосом). В итоге
от нормального числа хромосом в результате		образуются гаметы, содержащие две хро-
утраты или приобретения одной или несколь-		мосомы (дисомия) или не содержащие хро-
ких хромосом. Утрату хромосомы называют		мосому (нуллисомия). Если нерасхождение
моносомией, а появление дополнительной		имеет место в мейозе II, первое мейотическое
хромосомы — трисомией. Анеуплоидия воз-		деление (см. с. 112) идет нормально. Однако
никает вследствие нерасхождения хромосом		во время второго мейотического деления
в мейозе (см. с. 110). Нерасхождение впер-		одна дочерняя клетка получает две хромосомы
вые обнаружил К. Бриджес у плодовой мушки		(дисомия), а другая не получает ни одной хро-
Drosophila melanogaster в 1913 г.		мосомы (нуллисомия). После оплодотворения
A.Трисомия удурмана		из гаметы-дисомика образуется зигота с три-

		сомией, а из гаметы-нуллисомика — зигота

А. Блейксли (1874–1954) в 1922 г. описал фе-		с моносомией.
нотипический эффект трисомии у дурмана		Г. Распространенные
(Datura stramonium). Коробочки растений,
имевших по три копии одной из 12 хромосом,		виды анеуплоидии
обладали характерным видом (фенотипом).		Существует три вида анеуплоидии: трисомия
Это	позволило предположить, что каждая	(три хромосомы) (1); моносомия (одна хро-
из 12 хромосом этого растения содержит уни-		мосома вместо двух) (2); триплоидия и тетра-
кальную генетическую информацию. (Рис. из:		плоидия (весь хромосомный набор увеличи-
Blakeslee, 1922.)		вается в три или четыре раза) (3). Триплоидия
Б. Трисомия у мышей		не является	результатом	нерасхождения
		в мейозе. Например, одна яйцеклетка может
Специфический фенотипический эффект раз-		быть оплодотворена двумя сперматозоидами
личных аутосомных трисомий можно наблю-		(диспермия),	яйцеклетка или	сперматозоид
дать у мышей. В 1970 г. А. Гропп и его сотруд-		могут иметь нередуцированный хромосомный
ники	определили профиль эмбрионального	набор в результате восстановления в первом
развития морфологических изменений и по-		или втором мейотическом делении, второе ре-
роков развития, соответствующий трисомии		дукционное тельце может сливаться с ядром
по каждой из 19 пар аутосом (1). Эмбрионы		гаплоидной яйцеклетки. При диспермии два
с моносомией погибали очень рано, в тече-		из трех хромосомных наборов имеют отцов-
ние первых 8 дней 21-дневной гестации. Срок		ское происхождение (генотип 69,XYY, 69,XXY
жизни эмбриона зависел от хромосомы, по ко-		или 69,XXX).
торой он имел трисомию. При трисомии 2, 3,
7 и 15 продолжительность жизни плода была

наименьшей, а при трисомии 13, 14, 16, 18 и 19 — наибольшей (18–20 дней). Фенотипы также различались в зависимости от того, какая из пар содержала дополнительную хромосому. На момент родов мышиный эмбрион с трисомией 12 (2) или трисомией 19 (3) демонстрировал различные признаки нарушения развития мозга по сравнению с нормальным контрольным эмбрионом. Мыши-трисомики были получены путем селекции мышей с транслокациями между различными хромосомами. (Рис. 1 из: Gropp, 1982; рис. 2 и 3: предоставлены H. Winking, Любек, Германия, с разрешения.)

В.Нерасхождение хромосом в мейозе I или мейозе II

Нерасхождение хромосом может иметь место как в мейозе I, так и в мейозе II. В мейозе I

Анеуплоидия

173

174	Хромосомы
ХРОМОСОМНАЯ ТРАНСЛОКАЦИЯ		наблюдать центрическое слияние хромосом
		14 и 21 (один случай на 1000 новорожденных)
В цитогенетике транслокация — это структур-		(1). Когда длинное плечо хромосомы 21 (21q)
ная перестройка, при которой на хромосомах		сливается с длинным плечом хромосомы 14
образуются разрывы. Такая перестройка при-		(14q) с образованием хромосомы 14q21q (2),
водит к изменению положения плеча хромосо-		возможно формирование гамет четырех ти-
мы или ее фрагмента без изменения общего		пов: нормальный, сбалансированный, дисомик
числа хромосом или генов. Обычно имеет ме-		или нуллисомик по хромосоме 21 (3). После
сто реципрокная транслокация, при которой		оплодотворения зиготы содержат только одну
два фрагмента хромосомы меняются места-		хромосому 21 (нежизнеспособность, моно-
ми. Особый тип транслокации, при котором		сомия 21), нормальный хромосомный набор,
происходит слияние двух акроцентрических		сбалансированный хромосомный набор с об-
хромосом, называют робертсоновской транс-		разовавшейся в результате слияния хромосо-
локацией в честь У. Робертсона, впервые обна-		мой или три хромосомы 21 (трисомия 21).
локацией в честь У. Робертсона, впервые обна-		мой или три хромосомы 21 (трисомия 21).
ружившего это явление у насекомых в 1911 г.		Медицинская значимость
ружившего это явление у насекомых в 1911 г.
A.Реципрокная транслокация
A.Реципрокная транслокация		Хромосомные транслокации часто служат
Реципрокную транслокацию между двумя хро-		причиной хромосомных аномалий у потом-
мосомами называют сбалансированной, если		ства и повышенного риска возникновения се-
она не приводит к утрате или приобретению		мейных заболеваний у сиблингов. Некоторые
лишнего фрагмента хромосомы в диплоидном		транслокации возникают чаще других. Около
наборе. Во время мейоза гомологичные и не-		90% транслокаций, сопровождающихся раз-
гомологичные хромосомы образуют реципрок-		рывами хромосомы 11q23, также затрагивают
ные транслокационные пары. Происходит спа-		хромосому 22q11. Вероятность таких хромо-
ривание каждой хромосомы с гомологичной		сомных перестроек может возрастать из-за
хромосомой. Однако при транслокации хромо-		сходства последовательностей ДНК, возник-
сомы не могут спариваться полностью, вместо		шего в результате удвоения участков генома
этого они образуют квадривалент. Возможны		(см. Геномные болезни, с. 252).
три варианта обмена фрагментами хромосом:
а) взаимный; б) невзаимный 1-го типа; в) не-
взаимный 2-го типа. Взаимный обмен приво-
дит к образованию сбалансированных гамет.
В результате невзаимного обмена образуются
несбалансированные гаметы.
При невзаимном обмене 1-го типа гаметы
получают	нормальную хромосому вместе

с хромосомой, образовавшейся в результате транслокации. Такие хромосомы являются несбалансированными из-за потери фрагментов или присоединения новых фрагментов.

При редко встречающемся невзаимном обмене 2-го типа происходит перемещение центромер гомологичных хромосом к одному полюсу. При этом образуются несбалансированные гаметы двух типов (сегрегация 1 : 3 и 0 : 4).

Б. Центрическое слияние акроцентрических хромосом

Робертсоновские транслокации (центрическое слияние) включают взаимодействие двух гомологичных или негомологичных акроцентрических хромосом. При слиянии гомологичных хромосом в мейозе образуются только гаме- ты-дисомики и нуллисомики. Слияние негомологичных акроцентрических хромосом встречается намного чаще. Наиболее часто можно

Хромосомная транслокация

175

176 Хромосомы

СТРУКТУРНЫЕ ХРОМОСОМНЫЕ АНОМАЛИИ

Структурные хромосомные перестройки возникают из-за одного или нескольких разрывов, нарушающих целостность хромосомы. Разрывы возникают в любой фазе клеточного цикла. Если разрыв появился в фазе G1 и не был устранен до перехода в фазу S, он затронет обе хроматиды. Такой хромосомный разрыв можно увидеть в следующей метафазе. Если разрыв появился в фазе G2, он будет присутствовать на одной из хроматид в следующей метафазе (разрыв хроматиды). Основные типы структурных хромосомных аномалий у человека — это делеция, дупликация, инверсия, изохромосома и в особых случаях кольцевая хромосома.

A.Делеция, дупликация, изохромосома

Хромосомная делеция (недостаточность) возникает из-за (1) единичного разрыва и утраты дистального фрагмента (концевая делеция) или (2) из-за двойного разрыва и утраты промежуточного фрагмента (внутренняя делеция). На молекулярном уровне концевые делеции часто несущественны, так как теломерные последовательности не содержат генов (см. с. 152). Дупликации (3) возникают преимущественно в добавочных хромосомах малых размеров. Примерно в половине случаев такие хромосомы образуются из хромосомы 15 и представляют собой инвертированные дупликации перицентрической области. Это один из наиболее часто встречающихся у человека типов структурных хромосомных перестроек. Изохромосома (4) также представляет собой инвертированную дупликацию. Образование изохромосомы происходит в том случае, когда нормальная хромосома делится поперек, а не вдоль, после чего происходит соединение двух длинных или двух коротких плеч хромосомы. В каждом случае отсутствует какое-то плечо хромосомы.

Б.Инверсия

Инверсия — это поворот участка хромосомы на 180° в результате образования двух разрывов и встраивания инвертированного сегмента. В зависимости от расположения центромеры различают перицентрическую (центромера находится за пределами инвертированной области) и парацентрическую инверсию.

В. Кольцевая хромосома

Кольцевая хромосома образуется, когда в результате двух разрывов с потерей фрагментов на обоих концах происходит соединение свободных концов. Из-за утраты дистальных сегментов кольцевая хромосома является несбалансированной.

Г.Анеусомия

При спаривании нормальной хромосомы с несущей инверсию гомологичной хромосомой в мейозе в области инверсии образуется петля (1). Если инвертированный сегмент относительно велик, внутри этой области может происходить кроссинговер (2). В дочерних клетках одна результирующая хромосома получит дупликацию сегментов А и В, а также недостаточность сегмента F (3), в то время как в другой результирующей хромосоме не будет сегментов А и В, но будет два сегмента F (4).

Д. Кольцевая хромосома в мейозе

Кольцевая хромосома в митозе и мейозе часто нестабильна, поэтому возможна ее утрата или дупликация. Кольцевые хромосомы могут образовывать новые несбалансированные хромосомные варианты. Если в митозе имеет место кроссинговер, возможно формирование дицентрического кольца. В последующей анафазе, когда центромеры расходятся к полюсам, в нескольких точках кольца образуются разрывы. Дочерние клетки получают разные фрагменты кольцевой хромосомы, что приводит к хромосомной недостаточности одних клеток и появлению дупликаций в других клетках. Кольцевые хромосомы могут быть дицентрическими.

Медицинская значимость

Структурные хромосомные аберрации служат важной причиной нарушений развития у человека. У пациентов с различными формами умственной отсталости структурные хромосомные перестройки возникают с частотой 0,7–2,4 случая на 1000. Во время пренатального скрининга дополнительные хромосомы малых размеров обнаруживают в одном из 2500 случаев.

Структурные хромосомные аномалии

177

178 Регуляция функции генов

РИБОСОМНАЯ РНК И СИНТЕЗ БЕЛКОВ

Рибосомы — это крупные рибонуклеопротеиновые комплексы, на две трети состоящие из РНК и на одну треть — из белков. На них происходит преобразование информации из мРНК в синтезируемый белок. Все синтезируемые в клетке белки в совокупности называют протеомом. Общее число необходимых для обеспечения жизнедеятельности белков у эукариот составляет около 90 000. Рибосомы являются продуктами отдельных рибосомных генов.

A. Структура и компоненты рибосомы

Рибосомы у прокариот и эукариот состоят из двух субъединиц — большой и малой. Для обозначения размера рибосомы используют коэффициент седиментации (70S для прокариот, 80S для эукариот). Коэффициент седиментации, т. е. скорость осаждения при ультрацентрифугировании суспензии в градиенте плотности, измеряют в единицах Сведберга (S); значения коэффициента седиментации не являются аддитивными.

Размер малой субъединицы у прокариот составляет 30S, а размер большой — 50S. Прокариотическая рибосома состоит из трех разных молекул рибосомной РНК (рРНК) размером 5S, 23S и 165S, а также из 55 белков. Бактериальная клетка содержит около 20 000 рибосом, которые составляют около 25% от массы клетки. Субъединица 30S, содержащая крупную молекулу рРНК (16S рРНК) и 21 белок, представляет собой сайт расшифровки генетической информации. Кроме того, она обеспечивает коррекцию. Субъедница 50S обладает пептидилтрансферазной активностью. Весь комплекс рибосомы имеет массу 2,5 млн Да (МДа).

Более крупная рибосома эукариот (80S, 4,2 MДа) состоит из двух субъединиц — 40S и 60S. Субъединица 60S содержит рРНК размером 5S, 5,8S и 28S (120, 160 и 4800 аминокислот соответственно), а также 50 белков. Субъединица 40S содержит рРНК 18S (1900 аминокислот) и 33 белка. У бактерий структуру субъединиц 30S и 50S удалось установить с разрешением 5 Å.

Б. От гена к белку

Транскрипция и процессинг первичного транскрипта (сплайсинг) происходят в ядре. Стабилизацию РНК обеспечивает связыва-

ние с ядерными РНК-связывающими белками внутри ядра. Зрелая РНК выходит из ядра в цитоплазму, где она образует комплексы с рибосомами, на которых происходит трансляция и синтез соответствующей последовательности аминокислот.

В. Ядрышко и синтез рибосом

Ядрышко — это морфологически и функционально обособленная область ядра клетки, в которой происходит синтез рРНК и сборка субъединиц рибосом. Гены рРНК (у человека 200 копий на гаплоидный геном) транскрибирует РНК-полимераза I с образованием молекул-предшественников рРНК 45S. Такие молекулы образуют комплексы с вышедшими из цитоплазмы рибосомными белками. Перед тем как выйти из ядрышка в цитоплазму, они расщепляются, образуя три или четыре субъединицы рРНК, которые попадают в цитоплазму вместе с синтезированными отдельно 5S рРНК. В цитоплазме происходит образование функциональных рибосом. РНК двух типов выполняют важную функцию. Малые ядерные РНК — это семейство молекул РНК, способных специфично связываться с некоторыми малочисленными ядерными рибонуклеопротеидами, которые в свою очередь необходимы для модификации молекул РНК после транскрипции (посттранскрипционная модификация). Малые ядерные РНК спариваются с предшественниками мРНК и между собой в процессе сплайсинга мРНК, а также участвуют в процессинге предшественников рРНК и сборке рибосом. (Рис. из: Alberts et al., 2015.)

Медицинская значимость

Мутации в генах, кодирующих небольшие рибонуклеопротеиды, служат причиной ряда заболеваний человека. Различные химические соединения, встречающиеся в природе в виде ядов или синтетических продуктов, используют для лечения рака путем ингибирования транскрипции или трансляции.

					Рибосомная РНК и синтез белков	179

180 Регуляция функции генов

ЭТАПЫ ТРАНСКРИПЦИИ

Транскрипция (см. с. 68) происходит в несколько этапов. РНК-полимераза II обеспечивает транскрипцию кодирующих белки генов и большого количества некодирующих РНК. При транскрипции двойная спираль ДНК на время раскрывается и матричная цепь участвует в синтезе цепи РНК. Этот процесс начинается и заканчивается в определенных точках. Синтез РНК осуществляется в направлении от 5'- к 3'-концу.

A. Транскрипция с участием РНК-полимеразы II

Транскрипция осуществляется в четыре этапа. Первый этап — это распознавание мишени и связывание РНК-полимеразы II со специфичной последовательностью ДНК, называемой промотором (1). Затем двойная спираль раскрывается и комплекс инициации готовит матричную цепь к спариванию. Инициация (2) начинается с синтеза первых молекул РНК в области комплекса инициации. Для инициации необходимо присутствие нескольких белков, которые в совокупности называют активаторами и факторами транскрипции. Элонгация (3) начинается в тот момент, когда РНК-полимераза перемещается вдоль молекулы ДНК, удлиняя цепь РНК. По мере ее продвижения хеликазы продолжают раскручивать двойную спираль ДНК. ДНК, которая уже прошла транскрипцию, снова образует двойную спираль. На этапе терминации (4) РНК-полимераза уходит от цепи ДНК. В этот момент завершается формирование нестабильного первичного транскрипта. Поскольку первичный транскрипт нестабилен, он сразу подвергается трансляции у прокариот и модификации (процессингу) у эукариот (см. с. 72). Все указанные процессы предполагают сложное взаимодействие целого ряда ферментов (не представлены на рисунке).

Б. Сайт связывания РНК-полимеразы

Сайт связывания РНК-полимеразы — это точка начала транскрипции. Сайт терминации обеспечивает восстановление (скручивание) молекулы ДНК. Бактериальная РНК-полимераза связывается со специфичным фрагментом ДНК длиной около 60 пн.

В. Промотор

Промотор — это последовательность ДНК, определяющая место связывания РНК-поли- меразы, с которого начинается транскрипция.

Промотор содержит	несколько фрагментов
с универсальными	последовательностями.

У эукариот транскрипция кодирующих белки генов начинается во множестве точек и сопровождается синтезом цепей из сотен пар оснований. Перед геном выше по цепи на расстоянии около 25–35 пн (по направлению к 5'-концу) расположена специфичная последовательность ДНК длиной 4–8 пн. Поскольку такие последовательности практически идентичны у всех организмов, их называют консенсусными. Одну такую последовательность называют ТАТА-бокс, так как она содержит последовательность TATA (или TAA, или TTA/G). Это высококонсервативная область. У прокариот промотор содержит консенсусную последовательность длиной 6 пн, TATAAT (называемую также блоком Прибнова в честь открывшего ее ученого), лежащую в 10 пн выше по цепи от стартовой точки. Другой фрагмент с консервативной последовательностью TTGACA находится на расстоянии 35 пн выше по цепи от гена. Такие последовательности называют сайтами –10 и –35 соответственно.

Г. Единица транскрипции

Единица транскрипции — это сегмент ДНК, лежащий между сайтом инициации и сайтом терминации транскрипции.

Д. Определение сайтов начала транскрипции

Фрагмент ДНК, в котором может находиться сайт начала транскрипции, можно проанализировать методом картирования с использованием нуклеазы S1. Эндонуклеаза S1, фермент плесневого гриба Aspergillus oryzae, разрезает одноцепочечную ДНК и РНК, но не двухцепочечную ДНК и РНК. Поэтому денатурированный и смешанный с выделенной из клетки общей РНК фрагмент ДНК, содержащий искомый ген, гибридизуется с родственной РНК и образует гетеродуплекс ДНК/РНК. Последующее расщепление S1 удаляет все одноцепочечные ДНК, что позволяет идентифицировать искомую последовательность.

Медицинская значимость

Изменения регуляторных последовательностей ДНК являются причиной ряда генетических заболеваний человека.

Этапы транскрипции

181

182 Регуляция функции генов

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ГЕННОЙ РЕГУЛЯЦИИ

Регуляторные последовательности ДНК — это области, которые взаимодействуют с ДНКспецифичными белками (факторами транскрипции) и регулируют активность генов. Существует два типа таких последовательностей — промоторы и энхансеры. Связывание фактора транскрипции с промотором — это важнейший механизм регуляции активности генов.

A. Консенсусные последовательности промотора

Последовательности ДНК промоторов высококонсервативны. В силу их функциональной важности они не терпят мутационных изменений. У прокариот две важные регуляторные последовательности расположены на расстоянии 35 и 10 пн выше по цепи (по направлению к 5'-концу) от точки начала транскрипции (Pribnow, 1975). Сайт –10 (TATA-бокс) — это 5'-TATAAT-3'. Последовательность –35 — это 5'-TATT-GACA-3' (1). Мутации в определенных точках выше по цепи от кодирующей последовательности дают разный эффект в зависимости от их вклада в транскрипцию в этих конкретных точках (2). (Рис. из: Rosenberg & Court,1979.)

Б. Сборка основных факторов транскрипции

У эукариот TATA бокс области промотора располагается на расстоянии 25–35 пн выше по цепи от точки начала транскрипции (1). В регуляции активности гена участвуют некоторые другие проксимальные элементы (факторы транскрипции). Сборка основных факторов транскрипции происходит в определенной последовательности. Сначала TFIID (фактор транскрипции D полимеразы II) связывается

собластью ТАТА (2). ТАТА-бокс распознает небольшой (30 кДа) ТАТА-связывающий белок (TBP), который является частью одной из нескольких субъединиц TFIID (связывание ДНК

сТВР не показано на рисунке). Затем с комплексом связывается TFIIB (3). После этого к комплексу присоединяются другие факторы транскрипции (TFIIH, за ним TFIIE), а за ними РНК-полимераза II (Pol II) и TFIIF. Они обеспечивают взаимодействие полимеразы II и промотора (4). Происходит активация полимеразы II за счет фосфорилирования, после чего может начаться транскрипция (5). TFIIH может

выполнять функцию хеликазы и АТФазы (аденозинтрифосфатазы). Сайт фосфорилирования — это полипептидный фрагмент, в котором фосфорилированию подвергаются радикалы серина (S) и треонина (Т).

В. Промоторы РНК-полимераз

Эукариотические клетки содержат три РНКполимеразы (Pol I, Pol II и Pol III). Каждая из них использует свой тип промотора. РНКполимераза II представляет собой комплекс массой 550 кДа, состоящий из 12 субъединиц. Ему необходим фактор транскрипции (TFIID, см. рис. Б), который связывается с расположенным выше по цепи промотором (1). Pol I имеет состоящий из двух частей промотор, первая часть расположена на расстоянии 170– 180 пн выше по цепи (в направлении 5'-кон- ца), а вторая — на расстоянии 45–20 пн ниже по цепи (в направлении 3'-конца). Последний называют основным (коровым) промотором (2). Активность Pol I обеспечивают два фактора: UPE1 (связывает расположенный выше по цепи промоторный элемент 1) и SL1. Pol III использует либо расположенные выше по цепи промоторы, либо внутренние промоторы, находящиеся ниже по цепи от сайта начала транскрипции (3). Существует три фактора транскрипции с внутренними промоторами: TFIIIA (цинковый палец, см. с. 186), TFIIIB (ТАТАсвязывающий) и TFIIIC.

Pol I действует в ядрышке, она обеспечивает синтез рибосомной РНК. На него приходится около 50–70% относительной клеточной активности. Полимеразы II и III действуют в нуклеоплазме (содержимое ядра за исключением ядрышка). На Pol II приходится 20–40% активности клетки. Она отвечает за синтез гетерогенной ядерной РНК, предшественников мРНК. Pol III отвечает за синтез транспортных РНК и других небольших РНК. Ее вклад в активность клетки наименьший (около 10%). Каждая из крупных РНК-полимераз эукариот (500 кДа или более) содержит 8–14 субъединиц и является более сложной, чем отдельная РНКполимераза прокариот.

Основные принципы генной регуляции

183

184 Регуляция функции генов

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ У ЭУКАРИОТ

Термин «экспрессия генов» относится ко всему процессу реализации генетической информации активных генов. Когда гены активны (экспрессируются) на протяжении всей жизни клетки или организма, их экспрессию называют конститутивной. Если транскрипция генов происходит только в определенных условиях, в определенных клетках или в определенное время, их экспрессию называют специфичной.

A. Уровни регуляции экспрессии

Условно можно выделить четыре уровня, на которых осуществляется регуляция экспрессии генов у эукариот. Первый и, наверное, самый важный уровень — это первичная регуляция инициации транскрипции. Второй уровень — это регуляция процессинга транскрипта в зрелую информацинную РНК (мРНК) за счет альтернативного сплайсинга (см. рис. Г). Третий уровень — это регуляция гена на уровне трансляции посредством редактирования мРНК (см. рис. Б). И наконец, на белковом уровне активность зависит от посттрансляционных модификаций. Недавно был открыт еще один механизм регуляции экспрессии генов — РНКинтерференция (см. с. 190).

Б. Редактирование РНК

Редактирование РНК обеспечивает изменение генетической информации на уровне РНК. Важный пример — это ген, кодирующий аполипопротеид (Apo) B-100, который участвует в метаболизме липидов (OMIM 107730). Указанный ген кодирует белок массой 512 кДа, состоящий из 4536 аминокислот. Синтез белка происходит в печени, откуда он попадает в кровь, где обеспечивает транспорт липидов. Apo B-48 (250 кДа), функционально родственный ему более короткий белок из 2152 аминокислот, синтезируется в кишечнике. Дезаминаза кишечника преобразует цитозин кодона 2152 CAA (глутамин) в урацил (UAA). В результате образуется стоп-кодон (UAA), который обеспечивает терминацию трансляции в этой точке.

В. Активация гена энхансером на расстоянии

Термин «энхансер» обозначает последовательность ДНК, которая стимулирует инициацию трансляции. Энхансеры действуют на ген на расстоянии. Они могут быть распо-

ложены выше или ниже по той же цепи ДНК (цис-действие) или находиться на другой цепи ДНК (транс-действие). Действие энхансера опосредовано сайтспецифичными ДНКсвязывающими белками. Согласно одной из моделей между энхансером и промотором образуется петля ДНК. При этом связанный

сэнхансером активаторный белок, например стероидный гормон, может войти в контакт

скомплексом фактора транскрипции на промоторе. Энхансеры обеспечивают тканеспецифичную или времязависимую регуляцию.

Г. Альтернативные варианты сплайсинга РНК

Благодаря альтернативному сплайсингу один и тот же ген позволяет получить разные формы мРНК. Это важный механизм создания множественных изоформ белка, кодируемых одним геном. Аминокислотные последовательности полученных белков немного различаются. Это может стать причиной небольших функциональных различий. Очень часто такие различия характерны для определенных тканей. На рисунке представлена схема альтернативного сплайсинга для гена кальцитонина (OMIM 114130). Первичный транскрипт гена кальцитонина содержит шесть экзонов. В результате сплайсинга они образуют два различных типа зрелой мРНК. мРНК первого типа, кодирующая кальцитонин, состоит из экзонов 1–4 (исключены экзоны 5 и 6), и ее синтез происходит в щитовидной железе. мРНК второго типа, содержащая экзоны 1, 2, 3, 5 и 6 (исключен экзон 4), кодирует кальцитониноподобный белок, синтезируемый в гипоталамусе (альтернативный продукт гена кальцитонина).

Альтернативный сплайсинг наглядно иллюстрирует эволюционное преимущество, поскольку он обеспечивает высокий уровень функциональной гибкости.

Медицинская значимость

Нарушения сплайсинга и изменения регуляторных последовательностей ДНК (промоторов и энхансеров) могут быть причиной некоторых генетических заболеваний человека.

Регуляция экспрессии генов у эукариот

185

186 Регуляция функции генов

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК И БЕЛКОВ

Регуляторные ДНК выполняют свою функцию благодаря взаимодействию со специфичными ДНК-связывающими белками. Регуляторные белки, играющие роль факторов транскрипции, распознают специфичные последовательности ДНК за счет точности стыковки с двойной спиралью ДНК.

A. Связывание регуляторного белка с ДНК

Обеспечивающие регуляцию гена белки распознают последовательность ДНК, не разрушая водородные связи внутри спирали. Каждая пара азотистых оснований имеет собственный донор водородной связи (на рисунке обозначен красным прямоугольником) и акцептор (обозначен зеленым прямоугольником). Такие белки связываются большой бороздкой ДНК. На рисунке представлена схема контакта между аспарагином (Asn) регуляторного белка и аденином (А) цепи ДНК. Обычно контакт «поверхность к поверхности» предполагает наличие 10–20 таких взаимодействий, что обеспечивает высокую специфичность связывания.

Б. Специфичное связывание ДНК с белком

α-Спираль связывающего ДНК регуляторного белка распознает специфичные последовательности ДНК. Многие бактериальные супрессорные белки представляют собой димерные структуры, и α-спираль каждого димера может встроиться в соседние участки большой бороздки двойной спирали ДНК. Такой структурный элемент называют элементом спираль-петля-спираль, так как две α-спирали находятся рядом друг с другом. На рисунке представлена схема взаимодействия супрессорного белка бактериофага 434 и молекулы ДНК протяженностью 1,5 оборота.

два цистеина в позициях 3 и 6 и два гистидина в позициях 19 и 23, присоединены к атому цинка и соединяют корбоксильную группу (COOH) α-спирали с одним из концов β-цепи.

Г. Связывание цинковых пальцев с ДНК

α-Спираль каждого цинкового пальца может контактировать с большой бороздкой двойной спирали ДНК, обеспечивая специфичность

иэффективность взаимодействия на отрезке в несколько витков. Невероятная гибкость регуляции генов была достигнута в процессе эволюции благодаря оптимизации числа взаимодействующих цинковых пальцев. Белки с цинковыми пальцами выполняют важные функции в период эмбрионального развития

идифференцировки.

Д. Рецепторы гормонов

Некоторые связывающие ДНК белки выполняют функцию проводников сигнала. Сигналом может быть гормон или фактор роста, обеспечивающий активацию внутриклеточного рецептора. Стероидные гормоны проникают в клетки-мишени и связываются со специфичными рецепторными белками. На рисунке представлены три схемы структуры рецептора глюкокортикоидов и его связывания с ДНК. Димерный рецептор глюкокортикоидов состоит из двух полипептидных цепей. Стабилизацию каждой из них обеспечивает ион цинка, соединенный с четырьмя цистеинами (1). Скелетная модель демонстрирует связывание димерного белка с двойной спиралью ДНК (2). Пространственная модель (3) показывает, насколько плотно спираль каждого из димеров этого белка (коричневый наверху, красный внизу) прилегает к большим бороздкам молекулы ДНК (обозначены красным и зеленым). (Рис. из: Alberts et al., 2015 и Lodish et al., 2016.)

Медицинская значимость

В. Структуры цинковых пальцев	Нарушение функции факторов транскрипции
Некоторые регуляторные белки эукариот со-	вызывает определенные заболевания, напри-
держат фрагменты, связывающие атомы цинка	мер синдром Ваарденбурга 1-го типа (OMIM
(Zn2+), образуя напоминающие пальцы струк-	193500), синдром Ваарденбурга типа 2А
туры (цинковые пальцы). Общая структура	(OMIM 193510), расстройства из-за мутаций
цинкового пальца предполагает наличие атома	MITF (связанный с микрофтальмией фактор
цинка, связанного четырьмя аминокислотами	транскрипции; OMIM 156845), а также рак (см.
полипептидной цепи. Изображенная на ри-	Ген TP53, с. 334).
сунке справа пространственная структура со-
держит связанные с цинком антипараллель-
ную β-цепь (аминокислоты 1–10) и α-спираль
(аминокислоты 12–24). Четыре аминокислоты,

Взаимодействие ДНК и белков

187

188 Регуляция функции генов

ДРУГИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ

Целый ряд ДНК-связывающих белков участвует в регуляции транскрипции у эукариот в качестве активаторов или супрессоров. При специфичном связывании ДНК и белка обычно происходит нековалентное взаимодействие атомов α-спирали белка с атомами большой бороздки двойной спирали ДНК. Геном человека кодирует около 2000 факторов транскрипции. Среди значимых групп ДНК-связывающих белков: а) гомеодоменные белки, содержащие высококонсервативную последовательность длиной 180 пн, такую как гомеобокс (см. Нохгены, с. 214); б) белки с цинковыми пальцами (см. предыдущую страницу); в) белки с лейциновой «молнией» (см. ниже); г) белки типа спи- раль–петля–спираль (bHLH) (см. предыдущую страницу).

A. Лейциновая «молния» и белок спираль–петля–спираль (bHLH)

Большинство регуляторных ДНК-связывающих белков имеет димерную структуру, которая обеспечивает двойную функцию: одна часть молекулы распознает специфичные последовательности ДНК, а другая стабилизирует молекулу. Один часто встречающийся класс белков содержит характерную структуру, называемую лейциновой «молнией». Типичный белок с лейциновой «молнией» состоит из димера с лейцинами, расположенными через каждые семь аминокислот. Таким образом, лейцины оказываются на одной стороне каждой α-спирали и взаимодействуют с расположенными поблизости большими бороздками ДНК (1). У белков bHLH связывающиеся с ДНК спиральные фрагменты в N-концевой части разделены не имеющими спиральной структуры петлями (2).

Б. Альтернативные комбинации

Белки с лейциновыми «молниями» и белки bHLH нередко встречаются в виде альтернативных комбинаций димеров, состоящих из двух различных мономеров. Это способствует существенному увеличению возможных структур. У высших эукариот белки с лейциновыми «молниями» часто играют роль медиаторов действия циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) при транскрипции. Гены, регулируемые белками такого типа, содержат сайт регуляции цАМФ (CRE), который представляет собой палиндромную последователь-

ность из 8 пн. Белок массой 43 кДа связывается с такой последовательностью-мишенью, поэтому его называют CRE-связывающим белком. Белки с лейциновыми «молниями» впервые описали Ландшульц и его сотрудники

в1988 г.

В.Активация стероидными гормонами

Транскрипционные энхансеры — это регуляторные фрагменты ДНК, усиливающие транскрипцию. Связывание рецепторного комплекса гормона со специфичной последовательностью ДНК, регуляторным сайтом, обеспечивает активацию энхансера. Она в свою очередь активирует промотор, после чего начинается транскрипция. Регуляция множества генов млекопитающих осуществляется с использованием активируемой стероидными гормонами транскрипции.

Г. Выявление взаимодействия ДНК и белков

Взаимодействие ДНК и белка можно обнаружить, применив метод футпринтинга с использованием ДНКазы I (1). В основе метода лежит наблюдение того, что белки защищают ДНК от расщепления нуклеазой в области сайта связывания белка, а вне сайта связывания ДНКаза I полностью расщепляет ДНК. Защищенные сайты проявляются в виде недостающих полос («отпечатков») после электрофоретического разделения фрагментов ДНК в полиакриламидном геле (2). В основе метода задержки в геле лежит механизм, благодаря которому комплекс ДНК-белок замедляет миграцию фрагмента при электрофоретическом разделении. (Рис. из: Alberts et al., 2015 и Lodish et al., 2016.)

Медицинская значимость

Мутации кодирующего белок bHLH гена, TWIST (OMIM 601622), вызывают акроцефалосиндактилию III типа (синдром Сетре-Хотцена, OMIM 101400).

Другие механизмы регуляции транскрипции

189

190 Регуляция функции генов

НЕКОДИРУЮЩИЕ РНК

Некодирующие РНК малых размеров регулируют экспрессию генов и защищают геном от заражения чужеродными молекулами РНК. В зависимости от структуры и функций таких молекул среди них выделяют микроРНК и короткие интерферирующие РНК. Третий тип, пмРНК, встречается только в зародышевых клетках. Более чем 1000 различных микроРНК регулируют примерно третью часть кодирующих белки генов человека. Короткие интерферирующие РНК имеют защитную функцию и обеспечивают регуляцию генов за счет индукции расщепления мРНК или подавления трансляции (РНК-интерференция).

A. Короткая интерферирующая РНК

РНК-интерференцию, открытую в 1978 г., индуцируют короткие интерферирующие РНК. Они обычно представляют собой двухцепочечную РНК из 21–23 нуклеотидов с выступающими концами длиной 2 пн с обеих сторон. Короткие интерферирующие РНК обладают высокой специфичностью по отношению к азотистой последовательности молекулы-мишени (мРНК).

Б. РНК-индуцированный сайленсинг-комплекс

Короткая интерферирующая РНК взаимодействует с белками, обладающими хеликазной и РНК-нуклеазной активностью, образуя РНКиндуцированный сайленсинг-комплекс (RISC). RISC — это сайт-специфичная нуклеаза, которая демонстрирует хеликазную и РНКазную активность при расщеплении РНК. Хеликаза раскручивает двухцепочечную РНК, а РНК-эн- донуклеаза разрезает ее.

В. Разрезание двухцепочечной РНК

Благодаря защитному механизму чужеродная двухцепочечная РНК (1), например РНК некоторых РНК-вирусов, связывается с обладающим хеликазной и РНК-эндонуклеазной активностью двухцепочечным специфичным белковым комплексом, который называют дайсером (2). Из-за хеликазной активности происходит раскручивание двухцепочечной РНК. Расположенная поблизости одноцепочечная РНК (красные стрелки) расщепляется особой рибонуклеазой III комплекса RISC (3). Результирующие короткие фрагменты (красные стрелки) затем быстро расщепляют нуклеазы клетки (4).

Г.Транскрипционный сайленсинг

При транскрипционном сайленсинге РНКинтерференция нацелена на мРНК. Белковый комплекс формирует индуцированный РНК комплекс подавления транскрипции. Он связывает комплементарные транскрипты РНК по мере их синтеза РНК-полимеразой II и расщепляет их, подавляя таким образом экспрессию гена-мишени.

Д. Функциональное воздействие РНК-интерференции

РНК-интерференцию можно использовать для подавления экспрессии выбранного гена и восстановления его нормальной функции. В приведенном на рисунке примере имеет место сайленсинг гена растущей нематоды Caenorhabditis elegans (см. с. 218). Двухцепочечная РНК, нацеленная на специфический ген, была получена путем встраивания транскрипта в плазмидный вектор в двух направлениях, смысловом и антисмысловом (1). Не получивший инъекцию зародыш развивается нормально (2а). Инъекция двухцепочечной РНК на другом рисунке препятствует нормальному синтезу мРНК (2б). Расщепляющее действие двухцепочечной РНК можно визуализировать, применив метод флуоресцентной гибридизации in situ с использованием меченого зонда из мРНК гена-мишени. Зонд гибридизуется с нормальным зародышем (показан фиолетовым, 2а), но не с получившим инъекцию зародышем (2б), у которого разрушена мРНК гена-мишени. (Рис. А–Г из: McManus & Sharp, 2002 и Kitabwalla & Ruprcht, 2002; рис. Д из: Lodish et al., 2016.)

Медицинская значимость

Поскольку РНК-интерференция обеспечивает селективное подавление экспрессии любого гена, в том числе гена с опасной мутацией, ее можно использовать для разработки терапевтических методов.

Некодирующие РНК

191

192 Регуляция функции генов

НОКАУТ ГЕНА

Нокаут — это инактивация гена в ходе эксперимента с целью исследовать его функцию у высших организмов. У животных с нокаутной мутацией, как правило у мышей, исследуемый ген инактивируют в зародышевой линии. Эффект нокаутной мутации можно изучать на разных стадиях эмбрионального развития и в постнатальный период. Результаты таких исследований используют, чтобы выявить эффект мутаций гомологичных генов человека, наблюдаемый при определенных генетических заболеваниях. Один из вариантов нокаута гена — это нокин. В этом случае нацеленная конструкция содержит нормальный ген, который вводят вместо исследуемого гена или в дополнение к нему.

A. Получение эмбриональных стволовых клеток с нокаутной мутацией

Ген-мишень, как правило, разрушают (нокаут) в эмбриональных стволовых клетках мышей, применяя гомологичную рекомбинацию с синтетическим нефункциональным аллелем. Для выделения эмбриональных стволовых клеток с разрушенным геном применяют позитивную и негативную селекцию.

К ДНК гена-мишени (1) добавляют ответственный за устойчивость к неомицину neoR бактериальный ген (2). Кроме того, к заменяющей ген конструкции за пределами гомологичной области добавляют ДНК, содержащую ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (tk+), после чего такую конструкцию вводят в эмбриональные стволовые клетки (3). Поскольку селективная среда содержит позитивный и негативный селективные маркеры, неомицин и ганцикловир (аналог нуклеотида гуанина), после негомологичной (4) и гомологичной (5) рекомбинации можно выявить клетки, содержащие ген-мишень. Случайное встраивание конструкции в другие гены (6, 7) приводит к гибели клеток (8). Направленное встраивание в ген-мишень (7), хотя и является редким событием, позволяет клеткам расти и размножаться на селективной среде (9).

Нерекомбинантные клетки и клетки с негомологичной рекомбинацией в случайных сайтах не могут расти на такой среде, поскольку остаются чувствительными к неомицину, в то время как рекомбинантные клетки обладают устойчивостью к нему (позитивная селекция). Ген, кодирующий тимидинкиназу (tk+), отвечает за чувствительность к ганцикловиру. Так как

полученные в результате негомологичной рекомбинации эмбриональные стволовые клетки содержат ген tk+, встроившийся случайным образом в различные области ДНК, они обладают чувствительностью к ганцикловиру и не могут расти в его присутствии (негативная селекция). Выживают только клетки, полученные в результате гомологичной рекомбинации, потому что они содержат ген устойчивости

кнеомицину (neoR) и не содержат ген tk+ (5).

Б.Трансгенные мыши

Эмбриональные стволовые клетки выделяют из бластоцисты мыши (1) после 3,5 дней гестации и создают клеточную культуру, которая растет на облученном фидерном слое неспособных делиться клеток (2). Отбирают эмбриональные стволовые клетки, гетерозиготные по нокаутной мутации (3). Интеграция в гомологичный сайт происходит довольно редко. Такие эмбриональные стволовые клетки получают из мышей, гомозиготных по определенному цвету шерсти (например, черному), и из мышей, развивающихся из бластоцисты (например, белые). Рекомбинантные эмбриональные стволовые клетки переносят в бла- стоцисту-реципиент (4). На ранних стадиях развития эмбрионы пересаживают мышам с ложной беременностью (5). Потомство таких мышей является химерным, т. е. содержит как нормальные клетки, так и клетки с измененным геном. Трансгенные мыши отличаются окраской — на белом или коричневом фоне у них присутствуют черные пятна (6). Химерных мышей скрещивают с гомозиготными белыми мышами (7), чтобы получить гетерозиготное по разрушенному (мутантному) гену потомство (8). При дальнейшем скрещивании гетерозиготных мышей (9) часть потомства будет гомозиготным по разрушенному гену (мыши с нокаутной мутацией). Такие мыши отличаются окраской. (Рис. из: Alberts et al., 2015 и Lodish et al., 2016.)

Медицинская значимость

Сравнение генотипа и фенотипа мыши с нокаутной мутацией и соответствующего генетического заболевания человека позволяет получить представление об эффекте мутации прежде всего в период эмбрионального развития.

Нокаут гена

193

194 Эпигенетическая изменчивость

МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК

Метилирование ДНК влияет на функциональное состояние регуляторных областей, не изменяя нуклеотидную последовательность, поэтому его относят к категории эпигенетических модификаций. Метилированные фрагменты не транскрибируются, а области, не подвергнувшиеся метилированию, присутствуют в промоторах и энхансерах экспрессируемых генов. Сайт метилирования — это цитозин. Атом водорода (Н) в позиции 5 замещает метильная группа, что приводит к образованию 5-метилцитозина (см. с. 92). Метилирование динуклеотидов CpG наследуется. Специальные ферментные механизмы обеспечивают метилирование ДНК, его поддержание или устранение.

A. Сохранение родительских схем метилирования

ДНК-метилтрансфераза 1 (DNMT1, OMIM) обеспечивает поддержание паттерна метилирования в соматических клетках. Она добавляет метильные группы к вновь синтезированной цепи ДНК. Метилированные сайты родительской ДНК (1) служат матрицей для метилирования двух новых цепей после репликации (2). Фермент осуществляет метилирование тех же сайтов, что и у родительской ДНК (3).

Б. Метилирование ДНК de novo

DNMT3A (OMIM 602769) и DNMT3B (OMIM 602900) обеспечивают метилирование новых сайтов обеих цепей ДНК. Неметилированная ДНК (1) подвергается сайт-специфичному и тканеспецифичному метилированию с участием указанных ферментов (2). Направленное разрушение генов DNMT3A и DNMT3B у гомозиготных мышей приводит к появлению тяжелых пороков развития. DNMT3C защищает мужские зародышевые клетки от транспозонной активности (не показана на рисунке).

В. Обнаружение метилированной ДНК

Некоторые рестриктазы демонстрируют чуствительность к метилированию (1). Фермент HpaII разрезает ДНК только в том случае, если соответствующая последовательность-ми- шень 5'-CCGG-3' не была метилирована (2). Фермент MspI, напротив, распознает ту же самую 5'-CCGG-3' независимо от того, имело ли место метилирование (3). Указанные особенности ферментов можно учитывать для исследования паттерна метилирования в диагностическх целях. Другие методы предполагают

идентификацию метилированных областей путем добавления бисульфита натрия, который обеспечивает дезаминирование цитозина с образованием урацила, не изменяя структуру 5-метилцитозина.

Г. Человеческий ген DNMT3B и его мутации

Мутации человеческого гена DNMT3B, кодирующего метилтрансферазу типа 3B de novo, вызывают синдром ICF 1-го типа (иммунодефицит, нестабильность центромер и аномалии строения лица, OMIM 242860). Нестабильными являются центромеры хромосом 1, 9 и 16. Ген DNMT3B (1) состоит из 23 экзонов длиной 47 тпн. Шесть экзонов подвергаются альтернативному сплайсингу. Белок (2) содержит 945 аминокислотных остатков с пятью фрагментами DNMT (I, IV, V, IX, X) в C-концевой области. Стрелками обозначены шесть различных мутаций. Одна мутация (3) превращает A в G в кодоне 809, меняя GAC (Asp) в GGC (Gly), что приводит к замещению аспарагина (Asn) глицином (Gly). Оба родителя гетерозиготны по этой мутации. Многолучевые хромосомы с множественными плечами p и q типичны для лимфоцитов человека с синдромом ICF. На рисунке представлены такие хромосомы, образовавшиеся из хромосом 1 и 16 (R-окрашивание) (4). (Рис. из: Xu et al., 2005.)

Медицинская значимость

Помимо примера, приведенного в части Г, аберрантные паттерны метилирования, возникающие в результате мутации генов, кодирующих ответственные за метилирование и деметилирование ферменты, являются причиной некоторых нарушений развития и опухолей.

Метилирование ДНК

195

196 Эпигенетическая изменчивость

ОБРАТИМЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ ХРОМАТИНА

Хроматин может существовать в одном из двух состояний: деконденсированном (эухроматин), что соответствует активной транскрипции, или конденсированном (гетерохроматин), т. е. неактивном. В дифференцированных клетках профиль транскрипции постоянен, тогда как в ходе дифференцировки он меняется. Обратимое изменение структуры (ремоделирование хроматина) — это ключевое событие в регуляции транскрипции. Локальная структура хроматина является эпигенетическим состоянием. Ремоделирование хроматина — это активный обратимый процесс, при котором гистоны нуклеосом удаляются с молекулы ДНК, чтобы обеспечить возможность репликации или транскрипции генов.

A. Модификация гистонов

Множественные изменения структуры хроматина происходят в области N-концевых фрагментов гистонов H3 и H4. Там находятся различные сайты эпигенетической модификации — метилирования, ацетилирования (введения ацильных групп) или фосфорилирования. На рисунке приведены примеры для гистонов H3 (1) и H4 (2). Триметилирование (Me3) лизина (К) гистона Н3 в позиции 4 (H3K4Me3) и ацетилирование (Ac) в позиции 27 (H3K27Ac) связаны с активностью промоторов, а метилирование H3K4Me1 (одна группа CH3) и ацетилирование H3K27Ac связаны с активностью энхансеров.

Ацетилирование активного хроматина происходит в области лизиновых оснований гистонов Н3 и Н4. Метилирование неактивного хроматина происходит в позиции лизина 9 Н3 (H3K9Me3) и других лизиновых оснований (H3K27Me3). Таким образом могут возникать различные модификации, способные влиять друг на друга. Комбинации различных сигналов называют гистоновым кодом. (По данным: Strachan et al., 2015; предоставлено B. Horsthemke.)

Б. Ацетилирование и деацетилирование гистонов

Ацетилирование гистонов сердцевины происходит при репликации ДНК и активации некоторых генов. Основными мишенями являются лизиновые основания N-концевых фрагментов Н3 и Н4. Ацетилирование гистонов происходит прямо в нуклеосомах. Медиаторами ацетили-

рования служат гистонацетилтрансферазы, которые составляют часть крупного комплекса активации (1). Ацильные группы могут быть удалены благодаря обратимому процессу, деацетилированию (2), медиаторами которого являются ассоциированные с супрессорами деацетилазы (гистондеацетилазы). Ацетилазы ассоциированы с активаторами генов. Деацитилирование и метилирование могут быть связаны друг с другом. Два метилцитозинсвязывающих белка, MeCP1 и MeCP2, обладают способностью к селективному связыванию с метилированной ДНК. Подавление транскрипции метил-CpG-связывающими белками 1 и 2 предполагает деацетилирование гистона мультипротеиновым комплексом. (Рис. Б и В из: Lodish et al., 2016.)

В. Ремоделирование хроматина

Некоторые белки-активаторы способны изменять состояние конденсированного хроматина. Это особые ДНК-связывающие регуляторные элементы, которые могут взаимодействовать с мультипротеиновыми комплексами. Белокактиватор связывается с белком-медиатором. В результате деконденсации хроматина происходит активация генов. Основные факторы транскрипции и РНК-полимераза присоединяются к промотору и запускают транскрипцию.

Медицинская значимость

Нарушение регуляции хроматина вызывает целый ряд заболеваний (см. с. 254). Мутации гена MECP2 в области Xq28 (OMIM 300005) служат причиной синдрома Ретта (OMIM 312750).

Обратимые изменения структуры хроматина

197

198	Эпигенетическая изменчивость
ГЕНОМНЫЙ ИМПРИНТИНГ				которая развивается из различных тканей
				плода (3). Ткани плаценты не формируются.
Геномный импринтинг — это эпигенетический				При триплоидии, относительно часто встре-
процесс, при котором экспрессия определен-				чающейся у человека хромосомной аномалии
ных генов зависит от того, от кого из родите-				(см. с. 398), когда появляется дополнительный
лей были унаследованы аллели. Импринтинг				хромосомный набор материнского происхож-
имеет место только в геномах плацентарных				дения (4, 69,XXX), наблюдается сильнейшая
и сумчатых		млекопитающих.	Переданный	гипоплазия плаценты и плода. (Фотографии:
по наследству паттерн импринтинга сохраня-				H. Reder, Марбург и Вена, с разрешения.)
ется при делении клеток.				В. Нормальные и нарушенные
Его устранение и восстановление в первичных				В. Нормальные и нарушенные
половых клетках зависят от пола эмбриона.				паттерны импринтинга
Существует гипотеза, что импринтинг по-				Эпигенетические изменения, ответственные
явился у млекопитающих в ответ на внутри-				за импринтинг, происходят на ранних стадиях
утробную конкуренцию за ресурсы (ситуация				эмбриогенеза. Паттерн импринтинга сомати-
родительского конфликта). Естественный от-				ческих клеток обычно зависит от происхожде-
бор действует по-разному на			материнские	ния хромосом (отцовского или материнского).
бор действует по-разному на			материнские	ния хромосом (отцовского или материнского).
и отцовские геномы. По-видимому, это обе-				Женский вариант нормального паттерна им-
спечивает баланс между расходованием ре-				принтинга обозначен красным квадратом (1).
сурсов матери и ростом плода. Известно, что				В первичных половых клетках он не проявля-
в человеческом геноме присутствует около 75				ется, а проявляется в зародышевых клетках.
импринтированных генов.				Таким образом, зигота получает правильный
A. Необходимость двух различных				паттерн импринтинга, который сохраняется
A. Необходимость двух различных				при последующих делениях клеток. В случае
родительских геномов				если паттерн импринтинга не удается изме-
В 1980 г. удалось продемонстрировать, что для				нить (2), возникает его нарушение. Это приво-
нормального		развития мышам	необходимы	дит к возникновению различных пороков раз-
геномы обоих родителей. Если женский про-				вития, в том числе синдрома Прадера-Вилли
нуклеус нормальной зиготы (1) заменить муж-				и синдрома Ангельмана (см. Болезни имприн-
ским пронуклеусом (андрогенота, 2), развитие				тинга, с. 274). Нарушение процессов установ-
будет нарушено. Редкие эмбрионы, которым				ления (3) или поддержания (4) импринтинга
удается дожить до постимплантационного пе-				также приводит к появлению аномального
риода, имеют аномалии развития и не продви-				паттерна импринтинга. Такие нарушения могут
гаются дальше стадии 12 сомитов. Нормальная				стать причиной появления в семье двух видов
зигота, напротив, развивается нормально (3).				пороков развития. (Рис. из: Horsthemke, 2010.)
Если мужской пронуклеус заменить женским				Медицинская значимость
пронуклеусом (гиногенота, 4), то около 85%				Медицинская значимость
гиногенот до стадии преимплантации будут				Нарушения процессов изменения, установ-
развиваться нормально. Однако из-за непра-				ления или поддержания импринтинга служат
вильного	формирования плодных оболочек			причиной возникновения гетерогенной группы
эмбрион гибнет; это происходит на стадии 40				болезней импринтинга (см. с. 274).
сомитов или ранее. (Рис. из: Sapienza & Hall,
2001.)

Б. Необходимость материнского и отцовского геномов

Встречающаяся в природе форма андрогенетической зиготы — это пузырный занос (1), аномальная плацента, содержащая два набора отцовских хромосом и не содержащая материнских хромосом. Имплантация происходит, однако эмбрион не развивается. Ткани плаценты образуют множество пузырей (2). Встречающейся в природе формой гиногенетической зиготы, содержащей только материнские хромосомы, является тератома яичника,

Геномный импринтинг

199

200 Эпигенетическая изменчивость

ИНАКТИВАЦИЯ Х-ХРОМОСОМЫ

УМЛЕКОПИТАЮЩИХ

Умлекопитающих инактивация большинства

генов одной или двух Х-хромосом каждой клетки организма самки происходит случайным образом. Компенсаторный механизм уравнивает экспрессию продуктов гена Х-хромосомы

вклетках XX и XY. Инактивацию Х-хромосомы инициирует центр инактивации, цис-фрагмент Х-хромосомы, регулируемый расположенным

вобласти Xq13.2 геном XIST (OMIM 314670). На ранних стадиях эмбрионального развития некодирующая РНК (Xist, специфичный X-инактивирующий транскрипт) подавляет одну из Х-хромосом в содержащих одну или более Х-хромосом клетках за счет метилирования и модификации гистонов.

A. X-хроматин

В 1949 г. М. Барр и Ч. Бертрам установили, что обнаруженные ими в нервных клетках самок кошки небольшие тельца темного цвета (1, 3) отсутствовали в клетках самцов (2). В 1954 г. Дэвидсон и Смит описали структуры, напоминающие барабанные палочки, обнаруженные в лейкоцитах периферической крови человека (4). Х-хроматин визуализируется как темная плотная масса в ядрах клеток слизистой оболочки полости рта (5).

Б. Схема инактивации Х-хромосомы

Экспрессия гена материнского происхождения Xist начинается на стадии морулы. Механизм инактивации Х-хромосомы, в который вовлечены и материнская, и отцовская Х-хромосомы, передается всем дочерним клеткам.

В. Мозаичный характер экспрессии

В 1961 г. Мэри Ф. Лайон описала мозаицизм распределения Х-сцепленной окраски шерсти у самок мышей как проявление инактивации Х-хромосомы (1). Генетические «отпечатки пальцев» гетерозиготных женщин с Х-сцепленной ангидротической эктодермальной дисплазией (OMIM 305100) также демонстрируют мозаицизм участков с нормальными потовыми железами (черные точки) и участков без нормальных потовых желез у пораженных лиц мужского пола (2). В клеточных культурах, полученных из гетерозигот женского пола с Х-сцепленной недостаточностью гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы HGPRT (OMIM 308000), колонии представляют собой либо HGPRT–, либо HGPRT+ (3).

Г. Профиль инактивации Х-хромосомы

Профиль инактивации Х-хромосомы, описанный Карреллом и Уиллардом в 2005 г., показал, что 458 (75%) генов находятся в неактивном состоянии, а 94 (15%) гена регулярно избегают инактивации. Кроме того, 65 генов (10%) находятся в неактивном состоянии у одних женщин и в активном состоянии у других. Таким образом, 25% Х-хромосомных генов человека не всегда бывают неактивны, а 10% демонстрируют индивидуальный характер инактивации. Слева от Х-хромосомы (а) девятью вертикальными линиями обозначены девять гибридов между клетками грызунов и человеческими клетками. Экспрессируемые на инактивированной Х-хромосоме гены обозначены синим, а подавляемые гены обозначены желтым. Справа (б) отображен уровень экспрессии генов инактивированной Х-хромосомы.

Д. Паттерн Х-хромосомы

Человеческая X-хромосома содержит регионы (S1–S5), возникшие в разное время на разных этапах эволюции (см. с. 246).

Медицинская значимость

Неслучайность инактивации материнской или отцовской Х-хромосомы может стать причиной появления слабовыраженных клинических симптомов у гетерозиготных по Х-хро- мосомной мутации лиц женского пола (OMIM 300087).

Инактивация Х-хромосомы у млекопитающих

201

202 Сигнальные пути

ПРОВЕДЕНИЕ СИГНАЛА В КЛЕТКЕ

Многоклеточные организмы используют широкий спектр сигнальных молекул для передачи сигналов между клетками и внутри клеток (см. с. 102). Специфичное связывание внеклеточной сигнальной молекулы (лиганда) с соответствующим рецептором клетки-мишени вызывает специфичный ответ. За этим следует ряд молекулярных событий, который назвали сигнальным путем (сигнальным каскадом).

A. Основные внутриклеточные сигнальные пути

Факторы роста — это важные сигнальные молекулы, представляющие собой большую группу секретируемых белков (1). Каждый из них с высокой специфичностью связывается с белком поверхностного рецептора клетки (2). Это приводит к активации ответственных за передачу сигнала внутриклеточных белков (3) и инициации каскада активации белков (часто за счет фосфорилирования), выполняющих функцию вторичных посредников (4). Гормоны представляют собой мелкие сигнальные молекулы (5), которые поступают из крови. Они попадают в клетки либо благодаря диффузии, либо благодаря связыванию с поверхностным рецептором (6). Некоторые гормоны связываются с внутриядерным рецептором (7). После активации факторы транскрипции (8) совместно с кофакторами обеспечивают запуск транскрипции (9). Перед началом транскрипции система распознавания повреждений ДНК и репарации (10) проверяет целостность ДНК (регуляция клеточного цикла, 11). Клетка переходит к делению в случае успешной репарации повреждений ДНК. В противном случае клетки гибнут (апоптоз, 12). (Рис. из: Lodish et al., 2016.)

Б. Рецепторы с тирозинкиназной активностью

Отдельный класс поверхностных рецепторов клетки составляют рецепторы с тирозинкиназной активностью. Они представляют собой одиночные трансмембранные белки с внеклеточным N-концевым фрагментом и внутриклеточной С-концевой частью. Внутриклеточный домен содержит фрагмент, обладающий тирозинкиназной активностью. Лиганды рецепторов с тирозинкиназной активностью — это факторы роста, которые регулируют целый ряд связанных с ростом и дифференцировкой процессов. Такие рецепторы имеют схожую структуру, но их функции различаются.

Внеклеточные связывающие лиганд домены рецепторов с тирозинкиназной активностью содержат богатые цистеином области. У некоторых рецепторов данного типа связывающие домены напоминают по структуре цепи иммуноглобулинов (иммуноглобулинподобные домены), способные связываться с другими молекулами (см. с. 312). На рисунке представлены следующие рецепторы семейства:

Эпидермальный фактор роста (OMIM 131550)

иего лиганды обеспечивают передачу сигналов, связанных с различными фукнциями клетки, такими как пролиферация, дифференцировка, подвижность и выживание.

Инсулиновый рецептор (OMIM 147670, см. с. 292).

Рецептор фактора роста фибробластов 1, 2, 3

(FGFR1, OMIM 136350; FGFR2, OMIM 176943; FGFR3, OMIM 134934; см. с. 356). Семейство рецепторов факторов роста фибробластов участвует в пролиферации клеток, дифференцировке, остеогенезе, ангиогенезе и других процессах.

Рецепторы факторов роста тромбоцитов (тип А, OMIM 173490; тип B, OMIM 173410; тип C, OMIM 608452) необходимы для ангиогенеза

инормального функционирования кровеносных сосудов.

Рецепторы RET (OMIM 164761, см. с. 266). v-erbB (вирусный онкоген, гомолог человеческого гена ERBB2, OMIM 164870). (Рис. из: Brinvanlou & Darnell, 2002.)

Медицинская значимость

Мутации генов, кодирующих рецепторы с тирозинкиназной активностью, могут стать причиной возникновения сигнала пролиферации в отсутствие фактора роста и привести к нарушениям эмбрионального развития и дифференцировки (врожденные пороки развития), а также к возникновению злокачественных новообразований. Мутации рецепторов с тирозинкиназной активностью вызывают целый ряд заболеваний человека. Мутантные фенотипы зависят от типа рецептора и характера мутации.

Проведение сигнала в клетке

203

204 Сигнальные пути

ГЕТЕРОДИМЕРНЫЕ G-БЕЛКИ

Гетеродимерные гуанозинтрифосфатсвязывающие белки, или G-белки, — это семейство связывающих гуаниновые нуклеотиды белков, обеспечивающих передачу внеклеточных сигналов в клетку посредством G-связанных рецепторов. Связывание лиганда с рецептором на поверхности принимающей клетки приводит к изменению конформации рецептора. Это обеспечивает запуск каскада, предполагающего внутриклеточную активацию и ингибирование белков, обеспечивающих передачу сигнала внутрь ядра, где происходит индукция или ингибирование транскрипции генамишени. Активация является результатом выключения ингибитора. Передача сигнала G-ассоциированными рецепторами — это механизм, используемый для передачи большинства внешних сигналов органами зрения, слуха и обоняния (см. с. 386).

A. Рецептор тирозинкиназы

Связывание лиганда активирует рецептор тирозинкиназы (см. предыдущую страницу) за счет димеризации двух соседних трансмембранных белков. В результате происходит фосфорилирование внутриклеточных тирозиновых оснований. Оно, в свою очередь, приводит к активации другой белковой мишени и к запуску сигнального каскада.

Б. G-ассоциированные рецепторы

G-белки — это тримерные связывающие гуаниновый нуклеотид белки, состоящие из субъединиц α, β и γ. Они выполняют функцию молекулярных переключателей между неактивным состоянием и кратковременной активностью. Если белок неактивен, α-субъединица связана с гуанозиндифосфатом (ГДФ). При связывании рецептора с лигандом происходит ее активация, приводящая к замене ГДФ на ГТФ. Физиологический эффект обеспечивает связывание с эффекторной молекулой. α-Субъединица представляет собой ГТФазу. Она быстро гидролизует связанный ГТФ до ГДФ. В результате α-субъединица воссоединяется с комплексом β γ, образуя неактивный G-белок. По этой причине после диссоциации α-субъединица и комплекс β γ остаются активными недолго. Задержка или невозможность возврата в неактивное состояние из-за токсина или мутации приводит к нарушению функции рецептора. Действие примерно половины существующих лекарственных препаратов

опосредовано G-ассоциированными рецепторами.

α-Субъединицы G-белков млекопитающих образуют большое семейство сигнальных молекул, способных связываться с множеством эффекторных белков. Удалось идентифицировать около 25 α-субъединиц, 5 β-субъ- единиц и 12 γ-субъединиц млекопитающих. G-ассоциированные рецепторы содержат семь или более трансмембранных сегментов, поэтому их называют серпентиновыми рецепторами.

В. Циклический аденозинмонофосфат

G-белки обеспечивают регуляцию циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в некоторых сигнальных каскадах. цАМФ (3',5'-цАМФ) содержит фосфатную группу, присоединенную к 5'- и 3'-атомам углерода рибозы.

Г. Расщепление цАМФ

Сигнал может резко повышать концентрацию цАМФ благодаря действию аденилатциклазы. цАМФ активирует протеинкиназу А. Фосфодиэстераза быстро расщепляет цАМФ с образованием неактивного АМФ. Данный механизм обеспечивает регуляцию более 100 сигнальных белков.

Медицинская значимость

Холерный токсин ингибирует гидролиз ГТФ и индуцирует постоянную активность рецептора. В клетках эпителия кишечника это приводит к массовым потерям воды и ионов хлора. Коклюшный токсин ингибирует аденилатциклазу (ингибиторный G-белок, Gi) и не позволяет α-субъединице ингибиторного G-белка взаимодействовать с рецепторами. Некоторые заболевания эндокринной системы развиваются из-за мутаций генов, кодирующих G-ассоциированные рецепторы или сами G-белки (см. Приложение, табл. 3, с. 462).

Гетеродимерные G-белки

205

206 Сигнальные пути

СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ TGFβ ИWNT/ β-КАТЕНИНА

Сигнальные пути трансформирующего фактора роста β (TGFβ) и Wnt/β-катенина — важные примеры сигнальных систем, принимающих участие в различных процессах развития и обеспечивающих ряд функций клетки.

A.Сигнальный путь TGF β

Суперсемейство TGFβ состоит из более чем 30 секретируемых димерных полипептидов со схожей структурой, участвующих в регуляции различных связанных с ростом и дифференцировкой биологических процессов. Связывание с димерным трансмембранным белком как с рецептором активирует гетеродимерный комплекс, состоящий из двух копий каждого из рецепторов типа II и типа I (на рисунке изображена только одна копия того и другого белка). Постоянно фосфорилированный рецептор типа II обеспечивает фосфорилирование домена гликогенсинтазы (GS) и активацию рецептора типа I. В результате факторы транскрипции Smad подвергаются фосфорилированию по остаткам серина и образуют комплексы с нефосфорилированными нормальными Smad (Co-Smad). Smad 4 транспортируется в ядро и связывается с ДНК-связывающими белками, чтобы инициировать транскрипцию (канонический Smadзависимый сигнальный путь). Частью неканонического сигнального пути Smad может быть сигнальный каскад Ras-MAPK (митогенактивируемая протеинкиназа, см. с. 268).

Суперсемейство белков TGFβ играет важную роль в эмбриональном развитии, дифференцировке, органогенезе, самообновлении и поддержании стволовых клеток в недифференцированном состоянии, выборе направления дифференцировки клеток и подавлении канцерогенеза. TGFβ — один из наиболее древних сигнальных путей, возникший около 1,3 млрд лет назад, до разделения членистоногих и позвоночных (см. с. 42). (Рис. из: Descotte et al., 2008.)

Б.Сигнальный путь Wnt/ β-катенин

и мышиного гена int-1). Этот ген регулирует β-катенин, который взаимодействует с другими белками, обеспечивая активацию геновмишеней. Рецептор Wnt — это белок с семью трансмембранными сегментами (Frizzled) и корецептором LRP6, представляющим собой липопротеин низкой плотности (ЛНП, см. с. 300). Связывание Wnt с Frizzled активирует белок Disheveled (Dsh). Dsh ингибирует протеинкиназу, GS-киназу 3 (GSK3). В отсутствие сигнала Wnt происходит фосфорилирование β-катенина комплексом GSK3, APC и аксина (поддерживающий белок) с последующим расщеплением (не показано на рисунке). При активации Frizzled в результате связывания Wnt нефосфорилированный β-катенин накапливается и мигрирует в ядро, где связывается с факторами транскрипции LEF (фактор связывания лимфоидного энхансера), TCF (Т-клеточный фактор) и другими, обеспечивая регуляцию генов-мишеней Wnt. На рисунке представлена схема канонического сигнального каскада, одного из трех Wnt-активируемых сигнальных каскадов. Сигналы Wnt играют важную роль в развитии (например, в гаструляции, развитии мозга, образовании конечностей и органогенезе). (Рис. из: Alberts et al., 2015.)

Медицинская значимость

Нарушение регуляции сигнального пути TGFβ имеет место при канцерогенезе и служит причиной синдрома Марфана (см. с. 358). Мутации APC встречаются в 80% рака толстой кишки у человека (см. с. 336). Ген WNT4 (OMIM 603490), возможно, отвечает за развитие яичников, а его мутации приводят к нарушению формирования мюллерова протока.

Wnt представляют собой богатые цистеином внеклеточные сигнальные гликопротеиды, участвующие в регуляции клеточного цикла, процессов роста и дифференцировки. Wingless (wg) — это связанная с нарушением полярности сегментов мутация дрозофилы (см. с. 212). Ее ортолог у позвоночных — Wnt (из wingless

Сигнальные пути TGFβ и Wnt/β-катенина

207

208 Сигнальные пути

СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ HEDGEHOG И TNF

Семейство секретируемых белков (паракринных факторов), названное Hedgehog, обеспечивает передачу сигналов, задействованных во множестве процессов развития, в частности образования конечностей у позвоночных и дифференцировки нервных клеток. Ген

Hedgehog (Hh) у плодовой мушки Drosophila —

это ген полярности сегментов (см. с. 212), кодирующий фактор транскрипции, который наряду с другими белками выполняет функцию как активатора, так и супрессора. Мутантные мушки hh напоминают ежей из-за выростов на теле. Геномы позвоночных содержат три гена Hedgehog: sonic, desert и Indian hedgehog. Факторы некроза опухолей (OMIM 191160) — это секретируемые макрофагами цитокины, обладающие цитотоксическим эффектом. Фактор некроза опухоли TNFα является элементом двух основных сигнальных путей: а) сигнальный путь активации киназы

ифактора транскрипции; б) сигнальный путь

активации каспазы при гибели клетки (апоптоз, см. с. 116). TNFα принадлежит к крупному семейству, которое у человека представлено 29 рецепторами факторов роста опухоли

и18 лигандами.

A. Сигнальный путь Hedgehog (Hh)

Сеть формируется более чем из 12 белков. Сигнал Hedgehog (Hh) представляет собой секретируемый белок-предшественник (45 кДа), является лигандом трансмембранного рецептора, названного Patched (Ptch, PTCH у человека; OMIM 601309). Patched отвечает на связывание с лигандом, обеспечивая негативную регуляцию другого трансмембранного белка, называемого Smoothened (Smo, SMOH у человека; OMIM 601500). Smoothened, белок

ссемью гидрофобными трансмембранными доменами, выполняет функцию переносчика сигнала Hedgehog. В отсутствие сигнала группа ассоциированных с микротрубочками белков (Costal 2, кинезинподобный белок, и Fused, серинтреонинкиназа) образует комплекс с эффекторным белком Ci (155 кДа). Два других белка, PKA (протеинкиназа) и Slimb, разрезают Ci на два фрагмента, один из которых подавляет транскрипцию генов сигнального каскада Hedgehog. Связывание сигнала Hh

сPtch подавляет ингибирование белком Ptch белка Smo, что, в свою очередь, обеспечивает ингибирование PKA и Slimb. В результате бел-

ки Costal 2 и Fused подвергаются фосфорилированию и активируют Ci. Активированный Ci мигрирует в ядро и инициирует транскрипцию совместно с коактиватором — белком, связывающим циклический аденозинмонофосфат (CREB/CBP), и другими факторами.

Б. Сигнальный каскад фактора некроза опухоли

Лиганды TNF и их рецепторы представляют собой тримерные белки. Внеклеточный домен TNFα состоит из восьми одинаковых сегментов удлиненной формы, стабилизацию которых обеспечивают дисульфидные мостики. Связывание TNFα с рецептором активирует фактор транскрипции NF-κB (ядерный фактор каппа-В). В передаче сигнала участвуют внутриклеточные сигнальные белки (взаимодействующая с рецептором протеинкиназа), адаптерные белки, TRAF2 (ассоциированный с рецептором TNF фактор 2) и белок домена смерти TRADD. (Рис. из: Gilbert, 2010; Alberts et al., 2015.)

Медицинская значимость

Мутации и делеции более чем в 10 генах человека, кодирующих белки сигнального каскада Hedgehog, приводят к возникновению различных пороков развития (см. Приложение, табл. 4, с. 462). Мутации и полиморфизмы TNFα связаны с множеством заболеваний, например ревматоидным артритом, астмой, язвенным колитом и др.

Сигнальные пути Hedgehog и TNF

209

210 Сигнальные пути

СИГНАЛЬНЫЙ ПУТЬ NOTCH/DELTA

Сигнальный путь Notch определяет направление дифференцировки клеток в эмбриогенезе (например, нейрогенезе, миогенезе, гемопоэзе) и морфогенезе различных тканей развивающегося эмбриона позвоночных и беспозвоночных. Передача сигналов Notch происходит при взаимодействии непосредственно передающей и принимающей клеток. Сигнал опосредован рецептором Notch и лигандами различных типов, принадлежащими к группе DSL (лиганды Delta, Serrate, Lag-2). При активации Notch имеет место регулируемое протеолитическое расщепление в трех сайтах рецептора.

A. Передача сигнала Notch

И лиганд, и рецептор представляют собой белки с одним трансмембранным доменом, им обоим необходимо протеолитическое расщепление (не показано на схеме). Первое протеолитическое расщепление происходит в аппарате Гольджи с участием фуринподобной конвертазы. Notch подвергается О-гликозилированию гликозилтрансферазой (fringe), которая обеспечивает присоединение единичного остатка фукозы к некоторым сериновым, треониновым и гидроксилизиновым основаниям. Связывание с лигандом индуцирует следующие два этапа протеолитического расщепления. Концевой фрагмент Notch мигрирует в ядро и связывается с основным эффектором сигнального каскада Notch, белком CSL. Связывание с другими регуляторными белками гена запускает транскрипцию геновмишеней Notch.

Б. Латеральное ингибирование с участием белка Notch

Одна из функций сигнального каскада Notch — латеральное ингибирование в процессе развития нервных клеток у дрозофилы. Нервные клетки появляются как изолированные единичные клетки среди предшественников эпителиальных клеток. Клетки, которым предстоит стать нервными, используют сигнальный каскад Notch для ингибирования аналогичных связанных с дифференцировкой событий в окружающих их клетках. Если ингибирование отсутствует, избыточное образование нервных клеток приводит к гибели эмбриона.

В. Дрозофила с мутацией Notch

Notch — это мутантный фенотип плодовой мушки Drosophila melanogaster, описанный Т. Морганом в 1917 г. У гетерозигот женского

пола в дистальной части крыла присутствуют вырезы разного размера. Гемизиготные самцы гибнут в процессе эмбрионального развития из-за гипертрофии нервной системы.

Г. Семейство рецепторов Notch

Рецепторы Notch — это группа из 50 поверхностных белков млекопитающих. Прототипом служит белок Drosophila Notch (dNotch), внеклеточный домен которого состоит из 36 напоминающих рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) тандемных повторов. Другие структурные элементы белка — это три богатых цистеином повтора, LNR (Lin-12/Notch- связанная область) и сигнальный пептид в N-концевой части внеклеточного домена. Внутриклеточный домен содержит шесть анкириновых повторов (ANK), фланкированных двумя сигналами внутриядерной локализации (NLS). У человека встречаются четыре типа рецепторов Notch: hNotch 1–4 (рецепторы Notch нематоды Caenorhabditis elegans Lin-2 и Glp-1 не представлены на рисунке).

Д. Группа DSL семейства лигандов Notch

К лигандам Notch относится также большое семейство белков клеточной поверхности, получивших название Delta или Serrate. Такие белки содержат множество EGFR-подобных повторов во внеклеточных доменах, N-концевой DSLсвязывающий мотив и сигнальный пептид.

Медицинская значимость

Нарушение передачи сигнала Notch может стать причиной многих заболеваний. Например, причиной синдрома Алажиля (OMIM 118450) являются мутации гена, кодирующего белок jagged 1 или NOTCH2. Спондилокостальная дисплазия (OMIM 122600, 271529) возникает из-за мутации гена DLL3, а аномалия клапана аорты (OMIM 109730) — из-за мутации NOTCH1 (OMIM 190198).

Сигнальный путь Notch/Delta

211

212 Гены эмбрионального развития

ГЕНЫ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ DROSOPHILA MELANOGASTER

Морфологическая с труктура определяет развитие многоклеточных организмов. В процессе эмбрионального развития на определенных стадиях экспрессируются разные группы генов, что обеспечивает формирование сегментов тела растущего зародыша. Сначала формируются две оси симметрии, переднезадняя и дорсо-вентральная, а затем происходит формирование сегментов тела. Позднее появляются голова, грудь с лапками и антеннами, а также брюшко. Гомологичные гены определяют порядок развития эмбриона млекопитающих.

A. Жизненный цикл

Drosophila melanogasyers

Процесс превращения оплодотворенного яйца (~0,5 0,15 мм) во взрослую муху (2 мм) занимает 9 дней. Девять делений ядра каждые 8 мин приводят к образованию многоядерного синцития. После девятого деления дробления (через 90 мин после оплодотворения) ядра мигрируют на периферию, образуется синцитиальная бластодерма. После еще четырех делений плазматические мембраны впячиваются внутрь, окружая каждое из ядер. Так образуется клеточная бластодерма примерно из 6000 клеток. До этого момента зародыш сильно зависит от материнской мРНК и белков, присутствовавших до оплодотворения. Прежде чем окуклиться, зародыш проходит три личиночные стадии. После 5 дней метаморфоза появляется взрослая плодовая мушка.

Б. Сегментное строение

Тело взрослой плодовой мушки имеет 14 сегментов: три сегмента (C1–3) образуют голову, три сегмента (T1–3) — грудь и восемь (A1–8) — брюшко. Каждый сегмент состоит из передней и задней частей. Каждый из сформировавшихся изначально 14 парасегментов состоит из задней части предыдущего сегмента и передней части следующего сегмента.

В. Гены эмбрионального развития

Три группы генов представлены в иерархическом порядке: а) гены материнского эффекта полярности яйца определяют переднезаднюю и дорсо-вентральную оси яйца и зародыша на ранних стадиях развития; б) гены, определяющие судьбу клетки, индуцируют сегмента-

цию (гены gap-группы и гены парности сегментов); в) гены, определяющие структуру частей тела после сегментации (гомеотические гены, см. следующую страницу). У нормального зародыша присутствуют голова, три сегмента груди и восемь сегментов брюшка (1). Мутация Bicoid в гене полярности яйца (материнского эффекта) приводит к исчезновению передних частей тела (2). Мутации в одном из примерно девяти генов gap-группы приводят к нарушениям сегментации Krüppel (3) и Knirps (4). У характерных фенотипов мутаций восьми генов парности сегментов Even-skipped (5) и Fushi tarazu (6), утрачена часть сегментов (fushi tarazu по-японски значит «слишком мало сегментов»). Более 10 генов полярности сегментов определяют переднезаднюю полярность каждого сегмента, например при мутации gooseberry (7). Гомеотические гены (8) определяют конечную судьбу каждого сегмента. У мутантов Antennapedia (Ant) вместо антенн формируются конечности. Названия многих мутаций отражают внешний вид мутантного зародыша. Названия мутаций используют без перевода. (Рис. из: Lawrence, 1992; NüssleinVolhard & Wischaus, 1980.)

Медицинская значимость

Мутации некоторых гомологичных генов эмбрионального развития у человека приводят к возникновению различных пороков развития, например синдрома Ваарденбурга 1-го типа (OMIM 193500).

Гены эмбрионального развития Drosophila melanogaster

213

214 Гены эмбрионального развития

HOX-ГЕНЫ

Hox-гены (OMIM 142950ff) — это группа эволюционно связанных генов, отвечающих за формирование основных структур во время эмбрионального развития, в частности за паттерн сегментации и ориентацию сегментов. Первоначально такие гены называли гомеотическими, сейчас их называют Hox. Название произошло от Homeobox, так назвали 180-азо- тистую консервативную последовательность, которая выполняет важную функцию в процессе эмбрионального развития дрозофилы и высших организмов.

A. Регуляторная иерархия генов эмбриогенеза

Пять основных определяющих паттерн эмбриогенеза систем генов дрозофилы перечислены в иерархическом порядке: а) гены полярности яйца; б) gap-гены; в) гены парности сегментов; г) гены полярности сегментов и д) Hox-гены. Hox-гены позвоночных гомологичны гомеотическим генам дрозофилы. Переднезадняя ось (Bicoid для передней части, Nanos для задней) формируется благодаря молекулам мРНК материнского происхождения. Белки диффундируют по градиенту в порядке убывания от переднего и заднего полюсов соответственно. Дорсо-вентральную ось определяет трансмембранный рецептор, известный под названием Toll. Четвертый сигнал генерируется на обоих концах трансмембранным рецептором тирозинкиназы Torso. Три наиболее важных гена gap-группы,

Krüppel, Hunchback и Knirps, определяют морфологию отдельных частей тела. Gapгены индуцируют гены парности сегментов, такие как even-skipped и fushi tarazu. Гены полярности сегментов, экспрессируемые

впарасегментах, определяют правильность переднезадней ориентации каждого сегмента

вотдельности. Гомеотические гены отвечают за формирование антенн, крыльев, лапок и других структур.

Б. Нох-гены

Гомеотические гены образуют группу, называемую Hox-генами (HOX у человека). У дрозофилы присутствует один набор Hox-генов, а у млекопитающих — четыре. Каждый из этих генов принадлежит к Antennapedia кластера Bithorax/Ultrabithorax (btx/ubx). Пять генов группы Antp — это Labial (lb), Proboscis (pb), Deformed (dfd), Sex comb reduced (scr) и Antennapedia (antp).

Hox-гены млекопитающих произошли от того же предкового гомеотического генного комплекса. В процессе эволюции млекопитающих дважды имело место удвоение этого комплекса, в результате которого образовались четыре кластера A–D из 39 генов, встречающихся у человека и мыши. Одни гены были утрачены, другие добавились позднее. Гены HOX отвечают за схему строения тела, определяют механизм формирования конечностей у млекопитающих. Они экспрессируются в определенной последовательности в переднезаднем направлении. (Рис. из: Alberts et al., 2015.)

В.Мутация Bithorax

Мутация в комплексе Bithorax (Bx-t) индуцирует формирование дополнительного грудного сегмента с полностью развитыми крыльями. Ее впервые описал К. Бриджес в 1915 г. В 1978 г. Э. Льюис установил, что гены Bithorax произошли от небольшого количества предковых генов в результате дупликации и возникновения специфической функции.

Г.Гомеобокс

Гомеотические (Hox) гены кодируют регуляторные белки генов, в том числе факторы транскрипции. Такие гены высококонсервативны. Ген antennapedia содержит 180-нуклеотид- ную консервативную последовательность (гомеобокс), от которой получила свое название группа Hox-генов. У белка соответствующие 60 консервативных аминокислот составляют гомеодомен с четырьмя связывающими ДНК доменами (I–IV) — последовательность, обычную для факторов транскрипции. Экспрессия зависит от генов полярности сегментов.

Медицинская значимость

Как минимум, 20 HOX-генов человека связаны с развитием различных заболеваний.

Hox-гены 215

216	Гены эмбрионального развития
РЫБКИ ДАНИО: ПОЗВОНОЧНЫЕ		блюдать дефекты задних сегментов тела и ги-
С ПРОЗРАЧНЫМИ ЭМБРИОНАМИ		перплазию нервной системы. При мутации
		fused somites (fss) отдельные сомиты не фор-
		мируются вообще (2). Возникает множество
Тропическая пресноводная рыбка данио (Danio		дополнительных отростков неправильной
rerio) — модельный организм, широко исполь-		формы. Ген fss кодирует фактор транскрипции
зуемый для генетических и геномных иссле-		Tbx24 (OMIM 607044), необходимый для со-
дований. Данио — первое позвоночное, став-		зревания пресомитной мезодермы.
шее объектом геносистематики и геномного		Г. Мутация, связанная с отсутствием
анализа. Компактный геном протяженностью		Г. Мутация, связанная с отсутствием
1,5 млрд пн почти в 2 раза короче генома че-		перешейка между промежуточным
ловека или мыши, содержит 18 000 кодиру-		и ромбовидным мозгом (noi)
ющих известные белки генов с множеством		Мутация в гене noi (no isthmus) представляет
известных мутаций. Смена поколений каждые		собой пример существования множества раз-
3 месяца и прозрачность тела в первые 2 не-		личных мутантных фенотипов данио, имеющих
дели жизни позволяют изучить эффект многих		дефекты нервной системы и спинного мозга.
связанных с развитием генов.		У мутантных эмбрионов noi отсутствует суже-
A. Стадии развития эмбриона		ние промежутка между промежуточным моз-
A. Стадии развития эмбриона		гом и ромбовидным мозгом. У нормальных
В прозрачном теле эмбриона (стадия фарин-		эмбрионов через 28 ч после оплодотворения
гулы) основные отделы мозга (передний мозг,		(дикий тип, 1) наблюдается устойчивая экс-
промежуточный мозг и ромбовидный), нерв-		прессия гена полярности сегментов engrailed
ную трубку, сомиты и вентральную пластинку		(eng) между промежуточным мозгом и ром-
нервной трубки можно разглядеть через 29 ч		бовидным мозгом. Нормальные эмбрионы
после оплодотворения. Через 48 ч (стадия		на стадии восьми сомитов подвергли двойно-
выхода из икринки) возникает пигментация,		му окрашиванию, чтобы обнаружить РНК eng
становятся видны плавники, глаза, мозг, серд-		и krox20. Маркер ромбомеров 3 и 5 этой обла-
це и другие органы. На 5-й день (плавающая		сти — экспрессия eng и krox20 на участке меж-
личинка) тело приобретает характерные для		ду промежуточным и ромбовидным мозгом
рыбы очертания.		(2–3). У мутантов noi экспрессия eng отсут-
Б. Индуцированный мутагенез		ствует (4). Мутация noi также сопровождается
Б. Индуцированный мутагенез		отсутствием выработки белка Wingless (Wnt1)
Случайные мутации, индуцированные у роди-		в крыше среднего мозга эмбриона на стадии
телей мужского пола, были изучены у тысяч		20 сомитов (5, 6). (Рис. из: Brand et al., 1996;
потомков на разных стадиях эмбрионального		van Eeden et al., 1996; Haffter et al., 1996.)
развития (генетический скрининг). Самцов		Медицинская значимость
с индуцированными мутациями скрещивали		Медицинская значимость
с самками дикого типа (Р), при этом первое		Многие гены человека, мутации которых вызы-
поколение (F1) было гетерозиготным по му-		вают заболевание, имеют гомологи в геноме
тациям (m). Скрещивание приводило к тому,		рыбки данио.
что в следующем поколении (F2) у 50% при-
сутствовала, как минимум, одна мутация.
Случайное скрещивание гетерозиготных
по одной и той же мутации родителей обеспе-
чивало появление 25% гомозиготного мутант-
ного потомства. Ниже рассмотрено два при-
мера таких мутаций.

В. Фенотип скелета при слиянии сомитов (мутации fss)

У рыб дикого типа сомиты обеспечивают формирование нормальных сегментов позвоночника, а также мышц туловища и хвоста (1). Удалось идентифицировать несколько мутаций, связанных с аномалиями соединения сомитов. При некоторых мутациях можно на-

Рыбки данио: позвоночные с прозрачными эмбрионами

217

218 Гены эмбрионального развития

КЛЕТОЧНАЯ РОДОСЛОВНАЯ НЕМАТОДЫ CAENORHABDITIS ELEGANS

Caenorhabditis elegans — это свободноживущая нематода с прозрачным телом, содержащим строго определенное число клеток. Происхождение каждой клетки можно проследить до клетки-основателя. В 1965 г. С. Бреннер предложил использовать нематоду в качестве модельного объекта. Генетический анализ множества мутантных фенотипов позволил получить массу важной информации о вкладе генетических, анатомических и физиологических факторов в развитие. Для этого организма удалось получить полную клеточную родословную. Геном C. elegans протяженностью 97 млн пн содержит около 20 000 кодирующих белки генов и около 160 000 генов, кодирующих нетранслируемые РНК. Около 32% кодирующих последовательностей гомологичны последовательностям генома человека. Примерно 70% известных человеческих белков гомологичны белкам C. elegans. Самая многочисленная группа генов кодирует трансмембранные рецепторы (790), в частности хеморецепторы, факторы транскрипции с цинковыми пальцами (480) и белки с протеинкиназными доменами. Важную функцию в организме C. elegans выполняют интерферирующие РНК (см. с. 190).

A. Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans — прозрачный червь длиной около 1 мм, продолжительность жизни которого составляет примерно 3 дня. Нематода имеет билатерально симметричное удлиненное тело с нервами, мышцами, кожей, кишечником и гонадами. Существуют черви двух полов: гермафродиты и самцы. У гермафродитов образуются как яйца, так и сперматозоиды, поэтому они могут размножаться посредством самооплодотворения. Взрослый червь-гермафродит имеет 959 ядер в соматических клетках. Взрослый самец имеет 1031 ядро. Кроме того, у них присутствует от 1000 до 2000 зародышевых половых клеток.

Б. Происхождение отдельных клеток

Все ткани образуются из шести клеток-ос- нователей. Нервная система образуется из AB, мышечные клетки — из MS, кишечник — из E, кожа — из С, некоторые мышцы — из C, а зародышевые половые клетки — из Р4. При каждом делении клетки

генетически детерминированные факторы определяют судьбу каждой из двух дочерних клеток. Дифференцированные клетки получаются более чем из одной клетки-основате- ля. Исключение составляют клетки кишечника и гонад. Из 959 клеток взрослой нематоды 302 клетки относятся к нервной системе.

В. Гены эмбрионального развития

Многие определяющие направление развития гены удалось идентифицировать благодаря анализу индуцированных этилметансульфонатом мутаций. Основные типы мутаций могут вызывать неправильную дифференцировку клеток (например, в клетки Z вместо B), а также заставлять клетки делиться слишком рано или слишком поздно (мутации, связанные с делением).

Г. Апоптоз у C. elegans

Программируемая гибель клеток (апоптоз) — это нормальный элемент эмбрионального развития позвоночных и беспозвоночных (см. с. 126). В процессе эмбрионального развития нематоды C. elegans 131 из 947 негонадных клеток взрослого гермафродита гибнут в определенное время на разных стадиях развития (1). Мутации гена ced-9 индуцируют апоптоз. В норме ген ced-9 подавляет апоптоз, а ced-3 и ced-4 являются проапоптатическими генами. У двойных мутантов ced-9/ced-3 апоптоз отсутствует, потому что ced-9 представляет собой более важный элемент механизма апоптоза по сравнению с ced-3. На фотографиях (2) представлена гибель клетки (клетка P11. aap), прожившей около 40 мин. (Рис. из: Wood, 1988; Sulston & Horvitz, 1977).

Медицинская значимость

Человеческий ген BCL-2, гомолог гена ced-9, кодирует белок внутренней мембраны митохондрий, ингибирующий апоптоз предшественников В-лимфоцитов. Разрушение этого гена вызывает фолликулярную лимфому, В-клеточный рак (OMIM 151430.)

Клеточная родословная нематоды Caenorhabditis elegans

219

Original title: “Color Atlas of Genetics”, 5th ed. by Eberhard Passarge

<<< < Предыдущая 1 2 34 / 94 5 6 7 8 9 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете Генетика

#
29.01.202431.45 Mб6Асланян М.М., Солдатова О.П. Генетика и происхождение пола.pdf
#
10.03.20242.11 Mб1Лаптев Ю. П. Занимательная генетика.djvu
#
30.05.202185.92 Mб257Наглядная генетика (2020).pdf
#
03.10.202022.94 Mб20Эллис С.Д., Дженювейн Т., Рейнберг Д. Эпигенетика..djvu