9.3.2 Опыт 2. Определение активности β-фруктофуранозидазы

Этот фермент называют также инвертазой или сахаразой. Он катализирует гидролиз сахаров, в состав которых входит – образуется фруктоза в β - форме (сахараза, рафиноза), расщепляя их по β -фруктозидной связи:

Сахароза

Сахароза не обладает редуцирующей способностью, а образующаяся смесь глюкозы и фруктозы восстанавливает фелинговую жидкость. На этом и основано определение активности фермента. β - Фруктофуранозидазу используют для изготовления искусственного меда, мороженого и карамели.

Приборы и реактивы: штатив с пробирками; пипетки; водяная баня на 40^оС; автолизат дрожжей прокипяченный и некипяченный; 5%-ный раствор сахарозы в ацетатном буфере рН 4,5; раствор Фелинга; 1%-ный раствор крахмала.

9.3.2.1 Методика выполнения работы

В две пробирки наливают по 5 мл раствора крахмала. Во все пробирки добавляют по 1мл автолизата дрожжей: в пробирки 2 и 3 некипяченного, а в пробирку 1 – предварительно прокипяченного и охлажденного. Пробирки помещают на 30 минут в баню при 40^оС., после инкубации в пробирки добавляют по 2 мл свежеприготовленной фелинговой жидкости и содержимое пробирок кипят. В контроле (пробирка 1), где фермент инактивирован кипячением, осадок не выпадает, а может наблюдаться красноватый налет на дне пробирки. Это объясняется тем, что сахароза и автолизат дрожжей содержат следы редуцирующих сахаров. В тоже время в опыте (пробирка 2), где фермент был активен, образуется большое количество редуцирующих сахаров и, следовательно, выпадает обильный красный осадок Cu₂O. В пробирке 3 наблюдается тоже, что и в контроле. Это подтверждает специфическое действие β -фруктофуранозидазы на сахарозу(крахмал не расщепляется). Следовательно, фермент обладает субстратной специфичностью.

9.3.2.2 Оформление результатов опыта

Полученные результаты записывают в таблицу 19.

Таблица 19

№ пробирки	Степень активности фермента	Субстрат	Изменения, происходящие в пробирке	Выводы

9.4 Контрольные вопросы

1. Какова природа ферментов?

2. Как протекает ферментативная реакция?

3. В чем заключается специфичность ферментов? Приведите примеры относительной и абсолютной специфичности ферментов.

4. Приведите примеры использования амилаз в пищевой промышленности.

5. Как можно определить активность амилаз?

Рекомендуемая литература

[1 с. 332-344];[3 с. 404-438]

Лабораторная работа №10 Определение активности каталазы

10.1 Цель работы: изучение методов определения активности каталазы в объектах различного происхождения.

10.2 Общие сведения

Класс оксидоредуктаз включает ферменты, участвующие в окислении различных веществ. Окисление может осуществляться несколькими путями:

1 . АО +1/2О₂ АО₂ (присоединение кислорода)

2 . АН₂+ В А + ВН₂(перенос водорода)

3 . А²⁺ А³⁺+ е (перенос электронов)

Ферменты этого класса играют важную роль в дыхании и брожении. К оксидоредуктазам относится каталаза.

Каталаза катализирует реакцию расщепления перекиси водорода на молекулярный кислород и воду. Она является сложным ферментом, состоящим из белкового комплекса и простетической группы гем, содержащий железо. Атом железа в каталазе играет роль каталитического центра. Каталаза – один из наиболее быстро работающих ферментов: при 0^оС одна молекула каталазы разлагает в 1 сек 40000 молекул перекиси водорода.

Перекись водорода является ядовитым веществом, она образуется в окислительно-восстановительном процессе при восстановлении молекулярного кислорода. Каталаза обладает пониженной термоустойчивостью, при нагревании выше 75-80^оС она разрушается.

Активность каталазы может служить показателем общего уровня окислительных процессов в тканях.