Специальная часть вопросов экзамена по направлению 110200 «Агрономия»

КАТЯ+ КАДИ

1. Каллусообразование in vivo и in vitro. Получение, культивирование и использование каллусных культур.

При помещении зародыша на искусственную питательную среду происходит его дальнейший рост и один зародыш дает начало одному растению. Однако на определенных питательных средах можно индуцировать эмбриоидогенез, что увеличивает коэффициент размножения в несколько раз и ускоряет сам процесс размножения.

Известно, что у ряда цветковых растений в естественных условиях кроме половых могут образовываться и неполовые зародыши – эмбриоиды [1]. В работах многих исследователей [2, 3, 5] показана возможность экспериментального индуцирования эмбриоидов из соматических клеток in vitro и получения из них растений. Перспективным направлением в этой области являются метод культуры in vitro зародышей, связанный с образованием эмбриоидогенного каллуса с дальнейшим формированием эмбриоидов и прорастанием их до растений-регенерантов.

Каллусообразование на зародышах. Влияние стадии развития и размера зародыша P. anomala на каллусообразование. Способность изолированных зародышей P. anomala к формированию каллуса зависела от размера и стадии развития зародыша

Оптимальными, дающими интенсивное каллусообразование, оказались зародыши размером 0.5–0.6 мм. Следует отметить, что в отдельных случаях зародыши как среди более крупных, так и среди мелких могли формировать каллус. Тем не менее, крупные зародыши давали интенсивное каллусообразование.

Очевидно, что на частоту образования каллуса оказывает влияние степень развития зародыша. Зародыши, изолированные через 26–35 сут. после опыления, не были способны развиваться и образовывать каллус и чаще всего погибали. Зародыши, вычлененные на сердечковидной (35–38 сут. после опыления) и торпедовидной (38–40 сут. после опыления) стадиях развития, образовывали светлый рыхлый каллус

Влияние регуляторов роста на каллусообразование и рост биомассы. Успех получения каллуса в большей мере зависит от удачного подбора регуляторов роста, которые индуцируют клеточные деления. Обязательным условием дедифференциации растительной клетки и превращения её в каллусную является присутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов. В качестве ауксинов используются 2,4-Д, НУК, ИУК, которые применяют в более высоких концентрациях, чем цитокинины [6].

В качестве индуктора каллусообразования при культивировании клеток и тканей многих видов растений успешно применяют синтетический ауксин 2,4-Д [4]. Для получения каллуса на изолированных зародышах P. anomala применяли питательные среды с использованием 2,4-Д и кинетина. При отсутствии гормонов в среде каллусы на зародышах P. anomala не образовывались.

Опыты показали, что в зависимости от состава регуляторов роста в питательной среде формируется каллус. Изучение динамики роста каллусной биомассы P. anomala на всех средах выявило довольно длительную лаг-фазу – до 20 суток. Сочетание 2,4-Д и кинетина в концентрации по 0.3 мг/л в питательной среде стимулировало увеличение массы каллусов в третьем пассаже через 60 сут. Масса сырого каллуса составила 228 мг. Однако при дальнейшем субкультивировании рост биомассы каллуса замедлялся. Зародыши, культивируемые на питательных средах, содержащих 2,4-Д в концентрации 1.0 мг/л с кинетином в концентрации 0.5 мг/л и 2,4-Д в концентрации 2.0 мг/л с кинетином в концентрации 0.5 мг/л, образовывали до третьего пассажа медленно растущий каллус с частотой 89 % и 98 %. В дальнейшем произошел резкий скачок массы каллуса, которая составила соответственно 426 мг и 403 мг к пятому пассажу. Медленный рост каллусной ткани наблюдали на средах, содержащих 2,4-Д и кинетин в следующих комбинациях: 1.0 мг/л и 0.1 мг/л; 2.0 мг/л и 0.2 мг/л соответственно. Масса каллуса и частота каллусообразования были ниже, чем в других вариантах. Каллус светло-коричневого цвета был рыхлой консистенции.

Регенерация растений из каллуса. Использование регуляторов роста НУК в сочетании с БАП показало высокую эффективность формирования эмбриоидов и почек при переносе каллуса в условия фотопериода. При пересадке каллусов на питательные среды, содержащие БАП и НУК, становились морфогенными. В течение 4 недель на поверхности разросшегося рыхлого каллуса формировались глобулярные структуры бледно-зеленого цвета диаметром 2 мм (рис. 2).

Каллус пролиферировал и распадался на мелкие кусочки, и делящиеся клетки формировали эмбриоиды (рис. 2) и в редких случаях образовывали почки, которые развивались в течение следующего субкультивирования (рис. 3). В месте прикрепления эмбриоидов к каллусу образовывался слой темноокрашенного вещества, который как бы отделял эмбриоид от остальной массы каллуса. Со временем образовавшиеся эмбриоиды достигали полной независимости от «материнского организма».

В отличие от эмбриоидов, образующиеся почки тесно связаны с породившими их тканями каллуса. Почки, образующиеся на каллусе, внешне очень напоминали боковые почки пиона in vivo

Сохранение генетического материала. Поддержание биоразнообразия является глобальной задачей всего человечества. Одним из подходов к решению этой проблемы является хранение культуры клеток и тканей с использованием низких температур, в т.ч. в жидком азоте при температуре –1960 С. Одним из видов тканей, которые могут сохраняться в таких условиях является каллус, который был использован у моркови, перца, люцерны, риса, кукурузы и других культур. Главные преимущества такого способа – неизменность генотипа, поддерживаемая в течение длительного периода.

Получение суспензионных культур и протопластов. Рыхлый каллус используют для получения одиночных клеток в жидкой питательной среде и последующего культивирования суспензионной культуры, каллусные ткани могут быть также использованы для получения протопластов ( клеток, лишенных оболочки )

Использование каллуса в клеточной селекции. Состояние каллуса индуцирует сомаклональную изменчивость, что дает основание для проведения отбора в культуре клеток и создания новых генотипов.

Использование каллуса для микроразмножения растений.

Культуры, могут размножаться в результате образования зародышеподобных структур ( эмбриоидов) из каллуса или суспензионной культуры, полученной на его основе. Недостаток этого метода вегетативного размножения – возможность появления генетических отклонений в результате сомаклональной изменчивости .

Получение вторичных метаболитов. Культура каллуса и суспензионная культура применяется для промышленного получения синтезируемых клетками соединений, используемых для целей медицины, защиты растений, производства продуктов питания и др.

2. Органогенез в культуре растительных клеток. Микроклональное размножение. Оздоровление посадочного материала.

Культуры клеток высших растений имеют две сферы применения:

1.Изучение биологии клетки, существующей вне организма, обуславливает ведущую роль клеточных культур в фундаментальных исследованиях по генетике и физиологии, молекулярной биологии и цитологии растений. Популяциям растительных клеток присущи специфические особенности: генетические, эпигенетические (зависящие от дифференцированной активности генов) и физиологические. При длительном культивировании гетерогенной по этим признакам популяции идет размножение клеток, фенотип и генотип которых соответствуют данным условиям выращивания, следовательно, популяция эволюционирует. Все это позволяет считать, что культуры клеток являются новой экспериментально созданной биологической системой, особенности которой пока мало изучены. Культуры клеток и тканей могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения.

2. Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии. Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.

Можно назвать несколько направлений создания новых технологий на основе культивируемых тканей и клеток растений:

1. Получение биологически активных веществ растительного происхождения:

• традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское применение);

• синтез новых необычных соединений, что возможно благодаря исходной неоднородности клеточной популяции, генетической изменчивости культивируемых клеток и селективному отбору клеточных линий со стойкими модификациями, а в некоторых случаях и направленному мутагенезу;

• культивируемые в суспензии клетки могут применятся как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ (реакции окисления, восстановления, гидроксилирования, метилирования, деметилирования, гликолизирования, изомеризации). В результате биотрансформации получают уникальные биологически активные продукты на основе синтетических соединений или веществ промежуточного обмена растений других видов.

2. Ускоренное клональное микроразмно¬жение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.

3. Получение безвирусных растений.

4. Эмбриокультура и оплодотворение in vitro часто применяются для преодоления постгамной несовместимости или щуплости зародыша, для получения растений после отдаленной гибридизации. При этом оплодотворенная яйцеклетка вырезается из завязи с небольшой частью ткани перикарпа и помещается на питательную среду. В таких культурах можно также наблюдать стадии развития зародыша.

5. Антерные культуры – культуры пыльников и пыльцы используются для получения гаплоидов и дигаплоидов.

6. Клеточный мутагенез и селекция. Тканевые культуры могут производить регенеранты, фенотипически и генотипически отличающиеся от исходного материала в результате сомаклонального варьирования. При этом в некоторых случаях можно обойтись без мутагенной обработки.

7. Криоконсервация и другие методы сохранения генофонда.

8. Иммобилизация растительных клеток.

9. Соматическая гибридизация на основе слияния растительных протопластов.

10.Конструирование клеток путем введения различных клеточных оганелл.

11.Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.

12. Изучение системы «хозяин – паразит» с использованием вирусов, бактерий, грибов и насекомых).

Микроклональное размножение и оздоровление растений

Преимущества микроклонального размножения перед традиционными способами размножения растений. История метода

В природе существует два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Оба эти способа имеют как свои преимущества, так и недостатки.

К недостаткам семенного размножения относятся генетическая пестрота семенного материала и длительность ювенильного периода.

При вегетативном размножении генотип материнского растения сохраняется, а также сокращается длительность ювенильного периода. Однако большинство видов плохо размножается вегетативным способом, к ним относятся многие древесные породы. Например, эффективность размножения, даже на ювенильной стадии, дуба, сосны, ели, орехоплодных не очень высока. Кроме того, с помощью черенкования невозможно размножать многие виды древесных растений в возрасте старше 10-15 лет. Трудно получить стандартный посадочный материал, так как существует возможность накопления и передачи инфекции. Операции по размножению с помощью прививок сложны и трудоемки.

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения. Клональное микроразмножение - получение in vitro, неполовым путем, генетически идентичных исходному экземпляру растений. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность. Термин "клон" был предложен в 1903 году Уэбстером (от греческого klon - черенок или побег, пригодный для размножения растений). В соответствии с научной терминологией клонирование подразумевает получение идентичных организмов из единичных клеток. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

• получение генетически однородного посадочного материала;

• освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;

• высокий коэффициент размножения (105 - 106 - для травянистых, цветочных растений, 104 - 105 - для кустарниковых древесных растений и 104 - для хвойных);

• сокращение продолжительности селекционного процесса;

• ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

• размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

• возможность проведения работ в течение всего года;

• возможность автоматизации процесса выращивания.

Пионером клонального микроразмножения считается французский ученый Жан Морель, который в 50-х годах двадцатого века получил первые растения - регенеранты орхидей. В это время техника культивирования апикальных меристем in vitro была уже хорошо разработана. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы и т.д. В нашей стране работы по клональному микроразмножению были начаты в 30-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза ИФРа. Под руководством Р.Г.Бутенко были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы и др. растений и предложены промышленные технологии. В дальнейшем исследования по клональному микроразмножении охватили и древесные растения.

Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов нашего столетия и связаны с именем Готре, который показал, что камбиальные ткани некоторых растений способны к каллусогенезу in vitro. Но первые растения - регенеранты осины, доведенные до почвенной культуры, были получены лишь в середине 60-х годов Матесом.

Культивирование тканей хвойных пород in vitro долгое время редко использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования тканей, изолированных из растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные растения характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и т.д.), которые в изолированных тканях активируются. Окисленные фенолы обычно ингибируют деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта или уменьшению способности тканей древесных растений к регенерации адвентивных почек, которая с возрастом растения-донора исчезает практически полностью. В настоящее время, несмотря на перечисленные трудности, насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, сосна, ель, секвойя и др.).