67. Инфракрасная (ИК) спектроскопия, возможности её использования для идентификации химических соединений. Анализ биологических молекул по собственным ИК-спектрам и в присутствии зондов на основе редкоземельных элементов.

ИНФРАКРАСНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ – раздел молекулярной оптической спектроскопии, изучающий спектры поглощения и отражения электромагнитного излучения в ИК области, т.е. в диапазоне длин волн от 10-6 до 10-3 м. В координатах интенсивность поглощенного излучения - длина волны (или волновое число) ИК спектр представляет собой сложную кривую с большим числом максимумов и минимумов. Полосы поглощения появляются в результате переходов между колебательными уровнями основного электронного состояния изучаемой системы. Спектральные характеристики (положения максимумов полос, их полуширина, интенсивность) индивидуальной молекулы зависят от масс составляющих ее атомов, геометрического строения, особенностей межатомных сил, распределения заряда и др. Поэтому ИК спектры отличаются большой индивидуальностью, что и определяет их ценность при идентификации и изучении строения соединений. ИК-спектроскопию широко применяют для анализа смесей и идентификация чистых веществ.

Электрофорез:

Электрофорез белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов). Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии, генетике.

Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли

Механизм разделения

Электрофоретическая подвижность биополимеров в геле зависит от ряда параметров. Скорость миграции пропорциональна заряду молекулы, и в свободной жидкости молекулы с одинаковым удельным зарядом мигрируют с равной скоростью. В случае разделения в среде, имеющей жесткую пространственную матрицу, происходит сегрегация за счет трения о гель. Сила трения зависит от пространственной конфигурации молекулы, в том числе от её размера. Таким образом, в случае электрофоретического разделения нативных белков будет наблюдаться сложная картина их распределения в зависимости от вышеприведенных факторов.

Визуализация продуктов разделения

Для визуализации результатов электрофореза чаще всего используют окрашивание гелей красителем Кумасси или серебром. Для проведения вестерн блоттинга белки переносят из геля на нитроцеллюлозную мембрану.

Вестерн блоттинг (белковый иммуноблот, англ. Western blot) — аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце. На первом этапе использует электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине (как правило, в присутствии SDS) или по трехмерной структуре белка (в нативном состоянии). Далее белки переносятся на нитроцеллюлозную мембрану или PVDF, затем детектируются с использованием антител, специфичных к заданному белку. В ряде случаев электрофорез ферментов в мягких условиях (без ДДС-Na или мочевины) не сказывается на их активности. Положение полос ферментов в геле можно идентифицировать с помощью специфических реакций, дающих окрашенные продукты. Для этого гель вымачивают в растворе субстратов и кофакторов, необходимых для протекания определенной ферментативной реакции, иногда с добавлением реагентов, сообщающих окраску продукту этой реакции. Эту операцию следует проводить быстро во избежание диффузии нефиксированных белков из их полос. Если субстрат реакции полимерен и плохо диффундирует, его можно заполимеризовать прямо в гель и следить за продвижением фронта ферментативной реакции вместе с миграцией фермен

Непрерывный электрофорез. Электрич. поле Е направлено под прямым углом к направлению движения жидкости, протекающей через пористую среду. Разделяемая смесь (напр., компонентов А и Б) подается узкой струей (рис. 4). Результирующая траектория движения заряженных частиц представляет собой прямую, тангенс угла наклона которой равен отношению скорости миграции частиц к скорости прохождения электролита.

Для обнаружения в геле протеолитических ферментов предложен ряд нетривиальных методов. Например, после электрофореза гель вымачивают в течение 2 ч при 37° в 8%-ном растворе цитохрома с в буфере с рН 8,5, содержащем 8 М мочевину и 1,7 мМ CaCl2. Затем белок фиксируют в 12,5%-ной ТХУ. Диффундируя в гель, цитохром с окрашивает его в коричневый цвет по всему объему. Полосы протеаз, разрушающих цитохром с, остаются прозрачными и хорошо видны на коричневом фоне [Ward, 1976]. Суть другого подхода заключается в том, что на гель накладывают обработанную закрепителем в темноте (для удаления серебра) и вымоченную в буфере фотопленку. После трехчасовой выдержки при 35° во влажной камере на фотопленке можно обнаружить следы диффузии в нее протеаз, разрушающих слой желатины [Burger, Schroeder, 1976].

Для обнаружения нуклеаз при полимеризации геля в него вносят ДНК (10 мкг/мл) или РНК (25 мкг/мл). Если нуклеазы для своего действия нуждаются в ионах Mg2+, Са2+ или Zn2+, то в их растворе ПААГ вымачивают после окончания электрофореза. Далее следует окрашивание геля красителем для нуклеиновых кислот—бромистым этидием (см. главу 4). Окрашивается весь гель, за исключением полос, содержащих нуклеазы, где нуклеиновая кислота разрушена. Можно вести разделение нуклеаз и в присутствии ДДС-Na, блокирующего их действие во время электрофореза. Перед обработкой бромистым этидием ДДС-Na из геля вымывают.

Простейший прием элюции состоит в извлечении белка из полоски или кусочка геля за счет диффузии в течение длительного времени при 37—40°. Этот прием пригоден как для свободных белков, так и для их комплексов с ДДС-Na. С целью облегчения диффузии белков из геля последний измельчают, например растирают в маленьком стеклянном гомогенизаторе. Во время элюции суспензию измельченного геля встряхивают. В элюирующий буфер, как правило, вводят ДДС-Na даже в тех случаях, когда электрофорез белка проводили без него. Это делают для облегчения растворения белков. После окончания экстракции гель удаляют центрифугированием. От ДДС-Na и красителя белок можно освободить осаждением и промывкой сначала смесью ацетона с 0,1 М НС1 (6: 1), а затем чистым ацетоном. Осажденный ацетоном белок высушивают или лиофилизируют. Брэй и Браунли [Bray, Brownlee, 1973] элюировали таким образом белок в 0,05 М Na-фосфатный буфер <рН 7,5) с 0,1% ДДС-Na и 1 мМ ФМСФ ' при 37° в течение ночи при встряхивании. Белок в комплексе с ДДС-Na осаждали (за счет ДДС-Na) добавлением КС1 до 0,2 М и выдерживанием при 0°. Дрешер и Ли гомогенизировали кусочки геля в малом объеме 1%-ного раствора ДДС-Na и элюировали белки в течение ночи при 40°. Такая концентрация ДДС-Na оказалась необходимой для растворения белков, осажденных в геле в ходе их фиксации кислотой и окра.шивания [Drescher, Lee, 1978]. В другой работе [Sreekrishna et al., 1980] белки, предназначенные для последующего аминокислотного анализа, элюировали из ПААГ гомогенизацией в 0,05 М растворе бикарбоната аммония с 0,05% ДДС-Na и инкубацией в течение 10 ч при 37°. Бикарбонат аммония удаляли повторной лиофилизацией. От ДДС-Na избавлялись, осаждая белок добавлением 9 объемов подкисленного ацетона после растворения лиофилизированного препарата в воде до концентрации 1 % по ДДС-Na.