1. Основные типы биополимеров. Их физико-химические свойства.

Нуклеиновые кислоты

Внутри класса свойства очень похожи.

1. постоянное отношение заряд / размер: Z ~= -N (-2N)

2. малая зависимость заряда от pH

в физиологическом диапазоне pH

([Cp] pKa₁=4.5; [Gp] pKa₁=2.4, pKa₂=9.4; [Up] pKa₁=9.5; [dTp] pKa₁=10.0;

[Ap] pKa₁=3.8, [dAp] pKa₁=4.4)

т.е, при физиологических рН вклад заряженной формы <1%.

3. при pH < 4нерастворимы. Осаждаются с помощью ТХУ; НК – веества достаточо гидрофобные; и растворяются засчет большого заряда. Если заряд нейтрализуется, выпадают в осадок.

4. денатурация:

(разрушение высших уровней структурированности, обусловленных нековалентными взаимодействиями)

применительно к НК – переход в одноцепочечную форму, разрушение структурированных участков

• нагревание выше 65-70 ^oC, обратимо, необходимо все время поддерживать температуру

• хаотропные агенты: (NH₂)₂CO , HCONH₂, разрушают стабилизирующие взаимодействия.

• pH > 9.5-10 – изменение стуктуры оснований при изменении заряда

Поддерживание двуцепочечных участков:

Н-связи, утсон-криковские связи– ≤20%.

Стекинг взаимодействия вносят основной вклад в стабилизацию дуплексов. Эти взаимодействия возникают уже после формирования д/ц структуры.

Квантовые химики доказали это, и издевались над биологами: на самом ли деле t пл дуплексов можно оценить по GC-составу НК? (это необходимо, например, при выборе праймеров для гибридизации). Взяли разнуе олиги с разным GC-составом, но разной последовательностью оснований. Или специально рассчитали и синтезировали модельные дуплексы с разным GC-составом, скажем, 80 и 25%, но при этом первый олиг имел температуру плавления 52°, а второй 60°, вопреки распространенной теории. И «чудесная формула» оказалась ошибочной.

Физическая модель ДНК – упругий стержень, некомплементарные фрагменты (mismatch) локально меняют структуру; РНК (д/ц, регулярная) – почти то же самое, но стержень более гибкий с меньшим радиусом.

Белки

Очень разные свойства. Большое разнообразие мономеров, нет универсальных свойств.

1. Физическе свойства разнообразные, например, кератины – практически нерастворимы, а наприме ДНКазы хорошо растовримы.

2. заряд [ –N ; +N ] – сильно варьирует.

заряд сильно зависит от pH ( Z(pI) = 0 ); Изоэлектрическая точка – рН, при котором суммарный заряд молекулы равен 0. определяется а/к составом.

3. Денатурация:

Применительно к белкам это слово обозначает 2 разных процесса:

• разрушение S-S мостиков засчет восстановления

2-меркаптоэтанол, нагревание :

• нормализация соотношения заряд/размер формы

сильные детергенты вроде SDS (ДСН, CH₃(CH₂)₁₁SO₃Na) : гидрофобная часть детергента связывается с гидрофобными доменами белка, масса детергента большая. Тогде заряженная часть детергета определяет заряд всей молекулы..

2. Методы детекции биополимеров

Использование радиоизотопов

«взлеты и падения применимости»

В 70 годы у метода с исп радиоактивных изотопов не было конкурентов.

Ео с этим методом боролись по причине опасности и дороговизны : недешевое производство и дорого обеспечивать технику безопасности.

В СССР был крупный завод, который производил радиоизотопы, был Ташкентский завод.. сейчас завод закрыт.

СССР был единственным поставщиком ³³Р

Сейчас в России всего 1 подобный завод – Ленинградский, в полумертвом состоянии.

Совсем избавиться от метода не удается, так как он обладает определенными преимуществами:

• метки не изменяют химических и физических свойств молекул; ни один фермент не может отличить ³³Р, ³²Р и ³¹Р

• возможно избирательно детектировать отдельные молекулы и группы атомов; причем даже внутри одной молекулы.

Недостатки :

• опасность при работе;

• недолговечность (время жизни обратно пропорционально чувствительности);

• невозможность управлять интенсивностью метки; процесс распада – стохастичесикй,

Типы радиоактивного распада

α-распад (избыток массы):

^xN → ^x-4N + ⁴He (α) + γ

²³⁸U → ²³⁴Th + ⁴He + γ

β⁺-распад (избыток протонов):

p⁺ → n + β⁺ + ν (+ E)

¹⁸F → ¹⁸O + β ⁺ + ν + Q

β^--распад (избыток нейтронов):

n → p⁺ + β^- + ν (+ E)

P → S , S → Cl, C → N, H → He

¹⁴C → ¹⁴N + β ^- + ν + Q

K-захват (недостаток нейтронов):

p⁺ + e^- → n

¹²⁵I → ¹²⁵Te + ν + γ

Как правило, используют те атомы, которые водят в состав молекулы, либо легко туда включаются.

Мы детектируем либо ē, либо β⁺.

K-захват – детектируем электроны с внутренних эл. оболочек. Электрон соединяется с протоном, уходя с ближайшей к ядру оболочки. На его место приходит электрон со следующей оболочки и т.д. Изменяется Е, выдеяются γ-кванты. При этом регистрируются также бета-частицы! Откуда берутся? – вопрос.

Основной постулат - вероятность для всех атомов распасться в следующий момент одинакова.

Основные свойства радиоактивных веществ

2 мало связанных группы характеристик: связанные с энергией испускаемых частиц, и связанные с частотой испускания (связано с периодом жизни атома).

Интенсивность распада (активность): применяется ко всей массе имеющихся. радиоактивных атомов вещества. Т.е. сколько регистрируется распадов в данном куске материи в единицу времени.

1 dps (расп./сек) = 60 dpm (расп./мин) = 1 Bq (Бк) бекериль

1 Сi (Ки) = 3.7·10¹⁰ dps кюри

Кюри – исторически более ранние единицы;

Интенсивность зависит от некоего образцового материала при его экспозиции. Величина не константная, зависит от массы образца. Изменяется во времени по закону радиоактивного распада.

Удельная интенсивность(скорость) распада:

dA/dt = kA A = A₀ e^Kt

• Период (время) полураспада T_½

A = A₀ · (½)^{t / T½}

• Удельная (молярная) активность (УА) – активность 1 моль;

(носитель, теоретическая и практическая УА)

• Объёмная активность – концентрация р/а атомов (на см² раствора)

Удельная активность – нормировка на количество вещества, дифференциальная величина. Т_½ - интегральная величина.

Эти 2 величины связаны: чем интенсивнее распад, тем меньше Т_½.

Величины не меняются во времени, являются характеристиками радиопрепарата.

При переходе к удельной активности А₀ не нужна, так как идет нормировка на моль.

Удельная активность в формуле – теоретическая, или максимальная; как если бы все молекулы препарата были бы помечены. Но как правило, мечение препаратов никогда не происходит полностью. Более того, радиопрепараты разбавлены самой фирмой, чтобы нормировать. Если разбавить препараты, t→∞, С→С₀ (количество холодных частиц). Если переразбавить, t→∞, С→0.

Производители специально стандартизуют разбавление. УА такого препарата – практическая, УА неразбавленного – теоретическая, или max/

Как при разбавлении становится связаны УА и Т_½? Понятно, непосредственная связь теряется. Период остается тем же, т.к. относится только к радиоактивным атомам.

Чем больше разбавление, тем меньше удельная активность. Кроме того, зависит от времени. Количество радиоактивных атомов убывает, и уменьшается удельная активность. И убывает не по закону радиоактивного распада! Убывает медленней, чем количество атомов. Почему? Потому, что знаменатель тоже убывает. Если бы он был константой, то убывало бы по закону Рад. Распада.

Энергия испускаемых частиц:

• Свободный пробег β-частицы пропорционален ее энергии.

• Радиолиз, типы радиолиза. Стабилизаторы.

Прямой связи между периодом полураспада и энергией испускаемых частиц нет!

Как регистрировать распад? Только регистрацией образующихся частиц.

β-распад легче всего зарегистрировать, вылетающие частицы заряжены. Гамма-кванты регистрировать трудно.

При распаде происходит распределение энергии между образовавшимися частицами.

Для каждого изотопа есть Е_max, т.е. случай, когда вся Е досталась электрону. Величина энергии конечна, из закона сохранения энергии. Чему равен минимум?

Длина свободного пробега – то расстояние, но которое может продвинуться частица после испускания. .Траектория прямолинейна, направление вектора движения– строго от испускающего атома. При движении в среде частица отдает энергию. Если энергии хватает для инициирования выбивания новой частицы (крайний вариант), испускается еще электрон. Движется, пока хватает энергии, потом – поглощается.

Длина пробега зависит от начальной энергии частицы и плотности среды, т.е., от количества столкновений, которые приводят к ионизации.

Длина пробега Р – 6 метров, нужна защита. А у Н – несколько долей мм?, и бог с ним.

Для К-захвата все хуже, т.к. энергия распределяется между вторичными электронами и гамма-квантами.

Что происходит с молекулой при рад. распаде? Выделяется энергия, не сопоставимая с энергией химических связей. Молекула «перегревается», происходит «распад в труху». Биополимеры распадаются но множество отдельных фрагментов – ионов, радикалов, просто фрагментов. [Почти то же происходит при образовании плазмы]

Электрон, гад, ионизует все, что ему попадается под руку. А под руку ему попадается наш радиопрепарат. Если радиопрепарат твердый, то он погибает почти мгновенно, не успев распасться. Если у нас раствор, образуется куча левых ионов и радикалов, включая ОН-радикалы. Эи радикалы реагируют, в т.ч и с препаратом.

Радиолиз: