Выделение чистой культуры из одной клетки

Получение чистой культуры из одной клетки производится капельным методом, с помощью микроманипулятора и с помощью микроселектора.

Капельный метод Линднера. Этот метод используют при рабо­те с крупными микроорганизмами, такими, как дрожжи, плесневые грибы, водоросли. Для выделения чистой культуры названным методом разведения накопительной культуры проводят в стериль­ной среде с таким расчетом, чтобы в небольшой капельке разве­дения были единичные клетки микроорганизмов. Затем на поверх­ность стерильного покровного стекла стерильным стальным пером наносят ряд капель суспензии из приготовленного разведения. Готовят препарат «висячая капля». Нанесенные на покровное стекло капли микроскопируют и отмечают те из них. в которых обнаружена только одна клетка. После этого препарат «висячая капля» помещают в чашку Петри, на дне которой находится увлажненная фильтровальная бумага, и чашку ставят в термо-

стат. Через 12—24 час первоначально отмеченные капли вновь микроскопируют. Те капли, в которых произошло размножение клетки, осторожно снимают с покровного стекла кусочками сте­рильной фильтровальной бумаги и переносят в пробирки со сте­рильной жидкой средой.

Выделение единичных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор (рис. 56)—прибор, позволяющий с помощью

специальной микроскопической пипетки извлекать под контролем микроскопа одну клетку из суспензии. Микроманипулятор имеет два операционных штатива, между которыми расположен обычный микроскоп. На предметном столике микроскопа установлена влаж­ная камера, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки. Их перемещение в поле зрения микроскопа осуществляют с мик­ронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Микропи­петки вводят во влажную камеру таким образом, чтобы их концы оказались в висячей капле, и под контролем глаза извлекают ими

отдельные клетки. Извлеченные клетки переносят в пробирки со стерильной жидкой средой.

Выделение единичных клеток с помощью микроселектора Пер­фильева. Наиболее существенной частью микроселектора Пер­фильева является стеклянный микрокапилляр, имеющий строго прямоугольное сечение. Благодаря этому канал капилляра хорошо просматривается даже с иммерсионным объективом. Капилляр заполняют исследуемой суспензией клеток и при большом увели­чении микроскопа находят участок с одной клеткой. Специальным приспособлением этот участок капилляра под контролем глаза стерильно выбивают в приемник, из которого затем переносят его в стерильную среду. Микроселектор Перфильева может быть использован для выделения как крупных, так и мелких микроорга­низмов.

Определение чистоты выделенной культуры

Чистота культуры выделенного микроорганизма должна быть обязательно проверена. Это осуществляется одновременно не­сколькими способами — визуальным, микроскопическим контролем и высевом на ряд питательных сред.

Визуальный контроль проводят, когда выделенная культура микроорганизмов высеяна на поверхность скошенного агара. Если культура чистая, то характер ее роста на скошенном агаре одно­роден по всему штриху. Если штрих неоднороден, культура счи­тается загрязненной.

Проверка чистоты выделенной культуры обязательно вклю­чает микроскопический контроль. Для этого следует приготовить препарат фиксированных окрашенных клеток и исследовать его с иммерсионной системой, или препарат живых клеток и просмот­реть его, используя фазово-контрастное устройство. Чистая куль­тура, как правило, морфологически однородна, допустимо лишь незначительное варьирование размеров клеток. Однако необходи­мо помнить, что клетки некоторых микроорганизмов, например, микобактерий очень полиморфны, поэтому определение чистоты таких культyp при микроскопировании затруднительно.

Помимо визуального и микроскопического контроля, чистоту полученной культуры микроорганизмов проверяют высевом ее на ряд питательных сред. Прежде всего выделенную культуру микро­организмов высевают на плотную среду, благоприятную для ее развития. Высев проводят с таким расчетом, чтобы получить изо­лированные колонии, однородность которых свидетельствует о чи­стоте выделенной культуры микроорганизмов. Обязателен посев на мясо-пептонный агар — среду, благоприятную для развитии многих гетеротрофных организмов. Свидетельством чистоты выде­ленной культуры является также однородность выросших колоний или, напротив, отсутствие роста, если данные микроорганизмы на

мясо-пептоном агаре не развиваются. Следует иметь в виду, что заключение о чистоте некоторых культур микроорганизмов нельзя сделать только по результатам высева на вышеуказанные среды. Особенно это касается автотрофных микроорганизмов, а также представителей гетеротрофных организмов, склонных развиваться в симбиозе с одним или несколькими спутниками. Чистоту таких культур микроорганизмов проверяют высевом еще на ряд сред, таких как сусло, мясо-пептонный бульон, картофельный агар и другие. Набор сред и их состав определяется особенностями обме­на веществ выделяемых микроорганизмов и их возможных спут­ников.