Лабораторна робота

ОБОРОТНА ТА НЕОБОРОТНА ДЕНАТУРАЦІЯ БІЛКІВ

Мета роботи: за допомогою експерименту дослідити зміну нативних властивостей білкових розчинів під впливом солей важких металів та етилового спирта.

Стислі теоретичні відомості

1. Оборотне осадження. У таких реакціях молекули білків не зазнають глибоких змін, тому осаджені білки можуть знову переходити в розчин (відбуватиметься ренатурація білка). До оборотних реакцій осадження відносять більшість реакцій висолювання білків, реакції осадження їх спиртом або ацетоном (у разі нетривалої дії цих реактивів і при невисокій температурі).

2. Необоротне осадження. У таких реакціях білки зазнають глибоких структурних змін і їх не можна буде знову перевести у розчин, з якого їх осадили. Тобто відбувається необоротна денатурація білка.

Денатурацією називають таку зміну білка, за якої він втрачає свої нативні біологічні і фізико-хімічні властивості, стає менш гідрофільним, у наслідок чого, не може розчинятися в первинному розчиннику.

До необоротних реакцій осадження білків відносять осадження солями важких металів, кислотами тощо, а також осадження білків під час нагрівання.

Більшість білків належать до гідрофільних високомолекулярних речовин, які під час розчинення у воді утворюють розчини, поведінка яких нагадує поведінку колоїдних розчинів.

Колоїдним називають такий розчин, у якому одна фаза розподілена (диспергована) в інший у вигляді дуже дрібних частинок.

Гідратна оболонка з молекул води навколо білка перешкоджає об'єднанню білкових макромолекул. Це, у свою чергу, запобігає осадженню білків. Наявність однойменного (найчастіше негативного) електричного заряду білкових частинок також обумовлює їх взаємне відштовхування. Під час додавання солей лужних і лужноземельних металів (наприклад, Na₂SO_4, NaCl, MgSO₄) до білкових розчинів позитивно заряджені іони металів адсорбуються на поверхні білкових частинок. При цьому відбувається взаємна нейтралізація зарядів, що спричинює коагуляцію білка.

Коагуляцією розчину називають об’єднання менших за розміром колоїдних частинок у більші, що, у свою чергу, приводить до седиментації  осідання частинок під дією сили тяжіння.

За певної концентрації солі (так названий поріг коагуляції) відбувається осадження білка з розчину. Спосіб осадження білків під дією солей-електролітів називають висолюванням. Цей процес оборотний. Коагуляція різних білків відбувається за різних концентрацій того самого електроліту (різні пороги коагуляції). Ось чому білки можна висолювати фракційно.

Послідовність проведення дослідження

Дослід 1. Осадження білків етиловим спиртом

Реактиви:

 водний розчин білка (білок курячих яєць відокремлюють від жовтків, змішують із 19  20-кратним об’ємом дистильованої води і фільтрують через декілька прошарків марлі);

 етиловий спирт C₂H₅OH;

 кристалічний хлорид натрію.

Багато органічних розчинників (спирти, ацетон тощо) осаджують білки з нейтральних і слабкокислих розчинів. Механізм дії, наприклад, спирту можна пояснити зв’язуванням молекул води, що спричинює когуляцію білкових частинок і, як наслідок, осадження білка. Якщо в розчині міститься ще й невелика кількість солі, наприклад, хлориду натрію, осад білка утворюється швидше і більш повно.

У пробірку наливають 1  2 мл водного розчину білка, вносять декілька кристалів сухого хлориду натрію й обережно перемішують розчин. У пробірку по краплях додають 2  3 мл етилового спирту і сильно струшують вміст пробірки. Через декілька хвилин спостерігають осадження білка.

Якщо осадження білка проводити на холоді, а його осад швидко відокремити від спирту, то можна знову одержати розчин білка (відбуватиметься ренатурація). Це свідчить про те, що нативні властивості білка під час осадження його спиртом не змінюються, і таке зсідання є оборотним. У разі тривалого контакту білкового розчину зі спиртом білок денатурує необоротно, і його неможливо знову перевести в розчин.

Дослід 2. Зсідання білків солями важких металів

Реактиви:

 водний розчин білка;

 0,5 %-й водний розчин ацетату плюмбуму Pb(CH₃COO)₂;

 5 %-й водний розчин сульфату купруму (II) CuSO₄;

 3 %-й водний розчин нітрату аргентуму AgNO₃;

 насичений водний розчин хлориду натрію NaCl.

Білки осаджуються з водних розчинів солями важких металів (наприклад, плюмбуму, купруму, аргентуму, меркурію тощо). При цьому, як правило, утворюються стійкі комплексні сполуки. На відміну від коагуляції білків солями лужних і лужноземельних металів, для осадження білка потрібні досить невеликі концентрації солей важких металів.

Надлишок солей плюмбуму (наприклад, Pb(CH₃COO)₂) або купруму (наприклад, CuSO₄) у білковому розчині у разі перевищення порога коагуляції спричинює розчинення утвореного ними первинного осаду. Це пояснюється адсорбцією (зміною концентрації речовини поблизу поверхні розділення фаз) надлишку іонів металу на поверхні білкового комплексу і його перезарядженням. При цьому в розчин переходить комплексна сполука зміненого білка з металом.

Здатність білків зв’язувати іони важких металів у стійкі комплексні сполуки застосовують у медичній практиці: багаті на білки молоко і яйця використовують як протиотруту при отруєнні солями меркурію, плюмбуму або купруму (ці продукти слід вжити одразу після отруєння).

1. У три пробірки наливають по 1  2 мл білкового розчину. У першу пробірку по крап лях додають розчин ацетату плюмбуму Pb(CH₃COO)₂, у другу  розчин сульфату купруму CuSO₄, у третю  нітрату аргентуму AgNO₃. Спостерігають осадження білка цих пробірках.

2. У пробірки, в яких реагентами були ацетат плюмбуму і сульфат купруму, додають надлишок розчинів цих солей. Спостерігають розчинення утворених осадів.

Дослід 3. Осадження білків мінеральними кислотами

Реактиви:

 концентрована соляна (хлороводнева) кислота HCl;

 концентрована сірчана (сульфатна) кислота Н₂SO₄;

 концентрована азотна (нітратна) кислота HNO₃;

 водний розчин білка.

Дія концентрованих мінеральних (неорганічних) кислот, крім ортофосфорної (H₃PO₄), викликає необоротну коагуляцію білків із розчинів. Наявність надлишку кислоти (за винятком азотної) приводить до розчинення первинного осаду.

У три пробірки обережно наливають по 1  2 мл мінеральних кислот: у першу – концентровану соляну, у другу  концентровану сірчану, а в третю  концентровану азотну. У кожну пробірку обережно додають приблизно по 1 мл водного розчину білка.

На межі розділу двох рідин спостерігають осадження білка як невеликого білого кільця. Обережно струшують пробірки. Спостерігають розчинення утворених осадів у надлишку соляної і сірчаної кислот. У пробірці з азотною кислотою осад _____________

ДІАЛІЗ БІЛКА

Стислі теоретичні відомості

Діалізом називають метод очищення колоїдних розчинів від низькомолекулярних органічних і мінеральних домішок за допомогою їхньої дифузії через мембрани, практично непроникні для колоїдних макрочастинок.

Білкові міцели, які є високомолекулярними речовинами, у розчині внаслідок великих розмірів не можуть дифундувати (проникати) через напівпроникну мембрану. Цю властивість білка використовують для очищення його розчинів від низькомолекулярних органічних або неорганічних домішок.

Найпростішим діалізатором слугує колодієвий (або целофановий) мішечок, занурений у посудину з дистильованою водою.