1.. 3.8. Рост и размножение бактерий

Рост – увеличение размеров отдельной особи и упорядоченное воспроизведение всех химических компонентов и структур.

Размножение – процесс воспроизведения себе подобных особей, обеспечивающий продолжение существования вида.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты размножаются путем фрагментации нитевидных клеток, могут размножаться спорами.

Грамположительные бактерии делятся путем врастания внутрь клетки синтезирующихся перегородок деления, а грамотрицательные – путем перетяжки, в результате чего формируются гантелевидные фигуры, из которых образуются две одинаковых клетки. Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу, приводящая к удвоению молекул ДНК нуклеоида.

Образовавшиеся в результате репликации две хромосомы расходятся, чему способствует увеличение размеров растущей клетки. По мере увеличения объема клетки прикрепленные к ЦПМ хромосомы удаляются друг от друга. Окончательное их обособление завершается образованием перетяжки или перегородки деления. Клетки с перегородкой деления расходятся в результате действия аутолитических ферментов, которые разрушают сердцевину перегородки деления.

Аутолиз может происходить неравномерно, и тогда делящиеся клетки в одном участке остаются связанными частью клеточной стенки в области перегородки деления. Такие клетки располагаются под углом друг к другу, что характерно для дифтерийных коринебактерий.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит к истощению среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называется периодическим культивированием, а культуру – периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура – непрерывной. При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдаются: придонный рост, диффузное помутнение среды, образование пленки на поверхности среды.

Рост бактерий на жидкой среде подразделяют на несколько фаз или периодов.

І. Исходная стационарная фаза (1-2 часа) – время от момента посева до начала роста.

ІІ. Lag-фаза (запаздывание) – период между посевом бактерий и началом размножения. В лаг-фазе не увеличивается число клеток, но идет метаболизм, увеличивается количество белка, РНК, размеры, и остается неизменным количество ДНК. Идет фенотипическая и генотипическая адаптация к среде, синтезируются индуцибельные ферменты. Продолжительность фазы 4-5 часов.

ІІІ. Log-фаза (фаза логарифмического роста). Характеризуется максимальной скоростью размножения бактерий для данной среды. Число клеток в культуре возрастает в геометрической прогрессии. Продолжительность 5-6 часов. Большинство видов бактерий делится каждые 20-30 мин, хотя существуют виды (микобактерии туберкулеза), которые делятся каждые 18 часов.

ІV. Фаза отрицательного ускорения – начинается замедление размножения из-за истощения питательной среды (около 2 ч).

V. Стационарная фаза максимума – когда количество погибших клеток равно количеству вновь появившихся. Она характеризуется М-концентрацией (концентрация микробных клеток в единице объема достигает максимума, длительность фазы составляет 2 ч).

VI. Фаза ускорения гибели (3 ч).

VII. Фаза логарифмической гибели, когда отмирание клеток происходит с постоянной скоростью (5 ч).

VII. Фаза уменьшения скорости отмирания –остающиеся в живых особи переходят в состояние покоя.

Продолжительность фаз гибели колеблется от десятка часов до нескольких недель.

Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотной питательной среде, образуют изолированные колонии, которые представляют собой видимые скопления особей одного вида микроорганизмов, образующихся из одной или нескольких клеток.

Колонии бывают выпуклыми, плоскими, куполообразными, вдавленными. Поверхность их – гладкой (S-формы) или шероховатой (R-формы), края – ровные или неровные. Форма колоний может быть различной: круглая, розеткообразная, звездчатая и др. По величине колонии подразделяют на крупные (4-5 мм в диаметре), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и карликовые (меньше 1 мм).

Колонии отличаются также по консистенции (сухие, слизистые, влажные), цвету, который зависит от наличия пигментов.

Характер роста на плотных и жидких питательных средах относят к культуральным свойствам бактерий.

2. . Белки иммуноглобулинов по химическому составу относятся к гликопротеидам, так как состоят из проте­ина и Сахаров; построены из 18 аминокислот. Имеют видовые отличия, связанные главным образом с набором аминокислот. Молекулярная масса иммуноглобулинов находится в пределах 150—900 кД. Их молекулы имеют цилиндрическую форму, они видны в электронном микроскопе. До 80 % иммуноглобулинов имеют константу седиментации 7S; устойчивы к слабым кисло­там, щелочам, нагреванию до 60 °С. Выделить иммуноглобули­ны из сыворотки крови можно физическими и химическими ме­тодами (электрофорез, изоэлектрическое осаждение спиртом и кислотами, высаливание, аффинная хроматография и др.). Эти методы используют в производстве при приготовлении иммуно­биологических препаратов.

Иммуноглобулины по структуре, антигенным и иммунобио­логическим свойствам разделяются на пять классов: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD (табл. 9.1). Иммуноглобулины M, G, А имеют под­классы. Например, IgG имеет четыре подкласса (IgG,, IgG₂, IgG₃, IgG₄). Все классы и подклассы различаются по аминокис­лотной последовательности

Вследствие высокой специ­фичности и большой роли в защитных иммунных реакциях ан­титела используют для диагностики инфекционных и неинфек­ционных заболеваний, определения иммунного статуса организ­ма, профилактики и терапии ряда инфекционных и неинфек­ционных болезней. Для этого существуют соответствующие им­мунобиологические препараты, созданные на основе антител и имеющие целевое назначение

выпускаются комплексные препараты иммуноглобулина, предназначенные для разных способов введения. Гамма-глобулины вводят в организм подкожно, внутримышечно, внутривенно. Возможно также введение в спинномозговой канал.

  При внутривенном введении для снижения антикомплементарной активности применяют различные способы предотвращения образования белковых агрегатов и их удаления, а также методы ферментативного расщепления или изменения структуры Fc-фрагментов, ответственных за побочное действие иммуноглобулинов. Для предупреждения агрегирования используют различного рода стабилизаторы, пригодные для внутривенного введения (полиэтиленгликоль, человеческий сывороточный альбумин, химически модифицированный желатин, сахара).

Билет 45.

1 Особенности анаболизма у разных групп микробов. Способы поступления питательных веществ в клетку, классификация микробов по этому принципу.

Поступление питательных веществ в микробную клетку может происходить за счёт:

• осмоса и диффузии по градиенту концентрации без затрат энергии или с помощью ферментов-пермеаз (облегчённая диффузия)

• пассивного транспорта, который также осуществляется по градиенту концентрации с помощью белков-переносчиков и без затрат энергии

• активного транспорта, который идёт против градиента концентрации с затратой энергии и осуществляется также белками-переносчиками

По источникам углерода бактерии делятся на следующие группы:

• автотрофы – используют в качестве единственного источника углерода CO₂

• гетеротрофы – используют в качестве источника углерода разнообразные органические углеродосодержащие соединения как биологического, так и небиологического происхождения

В зависимости от источника получения энергии микроорганизмы делятся на:

• фототрофы – способны использовать солнечную энергию

• хемотрофы – получают энергию за счёт ОВР

В зависимости от природы доноров электронов:

• литотрофы – используют неорганические соединения

• органотрофы – используют только органические соединения

По источникам азота:

• азотфиксирующие – способны усваивать молекулярный азот атмосферы

• аммонифицирующие – ассимилирующие неорганический азот солей аммония

• нитратредуцирующие – ассимилирующие неорганический азот нитратов

• нитритредуцирующие – ассимилирующие неорганический азот нитритов

2. При ряде инфекционных заболеваний организм приобретает повышенную чувствительность к аллергенам бактерий их вызывающих. Этот феномен помогает установлению этиологического диагноза. В ряде случаев специфическая бактериальная аллергия формируется рано, в первые дни болезни, что используют в целях ранней диагностики туляремии (внутрикожная аллергическая проба с тулярином становится положительной на 2-й - 3-й день).

В других случаях аллергическая перестройка организма происходит позднее и выявление специфической аллергии может быть использовано в интересах ретроспективного диагноза. Методы гипосенсибилизации организма с помощью соответствующих аллергенов используют для лечения больных некоторыми хроническими формами болезней. Лечебное применение бактериальных аллергенов оправдано в случаях, когда антибактериальная терапия и другие методы лечения не достигают успеха и болезнь приобретает хроническое рецидивирующее течение.

Метод аллергических проб – реакция Манту с туберкулином.

Внутрикожно вводят туберкулин PPD (PPD – очищенный белковый дериват). Если организм инфицирован (иммунен), то через 24-48-72 часа наблюдается инфильтрация и гиперемия, т.е. развивается ПЧЗТ. У больных туберкулезом диаметр папулы на 6 мм (и более) больше, чем у вакцинированных.

Билет 44

1… Типы дыхания у микробов. Способы культивирования микробов с различным типом дыхания.

Классификация микробов по типу дыхания:

1. Аэробы – для получения энергии нуждаются в свободном доступе кислорода

   • строгие – не могут жить и размножаться в отсутствие молекулярного кислорода

2. Анаэробы – получают энергию без доступа кислорода путём расщепления питательных веществ

• облигатные (строгие) – не переносят присутствия даже следов кислорода, который для них является ядом (напр., патогенные клостридии)

• факультативные – могут расти и размножаться как в присутствии кислорода воздуха, так и без него

Посевы на анаэробную микрофлору производят в строго анаэробных условиях. Посев на специальные среды – железосульфитный агар (среда Вильсона-Блера), среда Китта-Тароцци. Посев уколом в плотную среду. Культивирование в анаэростатах или в вакуум-эксикаторах.

2.. 9.17.1. Вакцины

Вакцинами называют иммунобиологические препараты, предназ­наченные для создания активного специфического иммунитета. Применяют их главным образом для профилактики, но иногда используют для лечения инфекционных болезней. Действующим началом вакцины является специфический антиген. В качестве антигена используют:

• живые или инактивированные микроорганизмы (бактерии, вирусы);

• выделенные из микроорганизмов специфические, так назы­ваемые протективные, антигены;

10

• образуемые микроорганизмами антигенные вещества (вторич­ные метаболиты), играющие роль в патогенезе болезни (ток­сины);

• химически синтезированные антигены, аналогичные природ­ным;

• антигены, полученные с помощью метода генетической ин­женерии.

На основе одного из этих антигенов конструируют вакцину, которая может в зависимости от природы антигена и формы препарата включать консервант, стабилизатор и активатор (адъ-ювант). В качестве консервантов применяют мертиолат (1:10 000), азид натрия, формальдегид (0,1—0,3 %) с целью подавления по­сторонней микрофлоры в процессе хранения препарата. Стаби­лизатор добавляют для предохранения от разрушения лабильных антигенов. Например, к живым вакцинам добавляют сахарозо-желатиновый агар или человеческий альбумин. Для повышения эффекта действия антигена к вакцине иногда добавляют неспе­цифический стимулятор-адъювант, активирующий иммунную си­стему. В качестве адъювантов используют минеральные коллои­ды (А1(ОН)₃, А1Р0₄), полимерные вещества (липополисахариды, полисахариды, синтетические полимеры). Они изменяют физико-химическое состояние антигена, создают депо антигена на мес-

Живые вакцины

• аттенуированные;

• дивергентные;

• векторные рекомбинантные.

Неживые вакцины:

• молекулярные: полученные путем биосинтеза; полученные путем химического синтеза; полученные методом генетической инженерии;

• корпускулярные: цельноклеточные, цельновирионные; субклеточные, субвирионные; синтетические, полусинтетические.

Ассоциированные вакцины

11

те введения. Вакцины с адъювантами называют адъювантными, сорбированными, адсорбированными или депонированными вак­цинами.

В зависимости от природы, физического состояния в препа­рате и способа получения антигена вакцины делятся на живые и неживые, или инактивированные.

9.17.1.1. Живые вакцины

Живые аттенуированные вакцины конструируются на основе ослабленных штаммов микроорганизмов, потерявших ви­рулентность, но сохранивших антигенные свойства. Такие штам­мы получают методами селекции или генетической инженерии. Иногда используют штаммы близкородственных в антигенном от­ношении, неболезнетворных для человека микроорганизмов (ди­вергентные штаммы), из которых получены дивергентные вакцины. Например, для прививки против оспы используют вирус оспы коров. Живые вакцины при введении в организм при­живляются, размножаются, вызывают генерализованный вакци­нальный процесс и формирование специфического иммунитета к патогенному микроорганизму, из которого получен аттенуи-рованный штамм.

Получают живые вакцины путем выращивания аттенуирован-ных штаммов на питательных средах, оптимальных для данного микроорганизма. Бактериальные штаммы культивируют или в ферментерах на жидких питательных средах, или на твердых пи­тательных средах; вирусные штаммы культивируют в куриных эм­брионах, первично-трипсинизированных, перевиваемых культу­рах клеток. Процесс ведут в асептических условиях. Биомассу ат-тенуированного штамма подвергают концентрированию, высуши­ванию со стабилизирующей средой, затем ее стандартизируют по числу микроорганизмов и фасуют в ампулы или флаконы. Консервант к живой вакцине не добавляют. Обычно одна при­вивочная доза вакцины составляет 10³—10⁶ живых микроорганиз­мов. Срок годности вакцины ограничен 1—2 годами, вакцина должна храниться и транспортироваться при пониженной тем­пературе (от 4 до 8 °С).

Живые вакцины применяют, как правило, однократно; вводят их подкожно, накожно или внутримышечно, а не­которые вакцины — перорально (полиомиелит) и ингаля-ционно.

Живые вакцины составляют примерно половину всех приме­няемых в практике вакцин. Наиболее важные для иммунопро­филактики живые вакцины приведены ниже.

Бактериальные живые вакцины: туберкулезная (из штамма

12

БЦЖ, полученного А. Кальметтом и К. Гереном); чумная (из штамма EV, полученного Г. Жираром и Ж. Робиком); туляремий-ная (из штамма №15, полученного Б. Я. Эльбертом и Н. А. Гай-ским); сибиреязвенная (из штамма СТИ-1, полученного Н. Н. Гинзбургом, Л. А. Тамариным и Р. А Салтыковым); бруцел­лезная (из штамма 19-ВА, полученного П. А. Вершиловой); про­тив Ку-лихорадки (из штамма М-44, полученного В. А. Гениг и П. Ф. Здродовским).

Вирусные живые вакцины: оспенная (на основе вируса оспы коров); коревая (из штамма Л-16 и штамма Эдмонстон, полу­ченных А. А. Смородинцевым и М. П. Чумаковым); полиомиелит-ная (из штаммов А. Сэбина типов 1, 2, 3); против желтой ли­хорадки (из штамма 17D); гриппозная (из лабораторных штам­мов, полученных В. М. Ждановым и др.); против венесуэльского энцефаломиелита лошадей (из штамма 230, полученного В. А. Андреевым и А. А. Воробьевым); паротитная (из штаммов, полученных А. А. Смородинцевым и Н. С. Клячко).

Существуют или разрабатываются живые вакцины для про­филактики других вирусных и бактериальных инфекций (адено­вирусная, против краснухи, легионеллеза и др.). К живым вак­цинам относятся так называемые векторные рекомбинан­тные вакцины, которые получают методом генетической инженерии. Векторные вакцинные штаммы конструируют, встра­ивая в геном (ДНК) вакцинного штамма вируса или бактерий ген чужеродного антигена. В результате этого векторный вакцин­ный штамм после иммунизации вызывает иммунитет не только к вакцинному штамму-реципиенту, но и к новому чужеродно­му антигену. Уже получены рекомбинантные штаммы вируса оспенной вакцины с встроенным антигеном HBs вируса гепа­тита В. Такая векторная вакцина может создавать иммунитет против оспы и гепатита В одновременно. Изучается также век­торная вакцина на основе вируса осповакцины и антигена ви­руса бешенства, клещевого энцефалита.

9.17.1.2. Неживые (инактивированные) вакцины

К таким вакцинам относятся корпускулярные бактериальные и вирусные вакцины, корпускулярные субклеточные и субъединич­ные вакцины, а также молекулярные вакцины.

Корпускулярные вакцины представляют собой инакти­вированные физическими (температура, УФ-лучи, ионизирую­щее излучение) или химическими (формалин, фенол, р-пропио-лактон) способами культуры патогенных или вакцинных штам­мов бактерий и вирусов. Инактивацию проводят в оптимальном режиме (инактивирующая доза, температура, концентрация мик­

13

роорганизмов), чтобы сохранить антигенные свойства микроор­ганизмов, но лишить их жизнеспособности. Корпускулярные вак­цины, полученные из цельных бактерий, называют цельно -клеточными, а из неразрушенных вирионов — цельнови-рионными.

Инактивированные вакцины готовят в асептических условиях на основе чистых культур микроорганизмов. К готовым, дози­рованным (по концентрации микроорганизмов) вакцинам добав­ляют консервант. Вакцины могут быть в жидком (суспензии) или сухом виде. Вакцинацию выполняют 2—3 раза, вводя препарат подкожно, внутримышечно, аэрозольно, иногда перорально. Кор­пускулярные вакцины применяют для профилактики коклюша, гриппа, гепатита А, герпеса, клещевого энцефалита.

К корпускулярным вакцинам относят также субклеточные и субвирионные вакцины, в которых в качестве действу­ющего начала используют антигенные комплексы, выделенные из бактерий или вирусов после их разрушения. Приготовление субклеточных и субвирионных вакцин сложнее, чем цельнокле-точных и цельновирионных, однако такие вакцины содержат меньше балластных компонентов микроорганизмов.

Раньше субклеточные и субвирионные вакцины называли хи­мическими, поскольку применяли химические методы при вы­делении антигенов, из которых готовили вакцину. Однако этот термин более применим к вакцинам, полученным методом хи­мического синтеза.

В настоящее время используют субклеточные инактивирован­ные вакцины против брюшного тифа (на основе О-, Н- и Vi-антигенов), дизентерии, гриппа (на основе нейраминидазы и гемагглютинина), сибирской язвы (на основе капсульного ан­тигена) и др. Такие вакцины, как правило, применяют с до­бавлением адъювантов.

Молекулярные вакцины. К ним относят специфические антигены в молекулярной форме, полученные методами биоло­гического, химического синтеза, генетической инженерии. Прин­цип метода биосинтеза состоит в выделении из микроорганиз­мов или культуральной жидкости протективного антигена в мо­лекулярной форме. Например, истинные токсины (дифтерийный, столбнячный, ботулиновый) выделяются клетками при их рос­те. Молекулы токсина при обезвреживании формалином превра­щаются в молекулы анатоксинов, сохраняющие специфичес­кие антигенные свойства, но теряющие токсичность. Следователь­но, анатоксины являются типичными представителями молеку­лярных вакцин. Анатоксины (столбнячный, дифтерийный, боту­линовый, стафилококковый, против газовой гангрены) получа­ют путем выращивания глубинным способом в ферментаторах возбудителей столбняка, дифтерии, ботулизма и других микроорганизмов, в результате чего в культуральной жидкости накап­ливаются токсины. После отделения микробных клеток сепари­рованием культуральную жидкость (токсин) обезвреживают фор­малином в концентрации 0,3—0,4 % при 37 °С в течение 3—4 нед. Обезвреженный токсин — анатоксин, потерявший токсичность, но сохранивший антигенность, подвергают очистке и концент­рированию, стандартизации и фасовке. К очищенным анатокси­нам добавляют консервант и адъювант. Такие анатоксины назы­вают очищенными сорбированными. Дозируют анатоксин в ан­тигенных единицах (ЕС — единица связывания, ЛФ — флокку-ляционная единица). Применяют анатоксины подкожно, внутри­мышечно; схема иммунизации состоит из 2—3 прививок с пос­ледующими ревакцинациями.

Выделение протективных антигенов в молекулярной форме из самих микроорганизмов — задача довольно сложная, поэтому приготовление молекулярных вакцин этим способом не вышло за рамки эксперимента. Более продуктивным оказался метод ге­нетической инженерии, с помощью которого получены реком­бинантные штаммы, продуцирующие антигены бактерий и ви­русов в молекулярной форме. На основе таких антигенов мож­но создавать вакцины. Так, уже разработана и выпускается про­мышленностью молекулярная вакцина, содержащая антигены вируса гепатита В, продуцируемые рекомбинантными клетка­ми дрожжей. Создана молекулярная вакцина против ВИЧ из антигенов вируса, продуцируемых рекомбинантными штамма­ми Е. coli.

Химический синтез молекулярных антигенов пока широко не применяется из-за своей сложности. Однако уже получены ме­тодом химического синтеза некоторые низкомолекулярные ан­тигены [Петров Р. В., Иванов В. Т. и соавт. и др.]. Это направле­ние, безусловно, будет развиваться.

АТТЕНУАЦИЯ - АТТЕНУАЦИЯ (от лат. attenuatio - уменьшение) - искусственное стойкое ослабление вирулентности патогенных микроорганизмов, сохраняющих способность вызывать иммунитет. Используется при изготовлении живых вакцин против туберкулеза, оспы и др. 

Билет 43

1… . Особенности катаболизма у разных групп микробов. Виды энергетического обмена. Классификация микробов в зависимости от особенностей энергообмена.

Для синтеза структурных компонентов микробной клетки и поддержания процессов жизнедеятельности наряду с питательными веществами требуется достаточное количество энергии. Эта потребность удовлетворяется за счёт биологического окисления, в результате которого происходит синтез макроэргических соединений – молекул АТФ, представляющих собой универсальный источник энергии.

Классификация микробов:

3. Аэробы – для получения энергии нуждаются в свободном доступе кислорода

   • строгие – не могут жить и размножаться в отсутствие молекулярного кислорода

4. Анаэробы – получают энергию без доступа кислорода путём расщепления питательных веществ

• облигатные (строгие) – не переносят присутствия даже следов кислорода, который для них является ядом (напр., патогенные клостридии)

• факультативные – могут расти и размножаться как в присутствии кислорода воздуха, так и без него

Молекулы АТФ образуются двумя метаболическими путями:

1. Субстратное фосфорилирование

   • Гликолитический путь – присущ облигатным и факультативным анаэробам, бродильный метаболизм

     • Молочнокислое брожение (роды Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium)

     • Муравьинокислое брожение (сем. Enterobacteriaceae)

     • Маслянокислое брожение (род Clostridium)

   • Гексозомонофосфатный путь – характерен для большинства микроорганизмов

   • Кетодезоксифосфоглюконатный путь – в основном у аэробов (род Pseudomonas), окислительный метаболизм

Окислительное фосфорилирование – аэробы и факультативные анаэробы

2.. 2. Антитоксические сыворотки содержат антитела против экзотоксинов.Их получают путем гипериммунизации животных (лошадей) анатоксином.

Активность таких сывороток измеряется в АЕ (антитоксиче­ских единицах) или ME (международных единицах) — это минимальное количество сыворотки, способное нейтрализовать определенное количество (обычно 100 DLM) токсина для жи­вотных определенного вида и определенной массы. В настоящее время в России

антитоксические сыворотки:

•  противодифтерийная;

•  противостолбнячная;

широко используются следующие

•  противогангренозная;

•  противоботулиническая.

Применение антитоксических сывороток при лечении соответ­ствующих инфекций обязательно.

3. Антимикробные сыворотки содержат антитела против клеточных антигенов возбудителя. Их получают иммунизацией животных клетками соответствующих возбудителей и дозируют в милли­литрах. Антимикробные сыворотки могут применяться при лечении:

•  сибирской язвы;

•  чумы;

•  стрептококковых инфекций;

•  стафилококковой инфекции;

•  синегнойной инфекции.

Билет 42