ТРАНСКРИПЦИЯ- первая стадия реализации генетической информации в клетке. В ходе процесса образуются молекулы мРНК, служащие матрицей для синтеза белков, а также транспортные, рибосомальные и другие виды молекул РНК, выполняющие структурные, адапторные и каталитические функции.

Транскрипция у эукариотов происходит в ядре. В основе механизма транскрипции лежит тот же структурный принцип комплементарного спаривания оснований в молекуле РНК (G ≡ C, A=U и Т=А). ДНК служит только матрицей и в ходе транскрипции не изменяется. Рибонукле-озидтрифосфаты (ЦТФ, ГТФ, АТФ, УТФ) -субстраты и источники энергии, необходимые для протекания полимеразной реакции, образования 3',5'-фосфодиэфирной связи между рибонуклеозидмонофосфатами.

Синтез молекул РНК начинается в определённых последовательностях (сайтах) ДНК, которые называют промоторы, и завершается в терминирующих участках (сайты терминации). Участок ДНК, ограниченный промотором и сайтом терминации, представляет собой единицу транскрипции - транскриптон. У эукариотов в состав транскриптона, как правило, входит один ген (рис. 4-27), у прокариотов несколько. В каждом транскриптоне присутствует неинформативная зона; она содержит специфические последовательности нуклеотидов, с которыми взаимодействуют регуляторные транскрипционные факторы.

Транскрипционые факторы - белки, взаимодействующие с определёнными регуляторными сайтами и ускоряющие или замедляющие процесс транскрипции. Соотношение информативной и неинформативной частей в транскриптонах эукариотов составляет в среднем 1:9 (у прокариотов 9:1).

Соседние транскриптоны могут быть отделены друг от друга нетранскрибируемыми участками ДНК. Разделение ДНК на множество транскриптонов позволяет осуществлять с разной активностью индивидуальное считывание (транскрипцию) разных генов.

В каждом транскриптоне транскрибируется только одна из двух цепей ДНК, которая называется матричной, вторая, комплементарная ей цепь, называется кодирующей. Синтез цепи РНК идёт от 5'- к З'-концу, при этом матричная цепь ДНК всегда антипараллельна синтезируемой нуклеиновой кислоте .

РНК-полимеразы

Биосинтез РНК осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами. В ядрах эукариотов обнаружены 3 специализированные РНК-полимеразы: РНК-полимераза I, синтезирующая пре-рРНК; РНК-полимераза II, ответственная за синтез пре-мРНК; РНК-полимераза III, синтезирующая пре-тРНК. РНК-полимеразы - олигомерные ферменты, состоящие из нескольких субъединиц - 2α, β, β', σ. Субъединица σ (сигма) выполняет регуляторную функцию, это один из факторов инициации транскрипции, РНК-полимеразы I, II, III, узнающие разные промоторы, содержат разные по строению субъединицы σ.

Стадии транскрипции

В процессе транскрипции различают 3 стадии: инициацию, элонгацию и терминацию.

Инициация

Активация промотора происходит с помощью большого белка - ТАТА-фактора, называемого так потому, что он взаимодействует со специфической последовательностью нуклеотидов промотора - ТАТААА- (ТАТА-бокс) .

Присоединение ТАТА-фактора облегчает взаимодействие промотора с РНК-полимеразой. Факторы инициации вызывают изменение кон-формации РНК-полимеразы и обеспечивают раскручивание примерно одного витка спирали ДНК, т.е. образуется транскрипционная вилка, в которой матрица доступна для инициации синтеза цепи РНК.

Транскрипция РНК на матричный цепи ДНК. Синтез РНК всегда происходит в направлении 5' → 3'.

После того как синтезирован олигонуклеотид из 8-10 нуклеотидных остатков, σ-субъединица отделяется от РНК-полимеразы, а вместо неё к молекуле фермента присоединяются несколько факторов элонгации.

Элонгация

Факторы элонгации повышают активность РНК-полимеразы и облегчают расхождение цепей ДНК. Синтез молекулы РНК идёт от 5'- к З'-концу комплементарно матричной цепи ДНК. На стадии элонгации, в области транскрипционной

вилки, одновременно разделены примерно 18 нуклеотидных пар ДНК. Растущий конец цепи РНК образует временную гибридную спираль, около 12 пар нуклеотидных остатков, с матричной цепью ДНК. По мере продвижения РНК-полимеразы по матрице в направлении от 3'- к 5'-концу впереди неё происходит расхождение, а позади - восстановление двойной спирали ДНК.

Терминация

Раскручивание двойной спирали ДНК в области сайта терминации делает его доступным для фактора терминации. Завершается синтез РНК в строго определенных участках матрицы - терминаторах (сайты терминации). Фактор терминации облегчает отделение первичного транскрипта (пре-мРНК), комплементарного матрице, и РНК-полимеразы от матрицы. РНК-полимераза может вступить в следующий цикл транскрипции после присоединения субъединицы σ.

Стадии транскрипции. 1 - присоединение ТАТА-фактора к промотору. Чтобы промотор был узнан РНК-полимера-зой, необходимо образование транскрипционного комплекса ТАТА-фактор/ТАТА-бокс (промотор). ТАТА-фактор остаётся связанным с ТАТА-боксом во время транскрипции, это облегчает использование промотора многими молекулами РНК-полимеразы; 2 - образование транскрипционной вилки; 3 - элонгация; 4.- терминация.

Ковалентная модиикация (процессинг) мРНК- (посттранскрипционные модификации пре-мРНК)

 Первичные транскрипты мРНК, прежде чем будут использованы в ходе синтеза белка, подвергаются ряду ковалентных модификаций. Эти модификации необходимы для функционирования мРНК в качестве матрицы.

Модификация 5'-конца (кэпирование): Модификации пре-мРНК начинаются на стадии элонгации. Когда длина первичного транскрипта достигает примерно 30 нуклеотидных остатков, происходит кэпирование его 5'-конца. Осуществляет кэпирование гуанилилтрансфераза. Фермент гидролизует макроэргическую связь в молекуле ГТФ и присоединяет нуклеотиддифосфатный остаток 5'-фосфатной группой к 5'-концу синтезированного фрагмента РНК с образованием 5', 5'-фосфодиэфирной связи. Последующее метилирование остатка гуанина в составе ГТФ с образованием N₇-метилгуанозина завершает формирование кэпа

Функции кэпа и связанных с ним белков:

• участие в сплайсинге;

• участие в процессинге 3'-конца мРНК;

• экспорт мРНК из ядра;

• защита 5'-конца транскрипта от экзонуклеаз;

• участие в инициации трансляции.

Модификация 3'-конца (полиаденилирование) специальным ферментом полиА-полимеразой формируется полиА-последовательность (полиА-"хвост"), состоящая из 100-200 остатков аде-ниловой кислоты.

Сигналом к началу полиаденилирования является последовательность -AAUAAA- на растущей цепи РНК. Фермент полиА-полимераза, проявляя экзонуклеазную активность, разрывает 3'-фосфоэфирную связь после появления в цепи РНК специфической последовательности -AAUAAA-. К 3'-концу в точке разрыва полиА-полимераза наращивает по-лиА-"хвост", Наличие полиА-последовательности на 3'-конце облегчает выход мРНК из ядра и замедляет её гидролиз в цитоплазме.

Ферменты, осуществляющие кэширование и полиаденилирование, избирательно связываются с РНК-полимеразой II, и в отсутствие полимеразы неактивны.

Сплайсинг первичных транскриптов мРНК

С появлением методов, позволяющих изучать первичную структуру молекул мРНК в цитоплазме и последовательность нуклеотидов кодирующей её геномной ДНК, было установлено, что они не комплементарны, а длина гена в несколько раз больше "зрелой" мРНК. Последовательности нуклеотидов, присутствующие в ДНК, но не входящие в состав зрелой мРНК, были названы некодирующими, или интроны, а последовательности, присутствующие в мРНК, - кодирующими, или экзоны. Таким образом, первичный транскрипт - строго комплементарная матрице нуклеиновая кислота (пре-мРНК), содержащая как экзоны, так и интроны. Длина интронов варьирует от 80 до 1000 нуклеотидов. Последовательности интронов "вырезаются" из первичного транскрипта, концы экзонов соединяются друг с другом. Такую модификацию РНК называют "сплайсинг" (от англ, to splice - сращивать). Сплайсинг происходит в ядре, в цитоплазму поступает уже "зрелая" мРНК.

Гены эукариотов содержат больше интронов, чем экзонов, поэтому очень длинные молекулы пре-мРНК (около 5000 нуклеотидов) после сплайсинга превращаются в более короткие молекулы цитоплазматической мРНК (от 500 до 3000 нуклеотидов).

Процесс "вырезания" интронов протекает при участии малых ядерных рибонуклеопротеинов (мяРНП). В состав мяРНП входит малая ядерная РНК (мяРНК), нуклеотидная цепь которой связана с белковым остовом, состоящим из нескольких протомеров. В сплайсинге принимают участие различные мяРНП.

Нуклеотидные последовательности нитронов функционально неактивны. Но на 5'- и З'-концах они имеют высокоспецифические последовательности - AGGU- и GAGG- соответственно (сайты сплайсинга), которые обеспечивают их удаление из молекулы пре-мРНК. Изменение структуры этих последовательностей влияет на процесс сплайсинга.

На первой стадии процесса мяРНП связываются со специфическими последовательностями первичного транскрипта (сайты сплайсинга), далее к ним присоединяются другие мяРНП. При формировании структуры сплайсосомы 3'-конец одного экзона сближается с 5'-концом следующего экзона. Сплайсосома катализирует реакцию расщепления 3',5'-фосфодиэфирной связи на границе экзона с интроном. Последовательность интрона удаляется, а два экзона соединяются. Образование 3',5'-фосфодиэфирной связи между двумя экзонами катализируют мяРНК (малые ядерные РНК), входящие в структуру сплайсосомы. В результате сплайсинга из первичных транскриптов мРНК образуются молекулы "зрелой" мРНК.

Биосинтез белков (трансляция)

Перевод информации, заключённой в полинуклеотидной последовательности мРНК, в аминокислотную последовательность белка требует определённого способа кодирования или шифрования, т.е. существования определённого закона, по которому чередование четырёх нуклеотидов в мРНК задаёт специфическую последовательность аминокислот в белке.

1 Стадия. Активирование аминокислот

тРНК. У человека около 50 различных тРНК обеспечивают включение аминокислот в белок. тРНК называют " адапторные молекулы", так как к акцепторному концу этих молекул может быть присоединена определённая аминокислота, а с помощью антикодона они узнают специфический кодон на мРНК. В процессе синтеза белка на рибосоме связывание антикодонов тРНК с кодонами мРНК происходит по принципу комплементарности и антипараллельности.

Строение тРНК: вторичная структура, получившая назв. клеверного листа (см. рис.). В ней выделяют: акцепторную ветвь (стебель, черешок) с универсальной 3'-концевой последовательностью, служащей акцептором (местом прикрепления) остатка аминокислоты; дигидроуридиловую ветвь (шпильку), варьирующую по числу входящих в ее состав нуклеотидов и содержащую до 3 остатков дигидро-уридина (DHU); антикодоновую ветвь (шпильку) с петлей в 7 нуклеотидных остатков, в центре к-рой находится анти-кодон (тринуклеотид, комплементарный кодону мРНК и обусловливающий специфичность тРНК к этому кодону); тимидилпсевдоуридиловую ветвь, или T-шпильку, содержащую минорные нуклеозиды риботимидин и псевдоури-дин.

Кроме того, у всех тРНК между T-шпилькой и акцепторным стеблем имеется вариабельная петля (V-петля). Число составляющих ее нуклеотидов у разл. тРНК варьирует от 3 до 20. Если петля длинная, то формируется дополнит. пятый двухспиральный участок тРНК, как, напр., у дрожжевых тРНК^Ser и тРНК^Leu (в верхнем индексе-условные обозначения аминокислот, к к-рым специфичны данные тРНК;

1-акцепторная ветвь, 2-Т-шпилька, 3-V-петля, 4-антикодонная ветвь, 5-дигидроуриди-ловая ветвь.

2 Стадия. Процессы трансляции:

1 Стадия: Инициация трансляции

Рибосомы Рибосомы представляют собой рибонуклео-протеиновые образования - своеобразные "фабрики", на которых идёт сборка аминокислот в белки. Эукариотические рибосомы имеют константу седиментации 80S и состоят из 40S (малой) и 60S (большой) субъединиц. Каждая субъединица включает рРНК и белки. В 40S субъединицу входит рРНК с константой седиментации 18S и около 30-40 белков. В 60S субъединице обнаружено 3 вида рРНК: 5S, 5,8S и 28S и около 50 различных белков. Белки входят в состав субъединиц рибосомы в количестве одной копии и выполняют структурную функцию, обеспечивая взаимодействие между мРНК и тРНК, связанными с аминокислотой или пептидом. В присутствии мРНК 40S и 60S субъединицы объединяются с образованием полной рибосомы, масса которой примерно в 650 раз больше массы молекулы гемоглобина.

В рибосоме есть 2 центра для присоединения молекул тРНК: аминоацильный (А) и пептидильный (Р) центры, в образовании которых участвуют обе субъединицы. Вместе центры А и Р включают участок мРНК, равный 2 кодонам. В ходе трансляции центр А связывает аа-тРНК, строение которой определяет кодон, находящийся в области этого центра. В структуре этого кодона зашифрована природа аминокислоты, которая будет включена в растущую полипептидную цепь. Центр Р занимает пептидил-тРНК, т.е. тРНК, связанная с пептидной цепочкой, которая уже синтезирована.

У эукариотов различают рибосомы 2 типов: "свободные", обнаруживаемые в цитоплазме клеток, и связанные с эндоплазматическим ретикулумом (ЭР). Рибосомы, ассоциированные с ЭР, ответственны за синтез белков "на экспорт", которые выходят в плазму крови и участвуют в обновлении белков ЭР, мембраны аппарата Гольджи, митохондрий или лизосом.

Митохондрии содержат свой набор рибосом. Митохондриальные рибосомы мельче, чем рибосомы эукариотов, прокариотов и имеют константу седиментации 55S. Они также состоят из двух субъединиц, но отличаются от эукариотических рибосом количеством и составом рРНК и белков.

В ходе синтеза белка прочтение информации мРНК идёт в направлении от 5'- к З'-концу, обеспечивая синтез пептида от N- к С-концу.

Каждая эукариотическая мРНК кодирует строение только одной полипептидной цепи (т.е. она моноцистронна), в отличие от прокариотических мРНК, которые часто содержат информацию о нескольких пептидах (т.е. они поли-цистронны).

синтез белка инициирует единственная аминокислота – метионин. В кодовом «словаре» имеется только один кодон для метионина (АУГ). Инициация трансляции представляет собой событие, в ходе которого происходит образование комплекса, включающего Мет-тРНК_i^Мет, мРНК и рибосому, где тРНК_i^Мет - инициирующая метиониновая тРНК . В этом процессе участвуют не менее 10 факторов инициации, которые обозначают как elF (от англ. eukaryotic initiation factors).

40S

elF

Связывание с 60 S

Cтимулирует объединение с тройным комплексом, включающим Мет-тРНК_i^Мет, eIF-2 и ГТФ.

Образовавшийсякомплекс связывается с 5'-концом мРНК

eIF-4F узнаёт и присоединяется к участку "кэп" на молекуле мРНК

40S субъединица начинает скользить по некодирующей части мРНК до тех пор, пока не достигнет инициирующего кодона AUG кодирующей нуклеотидной последовательности.

гидролиз АТФ, энергия которого затрачивается на преодоление участков спирализации в нетранслируемой части мРНК.