Пропись проводка

1. Фиксация материала и пропитывание смолой для исследования с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЭМ)

Кусочки материала помещали в пробирки с раствором формальглутара и откачивали из них воздух с помощью насоса Комовского (для лучшего проникновения фиксатора) и колбы Бунзена при открытых пробках. Откачку воздуха прекращали, когда из материала практически переставали выделяться пузырьки и при открытой пробке у колбы Бунзена все кусочки материала в пробирках находились на дне и не всплывали. Пробирки с материалом, закрытые корковыми пробками, хранили в холодильнике не больше 20 дней. В 1-ый день проводки материал отмывали от формальглутара в течение 1 часа в трех сменах фосфатного буфера с pH 7.4 и проводили постфиксацию раствором 1-2% четырехокиси осмия. Раствор осмия наливали в пробирки так, чтобы материал был покрыт целиком. Пробирки с кусочками материала в растворе осмия ставили в холодильник на ночь. На второй день материал промывали фосфатным буфером с pH 7.4 2-3 раза и обезвоживали в серии ацетонов возрастающих концентраций. После обезвоживания начинали постепенно пропитывать материал эпоксидной смолой. На третий день материал извлекали из пробирок и раскладывали в ванночки с чистой смолой, затем ванночки с материалом оставляли в эксикаторе, на дне которого находились или пятиокись фосфора (P2O₅), или безводный хлорид кальция (CaCl₂), или силикагель. Через двое суток ванночки с материалом помещали в термостат, нагретый до 60 °С. Через 20-30 минут проверяли ориентацию кусочков материала в смоле, если было необходимо, то их ориентацию исправляли. Все работы необходимо проводить в вытяжном шкафу в резиновых перчатках!

Приготовление формальглутара (Karnovsky, 1965). 10 г порошка параформальдегида растворяли в 100 мл дистиллированной воды. После этого раствор грели на водяной бане и встряхивали. Когда раствор становится равномерно мутным, добавляли 1-2 капли (глазной пипеткой) 1 N NaOH. Получается 10% раствор параформальдегида (этот раствор можно хранить в холодильнике до 1 года). Затем смешивали 4 мл 10% параформальдегида, 2 мл 25% глутаральдегида (фабричная упаковка), 10 мл фосфатного буфера с pH 7,4 и 4 мл дистиллированной воды.

Приготовление фосфатного буфера состоит из двух этапов:

1. Приготовление маточных растворов.

Для приготовления 0,1 М раствора Na₂HPO₄ используется в следующей пропорции:

Объем раствора	Количество соли
1 л	35,81 г
0,25 л	8,95 г
0,05 л	1,79 г

Для приготовления 0,1 М раствора KH₂PO₄ используется в следующей пропорции:

Объем раствора	Количество соли
1 л	13,61 г
0,25 л	3,402 г
0,05 л	0,680 г

2. Приготовление фосфатного буфера. Для приготовления 100 мл буфера с рН 7,4 необходимо смешать 20 мл раствора KH₂PO₄ и 80 мл раствора Na₂HPO₄. Количество данного раствора определяется исходя из расчета около 1 мл на пробирку (данный раствор необходим для промывки от формальглутара и от раствора OsO₄). Для приготовления 10 мл буфера с рН 8 необходимо смешать 0,5 мл KH₂PO₄ и 9,5 мл Na₂HPO₄. Этот буфер используется для разбавления 4%-го маточного раствора OsO₄.

Фосфатный буфер как с рН 7,4, так и с рН 8 подлежит хранению, в подписанной посуде в холодильнике. При появлении в растворе белых хлопьев он считается непригодным.

Приготовление 2% раствора OsO₄ состоит из двух этапов:

1 этап. Приготовление 4% маточного раствора. Навеску OsO₄ растворяли в соответствующем количестве дистиллированной воды, чтобы получить 4% раствор. Ампулу с навеской обезжиривали 96° спиртом, свободный от OsO₄ конец слегка надпиливали надфилем, тщательно заворачивали в плотную бумагу и разбивали молотком под тягой. В бутылку из темного стекла с рассчитанным количеством воды высыпали весь OsO₄ с осколками ампулы, закрывали и оставляли на сутки. 4% маточный раствор хранится в морозильной камере в бутылке из темного стекла.

2 этап. Приготовление 1-2% OsO₄. Маточный 4% раствор OsO₄ разбавляется фосфатным буфером с рН 8 в соотношении 1 : 1. В случае, если раствор 1-2% OsO₄ предполагается хранить, все операции необходимо проводить в посуде из темного стекла, в ней же оставлять на хранение. Препараты, содержащие OsO₄ крайне токсичны, поэтому все работы с этим веществом необходимо проводить в вытяжном шкафу.

Ацетоны возрастающих концентраций. Готовили растворы ацетона следующих концентраций: 30%, 50%, 70%, 90% и 100% (абсолютный ацетон). Для этого в цилиндр наливали такое количество ацетона (марки хч), какую его концентрацию планировали получить, и доливали дистиллированную воду до метки 100 мл. (Для приготовления растворов ацетона различных концентраций пользовались не обезвоженным ацетоном).

Абсолютный ацетон готовили заранее (как минимум за сутки): в бутылку с ацетоном добавляли гранулы безводного хлорида кальция. Хлорид кальция высушивает ацетон, т.е. впитывает в себя воду, в результате чего получается абсолютный ацетон.

Обезвоживание материала ацетоном осуществляется в соответствии с таблицей:

Концентрация ацетона	Повторности
30%	3 раза по 15 мин
50%	1 раз, 15 мин
70%	1 раз, 15 мин
90%	1 раз, 15 мин
100%	2 раза по 30 мин

Пропитка материала смолой. Так как смола густая, ее вводили в материал постепенно. Приготавливали смеси смолы с абсолютным ацетоном следующих концентраций: 10%, 30% и 50% (или в случае труднопропитываемого материала 5%, 10%, 30%, 40%, 50%). Для этого в абсолютно сухой цилиндр последовательно наливали соответствующее количество приготовленной смолы, разбавляли ее абсолютным ацетоном и тщательно перемешивали стеклянной палочкой. Затем в пробирки с обезвоженным материалом последовательно заливали приготовленные смеси (смеси готовили непосредственно перед употреблением). В каждой смеси материал выдерживали 45 - 90 минут, в последней смеси (50% смолы) материал оставляли в пробирках, закрытых корковыми пробками, на ночь (под тягой, но не в холодильнике). На следующий день с утра пробки из пробирок вынимали и в таком состоянии оставляли пробирки на 2 часа для испарения ацетона (все операции со смолой производили только во включенном вытяжном шкафу и в резиновых перчатках). Через два часа кусочки из пробирок переносили в резиновые ванночки или ванночки, приготовленные из фольги, в которые залита чистая смола. Ванночки с материалом оставляли на 2 суток в эксикаторе при комнатной температуре. Через двое суток ванночки помещали в термостат для полимеризации смолы. Через 2-3 суток получили твердые блоки с заключенными в них кусочками материала, готовые для дальнейшей обработки.

Приготовление смолы (смесь эпона и аралдита) (Mollenhauer, 1964). Последовательно смешивали 3 части - Эпона 812, 5 частей - DDSA, 2 части - Аралдит М. Затем добавляли 2,5% ускорителя DMP-30 от общего количества смолы. Для получения смолы хорошего качества очень тщательно перемешивали смеси сухой стеклянной палочкой после каждого добавления очередного компонента. Также следили за тем, чтобы в смолу не попала вода, даже ее следы. Посуду заранее тщательно мыли и сушили.

Требуемый объем смолы необходимо вычислить. Для этого нужно суммировать:

• Количество смолы, используемой для пропитки материала (1);

• Количество смолы, необходимое при раскладке материала в ванночки – из расчета 1 кусочек материала в 1 ванночку, объем ванночки приблизительно 0,3 мл (2).

Промежуточные результаты вычислений желательно округлять в бóльшую сторону.

Сумму (1) и (2) принимали за 100% и вычисляли необходимое количество ускорителя.

Обработка посуды.

После работы со смолой стеклянную посуду тщательно промыть ацетоном, прокипятить в воде с мылом, после чего промыть водопроводной водой и ополоснуть дистиллированной водой.

2. Подготовка материала для исследования в ТЭМ.

Приготовление сеточек. Прежде, чем приступить к резке, приготавливали сеточки, которые вместе с нанесенной на них пленкой-подложкой выполняют в электронном микроскопе функцию предметного стекла. Использовали в основном медные сеточки фабричного производства. На сеточки наносили пленку-подложку из формвара. Для изготовления такой пленки бралась стеклянная полоска. Это стекло протиралось спиртом, протиралось сухой тряпочкой и погружалось строго вертикально в сосуд с 0.15% раствором формвара в диоксане. Полоска быстро вынималась из раствора, промакивалась снизу фильтровальной бумагой и ставилась в эксикатор с небольшим количеством диоксана на 50 секунд, чтобы пленка высохла. После изъятия из эксикатора по краям пленки необходимо провести препаровальной иглой. Затем стекло с пленкой под небольшим углом осторожно погружалось в сосуд с дистиллированной водой. Пленка отделялась от стекла и оставалась плавать на воде. После этого на пленку пинцетом осторожно накладывали сеточки. Сверху сеточки накрывали кусочком кальки и когда к нему прилипали все сеточки, быстро вынимали кальку с сеточками из воды. После высушивания кальки, сеточки были готовы к употреблению.

Изготовление стеклянных ножей. Стеклянные ножи приготавливали перед резкой на специальном приборе “Knife-maker” из полос высококачественного шведского стекла. Перед приготовлением ножей стеклянные полосы тщательно мыли мылом с водой или спиртом и протирали насухо. Затем от полос отламывали квадраты, которые в свою очередь разламывали на треугольники, в результате чего получалось два ножа. К режущему концу ножа прикрепляли ванночки (пластмассовые или из фольги).

Во время резки в ванночки наливали дистиллированную воду или 10% раствор спирта и на эти жидкости при резке поступали срезы. Срезы в дальнейшем снимали на сеточки. При приготовлении ультратонких срезов, лезвие стеклянного ножа устанавливалось параллельно верхней грани пирамидки блока.

Резка. Концу блока, содержащему материал, придавали форму усеченной пирамиды. Заточку производили под стереомикроскопом МБС-1 бритвенным лезвием. Для устойчивости блок закрепляли в специальном держателе. Площадь верхнего сечения пирамиды составляла не более 0.2 мм². Ультратонкие срезы (толщиной 75 нм) и полутонкие срезы (толщиной 2 мкм) получали на ультрамикротоме Ultracut E (Reichert-Jung). Определение толщины срезов производили по их цвету. Наиболее хорошими ультратонкими срезами считали срезы золотистого цвета. Резку проводили стеклянными или алмазным ножами.

Полученные на микротоме срезы вылавливали на сеточки с пленками-подложками. Для этого сеточку брали специальным пинцетом с изогнутыми концами, и стороной, на которой находится пленка, накладывали на срезы. Срезы можно вылавливать и другим способом, при помощи стальной петли (Гайер, 1974), диаметр которой равен диаметру сеточки (3 мм). Серию срезов с каплей жидкости переносили петлей из ванночки ножа на сеточку с пленкой-подложкой, заранее отделенной от остальных сеточек и помещенной на кусочек фильтровальной бумаги. Когда петля соприкасалась с сеточкой, жидкость впитывалась в фильтровальную бумагу, а срезы оставались на сеточке.

Окрашивание (контрастирование) срезов. Для увеличения контраста срезы красили в растворе цитрата свинца, приготовленного по методике Рейнольдса (Reynolds, 1963). В чашку Петри насыпали несколько гранул NaOH (KOH), рядом с ними клали парафиновую пластинку примерно 10-12 см² и 0,5 см толщиной, на которую пипеткой наносили рядами капли контрастера. В 1 каплю помещали 1 сеточку со срезами, так чтобы срезы соприкасались с контрастером. Контрастирование срезов проводили в течение 5 минут при закрытой крышке. После окрашивания сеточки по очереди промывали струей дистиллированной воды. Затем края сеточки осушали фильтровальной бумагой так, чтобы бумага не касалась срезов. Посуду и инструменты после контрастирования отмывали раствором 1 N NaOH (KOH).

Приготовление цитрата свинца. Смешивали 1,33 г Pb(NO₃)₂, 1,76 г цитрата натрия, 15 мл кипяченой дистиллированной воды. Раствор энергично взбалтывали в течение 30 минут в мерной колбе на 50 мл. Затем в раствор молочно белого цвета равномерной консистенции добавляли 8 мл 1N NaOH (раствор просветляется). После просветления в мерную колбу доливали кипяченую дистиллированную воду до метки, закрывали притёртой стеклянной пробкой и дополнительно взбалтывали. Приготовленный раствор хранился в холодильнике.

Просмотр и фотографирование срезов проводили с помощью ТЭМ Tesla BS-500.