Так как этот процесс происходит на каждой разделившейся цепи исходной молекулы, то в результате образуются две двухцепочечные структуры, идентичные родительской ДНК. Такой способ репликации получил название полуконсервативного, поскольку в каждой из вновь образовавшихся молекул одна цепь является старой (родительской), а другая – вновь синтезированной (дочерней).
Репликон-это участок ДНК,к-ый удваивается с одного ori-сайта.
Репликативная вилка-образуется в результате денатурации ДНК,в месте начала репликации ORI(origin).
18. Инициация. Точки начала репликации на молекуле ДНК имеют специфическую последовательность оснований, богатую парами А-Т. Процесс начинается с того, что с каждой такой последовательностью связываются несколько молекул специальных узнающих белков (у прокариот это белки DnaA).
Первым начинает действовать фермент геликаза (от helix - спираль). Он обеспечивет расплетение двойной спирали родительской ДНК путем разрыва водородных связей между нуклеотидами. На это затрачивается энергия гидролиза АТФ – по две молекулы на разделение 1 пары нуклеотидов. У эукариот одновременно происходит вытеснение данного участка ДНК из связи с гистонами и другими хромосомными белками.
Однако расплетение спирали на некотором участке создает суперспирализацию перед этим участком, так как каждая молекула ДНК некоторыми участками зафиксирована на ядерном матриксе. Поэтому она не может свободно вращаться при какого-то своего участка. Это и вызывает суперспирализацию, что препчтствует дальнейшему расплетению цепи.
Эта проблема решается с помощью ферментов топоизомераз. Существует два типа топоизомераз (топоизомераза типа I и топоизомераза типа II). Топоизомераза I разрывает одну из цепей ДНК, и переносит один свободный конец на себя. Это позволяет участку ДНК от места расплетения до места разрыва вращаться вокруг целой цепи, что предупреждает образование супервитков. Впоследствии концы разорванной цепи вновь замыкаются. Топоизомераза II разрывает обе цепи ДНК, перенося соответствующие концы на себя. Это позволяет более эффективно решать проблему суперспирализации при расплетении ДНК.
После расплетения двойной спирали хеликазой, с каждой из двух нитей связываются специальные SSB-белки. Они обладают повышенным сродством к одноцепочечным участкам ДНК и стабилизируют их в таком состоянии. Механизм действия основных ферментов репликации ДНК-полимераз таков, что синтез новой полинуклеотидной цепи не может начаться с включения в нее первого нуклеотида. Синтез идет только как удлинение уже существующего полинуклеотида, который комплементарен матрице и образует с ней двуспиральный комплекс матрица-затравка. Во всех живых системах такой затравкой служит не ДНК, а короткая РНК. РНК-затравка синтезируется ферментом праймазой (или РНК-полимеразой).
Элонгация. На этой стадии осуществляется синтез цепей ДНК. Каждый нуклеотид включается в цепь лишь в случае его комплементарности нуклеотиду, занимающему данную позицию в составе матрицы. Ферментный комплекс функционирует так, что одна из двух цепей растет с некоторым опережением по сравнению с другой цепью. Соответственно, первая цепь называется лидирующей, а вторая – запаздывающей. Важнейшее обстоятельство состоит в том, что лидирующая цепь образуется в виде непрерывного очень длинного фрагмента. Запаздывающая цепь образуется в виде серии относительно коротких фрагментов – примерно по 1500 нуклеотидов. Это т.н. фрагменты Оказаки. В виде фрагментов Оказаки синтезируется та цепь, направление образования которой противоположно направлению движения соответствующей репликативной вилки. Рост цепей ДНК осуществляется ферментами ДНК-полимеразами. Удлиннение цепи ДНК (или отдельного ее фрагмента) всегда происходит в направлении от 5’-конца к 3’-концу. Это означает, что очередной новый нуклеотид присоединяется к 3’-концу растущей цепи.
У прокариот известно три ДНК-полимеразы: ДНК-полимераза I, ДНК-полимераза II и ДНК-полимераза III.
ДНК-полимераза III у прокариот является основным ферментом. Он осуществляет синтез лидирующей цепи и фрагментов Оказаки в направлении 5’-3’ от 3’-ОН-затравки. Помимо ДНК-полимеразной активности, ДНК-полимераза III обладает еще одной – 3’-5’-экзонуклеазной. Последняя срабатывает в тех случаях, когда допущена ошибка и в строющуюся цепь включен «неправильный» нуклеотид. Тогда, распознав дефект спаривания оснований, фермент отщепляет с растущего (3’-) конца последний нуклеотид, после чего опять начинает работать как ДНК-полимераза. На лидирующей цепи ДНК-полимераза III движется вслед за хеликазой до конца репликона (или всей молекулы). На запаздывающей цепи ДНК-полимераза III доходит до РНК-затравки предыдущего фрагмента Оказаки и отделяется. На смену ДНК-полимеразе III приходит ДНК-полимераза I. Этот вспомагательный фермент имеет значительно меньший размер и обладает тремя ферментативными активностями. Первая из них – 5’-3’ – экзонуклеазная. За счет этой активности осуществляется последовательное отщепление нуклеотидов с 5’-конца РНК-затравки предшествующего фрагмента. На освобождающееся место фермент включает дезоксирибонуклеотиды, присоединяя их к 3’-концу «своего» фрагмента (ДНК-полимеразная активность). И, наконец, подобно ДНК-полимеразе III, ДНК-полимераза I может при необходимости корректировать свою работу с помощью 3’-5’ – экзонуклеазной активности. Работа ДНК-полимеразы I завершается, когда растущий фрагмент вплотную доходит до предыдущего фрагмента.
Что касается эукариот, то здесь функциональным аналогом прокариотической ДНК-полимеразы III является, видимо, комплекс α и δ -ДНК-полимераз; при этом корректирующая 3’ - 5’-экзонуклеазная активность присуща δ -ДНК-полимеразе. Функции ДНК-полимеразы I тоже распределены между двумя ферментами: 5’-3’ экзонуклеазная активность (удаление РНК-затравки) осуществляется, вероятно, специальной нуклеазой, а ДНК-полимеразная активность (застраивание брешей) β – ДНК-полимеразой (другой ее функцией является репарация).
Для завершения репликации (терминации) используются ферменты лигаза и теломераза.
В результате действия предыдущих ферментов новосинтезированная запаздывающая цепь оказывается состоящей из фрагментов, вплотную примыкающих друг к другу (кроме кольцевой ДНК). «Сшивание» соседних фрагментов осуществляется ДНК-лигазой (фермент образует фосфодиэфирную связь). Для осуществления реакции требуется гидролиз АТФ.
ДНК-полимеразная система оставляет недореплицированными 3’-концы материнских цепей ДНК, т.е. новые цепи оказываются укороченными с 5’-концов. В каждой новой цепи фрагмент Оказаки, находящейся у 5’-конца, как и обычно, начинается с короткой РНК-затравки (у 5’-конца лидирующей цепи тоже находится РНК-затравка). РНК-затравки удаляются специальной нуклеазой. Но застроиться дезоксинуклеотидами образующаяся «брешь» не может, поскольку ДНК-полимеразы не способны действовоать «с нуля», а лишь удлиняют 3’-конец уже имеющегося полинуклеотида. Поэтому получается, что новая цепь должна быть короче старой. Эта проблема решается при помощи фермента теломеразы. Теломераза удлинняет не новую, укороченную цепь, а старую, более длинную. К 3’-концу старой (родительской) цепи теломераза последовательно пристраивает несколько сотен повторяющихся последовательнотей. После чего значительно удлинненная старая цепь становиться способной выступать в качестве матрицы для образования еще одного фрагмента Оказаки новой (укороченной) цепи. Таким образом восстанавливается длина теломерного участка. Существуют и другие, альтернативные механизмы удлинения теломер. Теломерные участки необходимы для фиксации хромосом к ядерному матриксу, что важно при мейозе. Кроме того, наличие теломер предохраняет от недорепликации генетически значимые отделы ДНК. Наконец, теломерные отделы ДНК выступают в качестве «часового» устройства, которое отсчитывает количество делений клетки после исчезновения теломеразной активности. Каждое деление приводит к укорочению теломеры на 50-65 н.п. (кроме половых клеток, где активность теломеразы высокая).
Кроме рассмотренного, известен еще один тип репликации ДНК – по типу «катящегося кольца». Так реплицируются кольцевые ДНК некоторых фагов, вирусов, митохондрий, плазмид. При этом способе в одной из цепей исходной ДНК происходит разрыв и освободившейся 5’конец присоединяется к клеточной мембране. На 3’-конце по комплементарной матрице неразорванной цепи начинается синтез дочерней цепи. При этом происходит вращение родительской молекулы, обеспечивающее «сползание» с нее удлиняющейся дочерней цепи. Последняя нарезается на куски, соответствующие по длине исходной молекуле ДНК. (см. Приложение). Такой способ репликации обусловливает образование многих копий материнской ДНК.
18.На лидирующей цепочки синтез днк идет непрервыно.
А на отстающей:
Сначала образуются праймеры(затравки) маленькие моллекулы РНК. Праймеры синтезируются комплексом праймосомой. Праймосома -состоит из двух компонентов Днк-геликаза и РНК-полимераза(фермент праймаза).
У праймеров есть 5' и 3' конец. К 3' концу будет присоединяться ДНК-полимераза и будет строить.
После этого нужно убрать праймеры. Приходит ДНК-полимераза I и убирает праймеры, по одному нуклеотиду РНК. После того как она убрала один нуклеотид РНК она выстраивает нуклеотид ДНК. Когда она заменила все нуклеотиды на ДНКовые и дошла до фрагмента Оказаки и теперь лигаза их будет соединять.
Ферменты репликации
ДНК-геликаза производит денеатурацию моллекулы ДНК
ДНК — топоизомераза снимают топологическое напряжение,возникающие из-за расплетения ДНК. Снимаеют суперсперализацию перед репликативной вилкой.
ДНК-полмеразы I удаляет нуклеотиды РНК и достраивает нуклеотиды ДНК. Обладает 3'-экзонуклеазной активностью.
-II обладает низкой полимеразной активностью. Участвуеют в репарации ДНК
-III — синтезирует ведущую цепь и фрагменты оказаки.приходит к 3' концу. Синтезирует в направлении 5' ->3'
Праймаза
ДНК-лигаза будет соединять фрагменты Оказаки с фрагментом на котором прошел синтез ДНК с помощью ДНК-полI
ДНК-гираза — участвует в закручивании спирали.
ПЦР — это один из моллекулярно-генетических методов получения в пробирке(in vitro) большого количества определ. фрагмента ДНК.
Чтобы провести р-цию нужно знать длину нуклеотидов, 20 нуклеотидов на концах, чтобы приговить праймеры.
35-40 циклов (1,5 часа) в приборе амплификатор.
Условия проведения: 50
1) L-праймер 1
2)R-праймер 1
3)ДНК-мишень 10
4)Буффер р-р 10
5)Дестил.вода 22
6) дезоксиридонуклеозидтрфосфаты 5
7)Taq-полимераза 1
Этапы
1.Денатурация ДНК.
Протекает при 93-94 С в течение 30-40 сек.
2.Присоединение праймеров (отжиг)(ренатурация)
Соединение праймеров с комплиментарными последовательностями ДНК.
При 50-65 С(медленно понижают Т). время 30 секунд(40,20-60)
Элонгация (достраивание цепи)
температура 70-75 С время около 1 минуты.
Практическое значение
-выяв.мутаций
- клониров.ДНК
-идентифик.личности
-диагност.вирус.инфек.
Генетический код – это система записи последовательности аминокислот полипептидной цепи в виде последовательности нуклеотидов ДНК или РНК.
Свойства генетического кода
Триплетность
Вырожденность (избыточность)-большинству аминокислот соответсвует больше,чем один триплет
Однозначность
Неперекрываемость-кажд.нуклеотид входит лишь в состав 1ого триплета
Непрерывность-между линейно располож. Триплетами нет никаких физич. интервалов
Универсальность-кодоны м-РНК,опред.аминокис.последовательность полипептида,имеют одинаков. Смысл для разн.уров.организаций
Коллинеарность-соответствие между последовательностью кодирующих триплетов ДНК и последовательностью аминокислот в полипептидной цепи.
|
Синтез молекул рнк в клетке.приципы этапы транскрипции.
Транскрипция-это синтез РНК на ДНК-матрице.
Принципы:
Матричность
Комплементарность
Антипараллельность
Этапы:
I.Инициация
1)РНК-полимераза+промотор
2)Образование открытого двойного комплекса
3)синтез первой фософодиэфирной связи->образов тройного комплекса.
II.
III.
Структура гена
Промотор-участок ДНК на котором начинается транскрипция.
У прокариот
-10 Прибнов бокс ТАТААТ-Рнк пол высчитывает где наход точка +1
-35 участок узнавания ТТGACA
+1 точка старта(пурин) А(G)
РНК-пол называется Кор-фермент состоит из 4ех субъединиц ααββ'.
РНК-пол + σ(cигма)-фактор=холофермент.
σ(cигма)-фактор узнает опред.промотор.
РНК полимераза прикрепляется большей частью за область узнавания,т.к. Если она узнает только одну область она не будет знать в какую сторону ей идти.
Как только она распознает обе области определяется цепь на коорой будет идти синтез РНК. Синтез идет на цепочке 5' 3'.
У холофермента есть 4 активных центра:перед-разрезания(геликазной активности),задний-соединения(лигазной активности),нижний и верхний центр удерживают цепочки ДНК.
На матричной цепочке начинается синтез.
После того как прикрепилось несколько нуклеодитов уходит сигма-фактор.