Тема 6.
ГЕНЕТИКА ПРОКАРИОТ
Генетика прокариот Краткая история изучения генетики прокариот Организация генетического аппарата прокариот
Функционирование генетического аппарата, определяющие свойства наследственности и изменчивости Процессы, влияющие на изменчивость генетического материала прокариот
Как это ни кажется в настоящее время парадоксальным, но до 40-х годов XX века немногие микробиологи думали, что бактерии обладают наследственностью, основанной на тех же принципах, которые установлены для высших организмов. Существовал даже тезис: «Что хорошо для Escherichia coli, то и характерно для слона». Сохранение специфических свойств, т.е. постоянство признаков в ряду поколений, называют наследственностью. Вся информация о признаках, присущих организму, сосредоточена в его генетическом аппарате. Он обеспечивает сохранение и воспроизведение этих признаков в процессе размножения организма, т.к. возникающие дочерние особи обнаруживают в большинстве случаев полное сходство с родительскими формами. Т.о. генетический аппарат должен быть организован так, чтобы, с одной стороны, обеспечивать свою стабильность, с другой – быть достаточно пластичным, т.е. обладать способностью к изменчивости. Как известно, половой процесс у растений, был открыт в 1700 году, а расщепление хромосом у животных и растений, при котором происходит передача признаков, было описано только начиная с 1885 г. Открытие Грегором Менделем в 1866 г закона наследственности было для его современников слишком ранним и в то время осталось незамеченным до тех пор, пока Гуго де Фриз, Карл Эрих Корренс и Эрих фон Чермак снова открыли и подтвердили его. В 1900 г Бейеринк сообщил соответствующие наблюдения «О различных формах наследственной изменчивости у микробов» и заметил, что в некоторых случаях отдельные варианты можно было бы рассматривать как мутантов. Уже в этом докладе содержится указание на то, что микробы являются очень ценным материалом для изучения законов наследственности и вариабельности, и что на них можно было бы ставить опыты по конкуренции видов, что на высших организмах сделать очень трудно. Бейеринк сделал очень важные заключения, в работе «Мутации у микробов» (1912), присоединился к выводам Г.де Фриза, который привел примеры мутаций и представил образцы мутантов, а также сформулированную концепцию образования видов посредством мутаций и селекции; а также попытался упорядочить систему понятий для сходных явлений, таких как вариация, диссоциация, модификация, флуктуация и дегенерация. С позиций рассмотрения бактерий Бейринком заново определено понятие ген, использованное Вильгельмом Иогансеном в 1909 г, и сформулировано так «Гены, или частицы наследственности, являются носителями видимых свойств и могут, рассматриваться в лучшем случае как частицы протоплазмы или клеточного ядра». К мысли о мутациях и атавизмах (возвратных мутациях) Бейеринк пришел на основе исследования дрожжей и Bacterium prodigiosum. Таким образом, в результате после преодоления ряда давних предубеждений ученые пришли к выводу о том, что микроорганизмы чрезвычайно удобные объекты для генетического анализа, ибо опыты можно проводить в короткие сроки на огромном числе особей, и они не требуют много места, и также как и высшие организмы подчиняются общим генетическим законам.
Особенности организации генетического аппарата прокариот заключаются в том,
что клетки прокариот не имеют ни оформленного ядра, ни хромосом, аналогичных клеткам эукариот. Генетический материал любой клетки представлен ДНК, информационные свойства которой определяются специфической последовательностью 4-х нуклеотидов в полинуклеотидной цепи. Стр. 18 (лекции). Именно ДНК, входящая в состав хромосом у всех организмов, служит материальным носителем наследственной информации. Как сохраняется наследственная информация при росте и размножении клеток? Перед делением клетки происходит идентичная редупликация, или репликация генов. Этот процесс в настоящее время объясняется исходя из модели структуры ДНК, предложенной Уотсоном и Криком и из механизма удвоения ДНК, теперь уже известного (полуконсервативного). Полуконсервативный механизм репликации ДНК, представляет собой процесс, в результате которого из одной родительской 2-хцепочечной молекулы, которая раскручивается, и на каждой полинуклеотидной цепи образуются две дочерние молекулы ДНК, содержащие по одной родительской и одной вновь синтезированной комплементарной полинуклеотидной цепи. Таким образом, новая двойная спираль оказывается «гибридом» старой и вновь синтезированной цепей, что наилучшим образом обеспечивает идентичность исходной и синтезированных молекул и, следовательно, сохранность видоспецифической наследственной информации в ряду поколений клеток и организмов. Рис. стр. 37 Шлегель. Частота ошибок, возникающих в процессе репликации, порядка 10" . Далее было показано, что проявление признаков зависит от активности ферментов. Передачу записанной в ДНК информации к месту синтеза белка осуществляет матричная, или информационная, рибонуклеиновая кислота (мРНК), при ее синтезе просто копируется нуклеотидная последовательность ДНК, этот процесс называется транскрипцией, и противопоставляют его трансляции – переводу нуклеотидной последовательности в последовательность аминокислот. Стр. 435, Шлегель. Генотипом, или геномом, называют совокупность наследственных задатков клетки, т.е. совокупность всех генов, присущих данному организму – его генетическую конституцию. Ему противопоставляют фенотип – совокупность наблюдаемых признаков, присущих данному организму. Представление о том, что и у микроорганизмов возможны скачкообразные изменения наследственных признаков – мутации – долгое время воспринималось с трудом. Считалось, что большое количество бактерий, встречающихся в природе, представляют собой стадии жизненного цикла небольшого количества видов (плеоморфизм). Многие ученые на основании усовершенствованных методов и чистых культур выступили в пользу теории мономорфизма, согласно которой бактерии можно различать и классифицировать, исходя из постоянства их морфологических и физиологических признаков. Необходимо было научиться различать и у бактерий генотип и фенотип. Фенотипическое проявление одного и того же генотипа может быть различным в зависимости от условий среды. Термин мутация введен Де Фризом, изучившим изменчивость и наследственность у растений и определившим мутацию как «скачкообразное изменение наследственного признака». Это понятие Бейеринк позднее распространил и на бактерии. Оказалось, что все наблюдаемые изменения можно разделить на два типа.
К первому относят те из них, которые, как правило, проявляются у подавляющего большинства особей в популяции при изменении внешних условий и наблюдаются до тех пор, пока действует фактор, вызвавший эти изменения. Такой тип изменчивости получил название наследственного или модификационного, а само явление названо модификацией.
Ко второму типу относятся изменения признаков, которые первоначально возникают как редкие события в популяции особей (с частотой 1 на 104 – 1011 клеток). Если измененные особи имеют некоторое преимущество перед неизмененными, выражающееся в повышенной скорости роста или жизнеспособности, они постепенно накапливаются в популяции и вытесняют исходные особи. Изучение особенностей второго типа изменений привело к заключению, что последние возникают случайно. И наконец, эти изменения постоянны, т.е. передаются из поколения в поколение при размножении организма. Такой тип изменчивости был назван наследственным. В настоящее время показано, что модификация – изменение, происходящее на уровне фенотипа и не затрагивающее клеточный генотип. Все признаки клетки определяются ее генотипом, но в определенных условиях она пользуется не всей заложенной в ней генетической информацией, количество которой гораздо больше, чем необходимо клетке для существования в конкретных условиях. Реакция клетки на изменение внешних условий приводит к проявлению каких-то новых признаков, свойств, которые не обнаруживались в исходной культуре. Однако информация, необходимая для проявления этих признаков, обязательно содержится в клеточном геноме. Таким образом, модификация есть результат пластичности клеточного метаболизма, приводящего к фенотипическому проявлению «молчащих» генов в конкретных условиях, т.е. модификационные изменения имеют место в рамках неизменного клеточного генотипа. Существует несколько типов модификационных изменений. Наиболее известны адаптивные модификации, т.е. ненаследственные изменения, полезные для организма и способствующие его выживанию в изменившихся условиях. Причины адаптивных модификаций кроются в механизмах регуляции действия генов. Например, адаптивной модификацией является адаптация клеток Е. coli к лактозе как к новому субстрату. Универсальный механизм неспецифических адаптивных мутаций включается в клетке при адаптивной реакции на различные стрессовые воздействия (резкое изменение рН, высокие и низкие температуры), проявляющиеся в интенсивном синтезе небольшой группы сходных белков. Функции последних предположительно заключаются в противодействии стрессовому воздействию путем защиты важнейших клеточных структур, в первую очередь нуклеоида и мембран.Такие белки получили название белков теплового шока, а само явление синдром теплового шок. До настоящего времени не ясны те регуляторные механизмы, которые запускаются в клетке при воздействиях, вызывающих синдром теплового шока, но очевидно, что это универсальный механизм неспецифических адаптивных изменений. Не все модификации обязательно адаптивны. При интенсивном действии многих агентов наблюдаются ненаследуемые изменения, случайные по отношению к вызвавшему их воздействию и проявляются они в условиях, которые их вызывают. Причины появления таких фенотипически измененных клеток связаны с ошибками процесса трансляции, вызванными этими агентами.
Т. о. модификационная изменчивость не затрагивает генетической конструкции организма, т.е. не является наследственной. Однако она вносит определенный вклад в процесс эволюции, адаптивные модификации расширяют возможности организма к выживанию и размножению в более широком диапазоне условий внешней среды. Возникающие в этих условиях наследственные изменения подхватываются естественным отбором и таким путем происходит более активное освоение новых экологических ниш и достигается более эффективная приспособляемость к ним. Наследственные изменения можно подразделить на изменения, возникающие в результате мутаций и рекомбинаций генетического материала. Скачкообразные изменения в генетическом материале клетки, приводящие к появлению новых признаков, получили название мутаций. Выделяют спонтанные мутации, причины возникновения которых, часто сопровождаются невидимыми воздействиями. Клетки, в которых возникли спонтанные мутации, называют спонтанными мутантами. Вероятность возникновения определенных мутаций в расчете на одну клетку и на одну генерацию называют частотой мутирования. При высоких скоростях роста она постоянна, и ее обычно определяют для \ клеток в экспоненциальной фазе роста при оптимальных условиях среды. У возникшего спонтанного мутанта может произойти обратная мутация, в результате которой восстановятся свойства дикого типа. Об истинной обратной мутации говорят лишь в тех случаях, когда вторая мутация точно восстанавливает исходный генотип, т.е. когда измененный при первой мутации триплет будет вновь кодировать туже аминокислоту, что и раньше.
Если же дело сводится к восстановлению исходного фенотипа (например, к возобновлению синтеза нормально функционирующего фермента), то говорят о реверсии или супрессорной мутации и соответственно о ревертантах. Супрессорные мутации могут происходить как в исходном гене, так и каких-либо других участках хромосомы (интрагенные и экстрагенные супрессорные мутации). Причинами более частых индуцированных мутации в популяции могут быть химические, физические и биологические факторы, действующие на генетический материал клетки. К ним относятся следующие воздействия: физические – коротковолновое излучение, ультрафиолетовые и рентгеновские лучи; химические мутагены – аналоги оснований, производные акридина, алкилирующие и дезаминирующие агенты; биологические – это в первую очередь мигрирующие элементы (транспозоны и IS-элементы). В отношении генетической структуры различают три класса мутантов со следующими дефектами:
1) одна пара оснований заменена другой, например вместо AT может быть GC или наоборот;
2) включена дополнительная пара оснований в нуклеотидную последовательность или утрачена одна из существующих пар;
3) группа оснований или даже генов может быть утрачена (делеция), перемещена в пределах хромосомы (транспозиция) или «разорвана» путем вставки посторонней ДНК {инсерция). Т.е. в этих случаях химические перестройки происходят в молекуле ДНК в рамках одного нуклеотидного остатка: замена, вставка, выпадение. К мутациям, затрагивающим сегмент бактериальной хромосомы, ведут выпадение нескольких оснований или даже генов, перемещение их в пределах одной хромосомы, умножение или удвоение части хромосомы. Мутации, независимо от того, имеют ли они спонтанное происхождение или индуцированы каким-либо мутагеном, по характеру перестроек, происшедших в ДНК, относящиеся к 1-му классу называют точечными мутациями. Для этого типа характерна высокая частота реверсии. В случае мутации 2-го класса, к которым относят также мутации со сдвигом рамки, ревертанты редки, а после мутации класса 3 (за некоторыми исключениями) регенераты вообще не появляются. Для проявления мутации необходимо, чтобы прошел по крайней мер один цикл репликации ДНК, в которой исходно имело место изменение нуклеотидной последовательности. Только если это исходное изменение закрепится после репликации в дочерней молекуле ДНК, оно становится стабильным, а следовательно наследственным. Для выражения мутации в фенотипе необходимо прохождение этапов транскрипции и трансляции. Иногда для проявления мутационно измененного признака, т.е. фенотипического выражения мутации, необходимо несколько клеточных делений. На проявление мутантных признаков влияет также количество копий хромосомы, содержащихся в клетке. Все прокариоты гаплоидны, имеют набор генов, локализованных в одной хромосоме. Однако в определенных условиях в клетке можно обнаружить несколько копий одной хромосомы. Если в такой клетке произошла мутация, приведшая к нарушению синтеза определенного метаболита, то после одного цикла репликации она сразу не проявится, т.к. синтез этого метаболита будет осуществляться другими неповрежденными генами, содержащимися в копиях хромосом. Для фенотипического выражения мутантного гена необходимо, чтобы он содержался в клетке в «чистом» виде, т.е. клетка имела одну копию хромосомы с мутантным геном, или чтобы все копии хромосомы в клетке имели одинаковый генотип. Это происходит через несколько клеточных делений. Рис. 39, стр. 151, Гусев. В генетике бактерий все большее значение приобретает метод получения мутаций с помощью траспозонов. Транспозоны (Тп) представляют собой короткие двойные цепи ДНК, которые состоят из более чем 2000 пар оснований и обычно обусловливают устойчивость к одному антибиотику, в исключительных случаях – к нескольким. Транспозоны способны «перепрыгивать» из одного участка генома в другой, в частности из бактериальной хромосомы в плазмиду и обратно; т.о. они могут включаться в различные участки генома. В случае внедрения транспозона в какой-либо структурный ген хромосомы нуклеотидная последовательность этого гена будет нарушена и генетическая информация не сможет транслироваться в функционально полноценный полипептид и возникнет инсерционный мутант. Ко второму типу наследственной изменчивости относятся изменения, возникающие у прокариот в результате рекомбинации генетического материала, при которой происходит частичное объединение геномов 2-х клеток. Известны 3-й основных способа, приводящие к рекомбинации генетического материала прокариот: конъюгация, трансформация и трансдукция. При конъюгации, для которой необходим непосредственный контакт между бактериальными клетками, осуществляется направленный перенос генетического материала от клетки-донора в клетку-реципиент. Как правило, в клетку-реципиент переносится только часть генетического материала клетки-донора, в результате чего образуется неполная зигота, или мерозигота, содержащая часть генома донора и полный геном клетки-реципиента. Участки перенесенной от донора ДНК находят гомологичные участки в молекуле ДНК реципиента, между которыми происходит генетический обмен. В результате часть донорной ДНК встраивается (интегрируется) в геном реципиента, а соответствующая часть реципиентной ДНК из него исключается. Трансформация бактерий заключается в переносе ДНК, выделенной из одних клеток, в другие. Для трансформации не требуется непосредственного контакта между двумя клетками. Способность ДНК проникать в клетку реципиент зависит как от природы самой ДНК, так и физиологического состояния клетки-реципиента. Трансформирующей ДНК могут быть только высокомолекулярные двухцепочечные фрагменты, при этом проникать в бактериальную клетку может ДНК, выделенная из разных биологических источников, но включаться в геном – только ДНК с определенной степенью гомологичности. После того как экзогенный фрагмент ДНК, проникший в клетку, нашел гомологичный фрагмент ДНК клетки-рецепиента, между ними происходит генетический обмен аналогично тому, как имеет место на последнем этапе конъюгации. Трансдукция – перенос бактериальных генов из одной клетки в другую с помощью умеренных фагов. Такой перенос становиться возможным, если в процессе размножения фага одна из частиц случайно захватит фрагмент бактериальной хромосомы, как правило, содержащей очень небольшое количество генов. Когда такая фаговая частица заражает бактерию-реципиент, бактериальная ДНК проникает в клетку таким же путем как фаговая. Между трансдуцированной бактериальной ДНК и гомологичным участком бактериальной хромосомы может произойти обмен, и как следствие его возникают рекомбинанты, несущие небольшую часть генетического материала клетки-донора, т.о. происходит передача признаков у прокариот с помощью фагов. Еще один путь переноса генетического материала осуществляется с помощью плазмид определенного типа, обладающих генами, обеспечивающими эту возможность. Такие плазмиды помимо переноса собственного генетического материала могут обеспечивать перенос хромосомных генов, плазмид, не обладающих способностью к самостоятельному переносу, а также осуществлять передачу транспозонов из плазмиды в хромосому или другую плазмиду. Все известные способы передачи генетической информации с помощью плазмид создают огромные возможности для интенсивных генетических обменов между клетками различных бактерий. Плазмидам и другим нехромосомным генетическим элементам принадлежит основная роль в передаче генетической информации «по горизонтали». Можно предположить, что в природе любая генетическая информация может быть перенесена в любую клетку прокариот, если не прямо, то через посредников. Таким образом, можно подвести итог: новые наследственные признаки возникают в генофонде в результате генных мутаций. Последние создают фонд наследственных изменений, служащих исходным материалом (сырьем) для эволюции. Вероятно, мутации являются самым первым видом наследственной изменчивости, возникшим одновременно с началом функционирования ДНК как информационной молекулы, поскольку для них не нужно никаких дополнительных структур и механизмов. Способность к мутированию заложена в химическом строении молекулы ДНК, а проявление мутационных изменений идет по тем же каналам, что и обычная генетическая информация клетки. Возможно, в течение длительного времени мутационные изменения были единственной формой изменчивости. На протяжении миллионов лет мутации в сочетании с естественным отбором сыграли решающую роль в появлении тех видов бактерий, которые известны сейчас. Особенность организации генетической информации в мире прокариот – рассредоточение большого ее объема в нехромосомных элементах. Из этого следует 2-ве существенно различающиеся возможности «горизонтального» обмена генетической информацией: первая связана с хромосомной, вторая нехромосомной ДНК. Из 3-х основных процессов, приводящих у прокариот к обмену хромосомной ДНК, наиболее совершенным является процесс конъюгации, так как он обеспечивает возможность более полного обмена генетическим материалом двух клеток. Однако эффективность механизмов генетической рекомбинации в этих процессах высока для близкородственных прокариотных организмов. Обмен участками хромосомной ДНК у бактерий в большинстве случаев ограничен пределами одного вида. Возможность «горизонтальной» передачи генетической информации на большие таксономические расстояния реализуется при переносе нехромосомных молекул ДНК, способных к автономной репликации. Т.о. у бактерий сформирован механизм обмена генетическим материалом «по горизонтали», и возникновение на базе этого особей с рекомбинантным геном. При генетических рекомбинциях новых генов в генофонде, как правило, не появляется. В этом их принципиальное отличие от мутаций. Значение генетических рекомбинаций в том, что в результате этого обеспечивается возможность объединения разных генов и создание разных вариантов генных сочетаний в геноме прокариотной клетки. Поскольку отбор действует на всю совокупность признаков организма, генетическая рекомбинация поставляет дополнительный материал для действия отбора, ускоряя таким образом процесс эволюции.