Тема 5.

РОСТ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПРОКАРИОТ

Как сказал известный французский физиолог Х1Х в. Клод Бернар «Жизнь есть творение». Живые организмы отличаются от неживой природы главным образом тем, что растут и размножаются. Их рост и размножение лучше всего наблюдать у таких одноклеточных микроорганизмов, как бактерии или дрожжи.

Под ростом понимают необратимое увеличение количества живого вещества, обычно связанное с увеличением и делением клеток. В отличие от многоклеточных организмов, рост которых выражается увеличением размеров тела, у одноклеточных растет количество клеток.

Под ростом прокариотной клетки понимают согласованное увеличение количества всех химических компонентов, из которых она построена. Рост является результатом множества скоординированных биосинтетических процессов, находящихся под строгим регуляторным контролем, и приводит к увеличению массы (а следовательно, и размеров) клетки. Но рост клетки не беспределен. Достигнув определенной величины, она перестает расти. Но жизнь ее при этом не кончается, она продолжает создавать живую материю, и под микроскопом мы можем наблюдать, как в определенный момент она начинает делиться на две части, которые вскоре отделяются друг от друга и становятся двумя самостоятельными равноценными организмами. Так из одной материнской клетки появляются две дочерние. Вырастая, они тоже делятся, и в результате образуются 4-е клетки, затем 8-мь, 16 и т.д. Клетки, возникшие из одной материнской, представляют уже новое поколение (новую генерацию), подобно человеческому потомству.

Время от возникновения клетки до ее деления на последующие две, т.е. продолжительность существования одной генерации называется временем генерации рис. В природе наблюдается определенная закономерность: чем мельче организм, тем скорее появляется у него потомство. Например, время генерации кишечной палочки Escherichia coli составляет 20 мин, т.е. каждые 20 мин клетка кишечной палочки делится на две. При благоприятных условиях из одной бактериальной клетки в течение только одних суток возникло бы столько бактерий, из котрых можно было бы соорудить пирамиду основанием 1 км² , а высотой 1000 м. Также быстро размножается и Vibrio cholerae. Дрожжи размножаются медленнее бактерий, время генерации для них составляет от 2 до 4 часов.

При этом следует различать понятия увеличение числа клеток; увеличение клеточной массы.

При определении числа или массы бактерий пользуются обычно гомогенной суспензией клеток в водной или другой среде и определяют концентрацию бактерий – число клеток в 1мл, или плотность бактерий – в мг/мл. Динамика этих показателей в растущей бактериальной культуре позволяет вычислить константу скорости деления клеток – число удвоения концентрации бактерий за 1 час; и обратную ей величину – время генерации – интервал времени, за который число клеток удваивается.

1.2. Методы определения числа бактерий: 1. Подсчет под микроскопом общего количества клеток (живых, поврежденных, мертвых) с помощью счетной камеры; электронного счетчика («счетчик Каултера»); мембранных фильтров(в случае менее 106 клеток в 1 мл);

2. Определение числа живых клеток путем подсчета выросших колоний, после посева известного количества бактериальной суспензии на твердую питательную среду в чашки Петри.

Методы определения бактериальной массы: прямые методы: 1. Взвешиванием отфильтрованных или центрифугированных клеток, сырых или после высушивания;

2. Определение содержания общего азота (по Къельдалю), общего углерода (по ван Слайку – Фолчу);

3. колориметрическое определение содержания бактериального белка – модификацией биуретового метода и др. (количество характерных компонентов белка: тирозина, триптофана);

косвенные методы: 1. определение оптической плотности суспензии – измерение экстинкции, турбидиметрия (светопоглощение), нефелометрия (светорассеяние);

2. показатели интенсивности метаболизма, непосредственно связанные с ростом – поглощение О₂ , образование СО2 , титрометрически, манометрически, электрохимически.

Т.о. выбор метода определения бактериальной массы зависит от того, с какой целью это определение производится. Для оценки урожая обычно взвешивают сырые или сухие клетки отделенные и отмытые от культуральной жидкости.

При определении интенсивности обмена или ферментативной активности исходят из содержания в клетках белка или азота

Размножение прокариот. Для подавляющего большинства прокариот характерно равновеликое бинарное поперечное деление, приводящее к образованию двух одинаковых дочерних клеток.

При таком способе деления имеет место симметрия в отношении продольной и поперечной оси. Вариантом бинарного деления является почкование, которое можно рассматривать как неравновеликое бинарное деление.

При почковании на одном из полюсов материнской клетки образуется маленький вырост (почка), увеличивающийся в процессе роста. Постепенно почка достигает размеров материнской клетки, после чего отделяется от последней

Клеточная стенка почки полностью синтезируется заново. В процессе почкования симметрия наблюдается в отношении только продольной оси. При равновеликом бинарном делении материнская клетка, делясь, дает начало двум дочерним клеткам и сама, таким образом, исчезает.

При почковании материнская клетка дает начало дочерней клетке, и между ними можно в большинстве случаев обнаружить морфологические и физиологические различия: есть старая материнская клетка и новая дочерняя. В этом случае можно наблюдать процесс старения.

Так, для некоторых штаммов Rhodomicrobium показано, что материнская клетка способна отпочковывать не более 4 дочерних клеток. Дочерние клетки лучше приспосабливаются к меняющимся условиям. Почкование обнаружено в разных группах прокариот

Бинарное деление может происходить в одной или нескольких плоскостях. В первом случае, если после деления клетки не расходятся, это приводит к образованию цепочек палочковидных или сферических клеток,

во втором – к клеточным скоплениям разной формы. Расхождение образовавшихся дочерних клеток происходит в результате лизиса среднего слоя клеточной стенки.

Для одной группы одноклеточных цианобактерий описано размножение путем множественного деления.

Оно начинается с предварительной репликации хромосомы и увеличения размеров вегетативной клетки, которая затем претерпевает ряд быстрых последовательных бинарных делений, происходящих внутри дополнительного фибриллярного слоя материнской клеточной стенки.

Таким образом, в основе множественного деления лежит принцип равновеликого бинарного деления. Отличие заключается в том, что в этом случае после бинарного деления не происходит роста образовавшихся дочерних клеток, а они снова подвергаются делению.

Итак, определение жизни, данное К. Бернаром, вполне применимо к миру микроорганизмов. Микробы растут и размножаются. Рост и размножение микроорганизмов относительно легко наблюдать и изучать. Как же наблюдать с достоверностью рост и размножение микрооррганизмов? Ж.Моно из Пастеровского института в Париже опубликовал работу

«Исследования роста бактерий» в 1942 г. Методы Ж. Моно стали классическими для современной микробиологии. Размножение бактерий ученый графически изобразил при помощи кривой роста, показывающей изменение численности бактерий за определенное время. Согласно Моно, размножение популяции бактерий происходит следующим образом. Моно имел опыт ряда предшественников, изучавших размножение микробов.

Особенности строения базального тела определяются, таким образом, строением клеточной стенки. Интактность последней необходима для движения жгутиковых бактерий. Обработка клеток лизоцимом, приводоящая к удалению пептидогликанововго слоя клеточной стенки, вызывает и потерю способности бактерий к движению, хотя жгутики остаются при этом неповрежденными. Предполагают, что вращение жгутика определяется вращением М-кольца. Другие кольца базального тела неподвижны и служат для крепления стержня, проходящего через клеточную стенку грамотрицательных эубактерий. У грамположительных эубактерий эту функцию в основном выполняет многослойный жесткий пептидогликановый мешок. Прокариотная клетка обладает механизмом, позволяющим превращать электрохимическую форму энергии непосредственно в механическую. При этом движение жгутиковых прокариот обеспечивается энергией трансмембранного электрохимического потенциала (Δμ_н+), причем обе его составляющие – электрическая (ΔΨ) и концентрационная (ΔрН) – поддерживают движение. Скорость движения жгутиков прямо зависит от величины мембранного потенциала. Молекулярное устройство, обеспечивающее это превращение, пока не выяснено, но должно быть весьма эффективным, т. к. энергия, расходуемая на движение, составляет десятые доли процента от общего количества энергетических потребностей клетки. Формы движения бактерий: при помощи внутриклеточных структур, так называемых аксиальных фибрилл; скользящее и определяющееся теми или иными внешними факторами, называемыми таксисами. Аксиальные фибриллы обнаруживают сходство с бактериальными жгутиками, а отличие от них состоит в том, что аксиальные фибриллы обеспечивают движение, как в жидкой среде, так и по твердому субстрату. Например, спирохеты совершают движения 3-х типов: быстро вращаются вокруг длинной оси спирали, способны к изгибанию клеток и осуществляют передвижение по винтовому или волнообразному пути. Для спирохет (так же как для типичных жгутиковых бактерий) показано, что движение обеспечивается энергией в форме Δμ_н+. Таким образом, этот тип движения свидетельствует о возможности работы двигательного аппарата клетки, который находится в «закрытом» клеточными структурами состоянии. Скольжение – определяется как способность организма передвигаться по твердому или полужидкому субстрату без помощи наружных локомоторных структур – жгутиков. Способность к скольжению обнаружена у разных групп прокариот, как одноклеточных, так и многоклеточных, имеющих нитчатое строение: некоторых микоплазм, миксобактерий, цитофаг, нитчатых серобактерий, цианобактерий и др. Общим для всех скользящих организмов является способность к выделению слизи. У нитчатых цианобактерий фибриллы формируют единую систему, непрерывно в виде спирали, обволаквивающую весь трихом (нить). Скольжение нитчатых форм сопровождается и одновременным их вращением, так что любая точка на поверхности трихома описывает при движении спираль. Направление вращения является видоспецифическим признаком и коррелирует с направлением хода спирали белковых фибрилл. Скользящее движение в разных группах бактерий обеспечивается энергией в форме АТФ или Δμ_н+. Подвижные бактерии активно перемещаются в направлении, определяемом теми или иными внешними факторами, т. н. таксисами, которые в зависимости от фактора различают хемотаксис (частный случай – аэротаксис), фототаксис, магнитотаксис, термотаксис и вискозитаксис. Хемотаксис – движение в определенном направлении относительно источника химического вещества. Для каждого организма все химические вещества в этом плане могут быть разделены на 2-ве группы: инертные и вызывающие таксисы (эффекторы). Среди последних выделяют аттрактанты (вещества, привлекающие бактерий) и репелленты (вещества, отпугивающие бактерий). Например, кислород – аттрактант для аэробных микроорганизмов и репеллент для анаэробов. Аттрактанты часто представлены пищевыми субстратами, хотя не все вещества, необходимые для организма, выступают в качестве аттрактантов. Также не все ядовитые вещества служат репеллентами и не все репелленты вредны. Фототаксис, т. е. движение к свету или от него, свойственен прежде всего фототрофным бактериям. Способность перемещаться по силовым линиям магнитного поля Земли или магнита – магнитотаксис – обнаружен у разных бактерий, обитающих в морской и пресной воде. В клетках этих бактерий найдены непрозрачные частицы определенной геометрической формы – магнитосомы, заполненные железом в форме магнетита (Fе₃О₄) и выполняющие функцию магнитной стрелки. На долю магнетита может приходиться до 4 % сухого вещества бактерий. В северном полушарии такие магниточувствительные бактерии плывут в направлении северного полюса Земли, в южном – в направлении южного. Вискозитаксис – способность реагировать на изменение вязкости раствора и перемещаться в направлении ее увеличения или уменьшения. У бактерий с перитрихиальным жгутикованием выявлены два вида двигательного поведения: прямолинейное движение и кувыркание, т. е. периодические и случайные изменения направления движения. К поверхностным структурам бактериальной клетки относятся также ворсинки (фимбрии, пили). Их насчитывается от нескольких единиц до нескольких тысяч на клетку. Эти структуры не имеют отношения к движению бактерий и обнаружены у подвижных и неподвижных форм. Ворсинки построены из одного вида белка – пилина – и представляют собой прямые белковые цилиндры, отходящие от поверхности клетки. Ворсинки расположены перитрихиально или полярно. Наиболее изученная бактерия Е. соli имеет ворсинки общего типа и половые. Ворсинки общего типа обеспечивают бактериям свойства гидрофобности, прикрепление к субстратам, участие в транспорте метаболитов. Половые ворсинки нозят название F-пили и принимают участие в половом процессе бактерий. ЦПМ – обязательный структурный элемент любой клетки, нарушение целостности которого приводит к потере клеткой жизнеспособности и является системой, отделяющей содержимое клетки от клеточной стенки. Это белково-липидный комплекс. В составе которого находится и небольшое количество углеводов. фосфолипиды – производные 3-фосфоглицерина. Все липиды эубактерий производные глицерина и содержат один или несколько остатков жирных кислот, состав к

оторых весьма своеобразен.

Определение микробиологических показателей проводится в лабораторных условиях в первую очередь по индикаторному показателю БГКП – бактерии группы кишечной палочки, типичным представителем которых является Еsсhеrуhiа соli, которая не является патогенным микроорганизмом. Коли – индекс – это количество БГКП в единице объема воды (не более 3 в литре). Коли-титр – это количество воды, в котором обнаруживается присутствие бактерий кишечной палочки. По интегральной оценке качества вода подразделяется на семь классов от очень чистой до чрезвычайно грязной – ИЗВ от 0,3 до 10. На ухудшение качества подземных вод существенное влияние оказывает санитарно-техническое состояние самих водозаборов, т. к. для большинства из них отсутствуют нормы режима их содержания и эксплуатации. В нарушении всех правил в пределах зон санитарной защиты водозаборов располагаются животноводческие комплексы, навозохранилища, склады минудобрений