Cлучайные блуждания и диффузия в связи со структурой

Среди вариабельных частей аминокислот данного белка есть гидрофильные и гидрофобные.

Гидрофобные в воде слипаются друг с другом, вынуждая всю молекулу собираться в компактный комок (или глобулу, от английского слова globular - шарообразный), состоящий из нескольких соединенных между собой участков вторичной структуры. Противоположный вариант – вытянутая молекула (фибрилла).

Это третичная структура белка (обычно она дополнительно укрепляется за счет образования химических связей между остатками аминокислоты цистеина, при этом получаются «мостики» из соединенных атомов серы).

Наконец, иногда образуется сложная глобула, состоящая из нескольких слипшихся между собой глобул и/или фибрилл. Это четвертичная структура белка.

В общем случае можно говорить о третичной и четвертичной структуре нерегулярного полимера.

Пространственную структуру биополимеров можно анализировать в пределе отсутствия слабых связей, рассматривая ее как аналог траектории частицы при случайном блуждании – диффузии. Похожее представление применимо и шире для более сложной структуры, когда более крупные фрагменты – это элементы вторичной структуры. Тогда аналогия в связи со случайными блужданиями возникает применительно к более крупным частям молекулы.

Рассмотрим случайные блуждания (как диффузию), начиная с одномерного случая (x_ – линейная координата в момент времени t)

0 x_t x_t+

В момент времени t + (учитывая независимость перемещения за данный интервал времени от перемещения за предшествующий интервал времени): x_+t = x_t + x_

После возведения в квадрат и усреднения (обозначаемого угловыми скобками): <x_+t²>= <x_t²> + 2<x_t x_> + <x_²> = <x_t²> + <x_²>

Для функции x_tf(t) получаем функциональное уравнение f(t +) = f(t) + f(), из которого следует, что f(t +) =const (t +). Следовательно, <x_²> пропорционально t, т.е. f(t) = at, где a – некоторая константа.

В 3-х мерном случае <r²> = <x²> + <y²> + <z²> = 3<x²>, т.к. в силу симметрии <x²> = <y²> = <z²>. Следовательно, в выражении для <r²> коэффициент пропорциональности при t линейно зависит от размерности пространства d: <r²> = a d t.

Диффузия. Коэффициент диффузии

Случайные блуждания отдельных частиц можно рассматривать и с другой точки зрения, как результирующий эффект при перемещении большого числа частиц. В этом случае возникает понятие коэффициента диффузии. В соответствии с молекулярно-кинетической теорией, коэффициент диффузии – это коэффициент пропорциональности между потоком частиц на единицу площади (j) и градиентом концентрации (dn/dx) в одномерном случае j = D dn/dx.

Тогда выражение для потока частиц J в единицу времени через заданную границу в одном направлении дает отношение числа частиц в объеме S ( = vdt) к времени dt. Интерпретация: при случайных блужданиях все частицы случайным образом распределяются по 6 направлениям (в трехмерном случае), пролетая до следующего возможного изменения скорости расстояние  (по определению длины свободного пробега) с характерной скоростью v (mv²/2 = 3/2 kT, для уточнения оценок нужно учесть распределение молекул по скоростям, такое уточнение дано в учебниках физики).

Поток на единицу площади j = J/S = n S vdt/Sdt = nv, где n – концентрация частиц в единице объема. Используя аналогичное выражение для обратного потока, получим результирующий поток j = n v, где n – изменение концентрации на расстоянии . Выделяя градиент концентрации как dn/dx = n/, получим выражение, связывающее поток с градиентом концентрации и определение коэффициента диффузии D =  v (с точностью до множителя порядка единицы, более точное выражение D =  v/3).

При случайных блужданиях молекул квадрат проходимого расстояния пропорционален времени, т.е. <x²> = at.

Определим коэффициент а, рассматривая время, за которое сделан один шаг (т.е. пройдена длина свободного пробега . Тогда <x²> = ². С другой стороны та же величина <x²> = at = a/v. Отсюда (при одномерном блуждании) a = v = D, т.е. квадрат пройденного расстояния дает величина R² = Dt. При размерности d: R² = d D t (с точностью до множителя поря

дка единицы, более точное выражение для R: R² = 2 d D t, т.е. R = (2 d D t)^1/2, Сивухин, т.2, с.213)

В этой же связи можно представить пройденное при случайных блужданиях расстояние R в зависимости от числа шагов N: R = l (N)^1/2, l – длина одного шага. Это же и формула для ошибки при случайных измерениях, если вместо R, N и l подставить соответственно результирующую ошибку, число измерений и ошибку при одном измерении.

Пример. Шкала расстояний и времени при случайном блуждании частиц на примере диффузии из радиального сосуда (П) кровеносного капилляра радиуса 8 мкм

Расстояние от исходной точки, на котором будет находиться молекула сахарозы (коэффициент диффузии для нее D = 4,6 10^–6 см² с^–1) через 10^–8, 10^–6, 10^–4, 10^–2, 10⁰, 10², 10⁴ с (это случай двумерных блужданий, поэтому для 10⁰ с расстояние 4,3 10^–3 см и т.д.).

Ограничения на размер макромолекул

В простейшем случае для количественного описания пространственной структуры макромолекулы полимера можно принять аналогию с траекторией точечной частицы, считая одинаковыми сегменты (звенья), которые способны относительно независимо располагаться в пространстве (отличие структуры полимера в том, что сегменты не могут пересекаться, а траектория может).

Тогда длина сегмента молекулы, способного относительно независимо изменять свое положение в пространстве (так называемая длина статистического сегмента) формально отвечает длине свободного пробега при случайных блужданиях, а вся длина макромолекулы (так называемая контурная длина молекулы) отвечает траектории точечной частицы в течение времени, за которое частица проходит расстояние, равное этой длине.

Соответственно по аналогии с диффузией радиус будет пропорционален длине шага и корню квадратному из числа сегментов. Это представление называют моделью свободно сочлененной цепи.

Модель свободно сочлененной цепи естественно использовать при большом числе одинаковых сегментов.

Реально многие молекулы биополимеров (в частности, белков и ДНК) действительно образуют неупорядоченный (статистический) клубок при соответствующих условиях (например, белки при денатурации). В этом случае линейный размер «клубка» оказывается намного меньше, чем длина молекулы, если ее «вытянуть» в линейную цепочку.

Для радиуса R статистического клубка (из свободно сочлененной цепи) используют формулу (Макеев, стр. 43):

R = (L l/6)^1/2,

где L – контурная длина молекулы, а l – длина статистического сегмента.

Предложенный подход применим к любым полимерам, не только белкам. В таком представлении возможна, например, оценка размера молекулы ДНК

Задача об оценке размера ДНК человека и кишечной палочки (обоснование необходимости многоуровневой укладки).

Представьте, что молекула ДНК человека (6 10⁹ п.н.) и кишечной палочки E. coli (4.2 10⁶ п.н.) представляют собой статистические клубки. Рассчитайте характерный размер таких клубков и сравните его с объемом компартмента, в который упакованы эти молекулы (для человека – это ядро радиусом 6 мкм, для кишечной палочки – это сама клетка, ее радиус около 0.5 мкм). Длина статистического сегмента (фрагмент длины, вращение которого можно считать независимым от других фрагментов) двухцепочечной молекулы ДНК составляет l = 100 нм.

Решение. R = (L l/6)^1/2 = 180 мкм для человека и около 6 мкм для кишечной палочки.

L – контурная длина молекулы ДНК, определяемая как произведение L = N *0,34 нм, где N – число пар нуклеотидов, 0,34 нм – длина, приходящаяся на один нуклеотид (см. справочные данные).

Тот же подход можно применить и к движению бактерий, рассматривая его в простейшем представлении как случайное (это дает важный ориентир).

*Тема для самостоятельного расчета: представление случайных блужданий при потере ориентации бактерии из-за случайных соударений с молекулами среды

Указание: рассмотреть случайное блуждание угла (т.е. направления движения) при соударениях с частицами среды (обсудить: распределение частиц по энергиям и эффект соударения с крупными частицами).

Ограничения на перемещения молекул

Ограничение перемещения молекул в связи с диффузией можно рассматривать и независимо. Важность ограничений такого рода иллюстрирует задача об обосновании необходимости сложной архитектуры фотосинтезирующего листа (как результат негативной оценки скорости одномерной диффузии).

Известно, что характерная наблюдаемая скорость CO₂-газообмена листьев составляет A = 20 мкмоль CO₂ м^–2с^–1 при концентрации CO₂ в воздухе 300 мкл/л = 0,03% (концентрация в воде в этом случае составляет c₀ = 20 мкМ при нейтральном pH, т.е. pH около 7). Максимальная производительность фермента РДФК (рибулезодифосфаткарбоксилазы), обеспечивающего включение молекулы CO₂ в цепь биохимических превращений при фотосинтезе составляет k = 20 с^–1, а его молекулярная масса 550 кДа. При какой толщине листа может быть достигнута наблюдаемая скорость фотосинтеза, если принять, что фотосинтез, начиная с поступления CO₂ в лист, осуществляется в сплошной (водной) среде фотосинтезирующих клеток? Сравнить полученное значение с характерным размером растительной клетки (30–40 мкм) и толщиной листа. Попытайтесь объяснить полученный результат. Коэффициент диффузии для CO₂ в воде D = 1.46 10^–6 см² с^–1 (в воздухе – 0.2 см² с^–1).

Решение. Диффузионный поток CO₂ в лист J = S D dc/dx ~ S D (c₀-c)/l через единицу площади S должен обеспечить наблюдаемую скорость фотосинтеза, а РДФК должна обеспечивать переработку поступающего CO₂. Отсюда A S = J = D S (c₀-c)/l = k E₀ S l, где c – концентрация CO₂ в местах карбоксилирования, l – толщина листа, E₀ – концентрация РДФК. Для оценки примем c = c₀-c = c₀/2 = 10^-5 М.

Оценку E₀ можно получить, исходя из того, что 80% объема (и массы) листа составляет вода. Это означает, что на все другие вещества приходится не более 1/5 объема (и массы), т.е. 200 г/л. Удобно принять (учитывая конкретное значение молекулярной массы), что концентрация РДФК как важнейшего, но не единственного вещества в фотосинтезирующей клетке, составляет 55 г/л. Отсюда E₀ = 55 г/л /(550 000 г/моль) = 10^–4 М.

Подставляя эти значения в исходные уравнения, получим, что наблюдаемую скорость фотосинтеза достичь невозможно, если диффузия происходит в сплошном объеме водной фазы. С одной стороны, из уравнения j = J/S = D c/l = A следует, что толщина сплошной водной фазы (через которую идет диффузионный поток) не может быть больше, чем l = D c/A = 0,75 мкм. Для сравнения растительная клетка во всех измерениях имеет длину не менее 10 мкм (характерным считают значение 30–40 мкм).

С другой стороны, для достижения наблюдаемой скорости фотосинтеза толщина листа l не может быть меньше, чем A /k E = 40 мкм.

Преодоление диффузионных ограничений обеспечивают: транспорт в газовой фазе (где коэффициент диффузии на 5 порядков больше, чем в воде), увеличение площади поверхности клеток, граничащих с газовой фазой, по сравнению с площадью листа в 10–30 раз (отсюда сложная внутренняя архитектура листа); расположение хлоропластов вблизи поверхности раздела с газовой фазой.

Развитие темы диффузионных ограничений возникает в связи с сопряжением диффузионных потоков. Например, при фотосинтезе поток СО₂ в лист связан с разницей концентраций СО₂ в воздухе и межклеточном пространстве листа линейным соотношением

A = (c_a – c_i)/r, (1)

где A –– скорость ассимиляции СО₂, c_a и c_i –– концентрации СО₂ соответственно в воздухе (индекс «а» от «air») и в межклеточном пространстве листа (индекс «i» от «intercellular»), а величина r (по аналогии с законом Ома) имеет смысл сопротивления транспорту СО₂, а обратная ему величина g = 1/r –– это проводимость в газовой фазе.

Аналогичное соотношение

E = (w_i – w_a)/r', (2)

связывает скорость транспирации E (испарения воды, evaporation) с разницей концентраций паров воды (w) в воздухе и межклеточном пространстве (индексация та же, знак разности учитывает, что транспирационный поток направлен из листа в воздух, т.е. то, что, w_i > w_a) с тем отличием, что сопротивление для воды в 1.6 раза меньше, чем для СО₂, т.е. r = 1.6 r'. Коэффициент 1,6 учитывает все факторы, прежде всего, различие в молекулярной массе. В силу различия масс различается скорость, с которой молекулы идут по заданному пути. При одинаковой температуре скорость обратно пропорциональна корню квадратному из молекулярной массы, т.е. для молекул H₂O и CO₂ отношение скоростей – это 1,56. Но есть и другие факторы: различие эффективного сечения молекул, вынос CO₂ с транспирационным током (т.е. транспорт молекул не является чисто диффузионным.) и др.

Обычно считают, что w_i –– это насыщающая концентрация паров воды при соответствующей температуре, тогда w = w_i – w_a –– это дефицит давления паров воды в воздухе.

Сравнение потоков молекул H₂O и СО₂ по абсолютной величине дает отношение E(c_i)/A(c_i)

E/A =1,6w/(c_a – c_i). (3)

При обычных условиях газообмена значение c_a не превосходит 0,035%, т.е. 350 мкл/л (разность c = c_a – c_i еще меньше, т.к. c_i всегда порядка c_a, в некоторых случаях даже близка к c_a), а w имеет порядок 10 мл/л. Учитывая такое соотношение числителя и знаменателя в правой части (3), потери воды измеряются в сотнях молекул в расчете на одну ассимилированную молекулу СО₂.

Приложение: схема включения CO₂ при C₃- и C₄-фотосинтезе

C₃-фотосинтез: РДФ + CO₂  2 ФГК, где РДФ и ФГК – это соответственно

рибулезо-1,5-дисфосфат: [CH2OPO(OH)2]–[C=O]–[HCOH] –[HCOH]– [CH2OPO(OH)2] (C₅)

3-фосфоглицериновая кислота [COOH]– [HCOH] – [CH2OPO(OH)2] (C₃-соединение)

C₄-фотосинтез: высвобождению CO₂ в хлоропластах клеток обкладки сосудистого пучка предшествуют фиксация CO₂ в форме C₄-соединения (ФЕП + CO₂ оксалоацетат аспартат/малат), транспорт из клетки мезофилла в клетку обкладки и декарбоксилирование [Холл, Рао «Фотосинтез» или подробнее Дж. Эдвардс, Д.Уокер «Фотосинтез C₃- и C₄-растений: механизмы и регуляция», <М., Мир, 1986> с. 313], или статьи

где

оксалоацетат =,

малат =,

аспартат,

При C₄-фотосинтезе фиксация углекислоты в форме C₄-кислот (в клетках мезофилла) и фотосинтез (в клетках обкладки сосудистого пучка) разделены в пространстве.

Механизм концентрирования CO₂ при C₄-фотосинтезе позволяет значительно (на порядок и более) увеличить концентрацию CO₂ в местах карбоксилирования и за счет этого насытить ключевой фермент фотосинтеза РДФК (см. выше), одновременно уменьшая неизбежно сопровождающие фотосинтез затраты воды (там же схема сопротивлений и аналог закона Ома для поступления CO₂ в лист и транспирации).

В условиях жесткого водного дефицита (например, в мексиканских пустынях, где дождь выпадает не каждый год) фиксация углекислоты (с накоплением органических кислот в вакуоли и соответственно закислением ее содержимого; происходит ночью при высокой относительной влажности воздуха за счет понижения температуры w может уменьшаться до нуля) и фотосинтез (происходит днем при закрытых устьицах с высвобождением накопленного СО₂) разделены во времени. Такую модификацию C₄-фотосинтеза называют CAM-фотосинтез (Crassulaceaen Acid Metabolism, метаболизм кислот по типу толстянковых, например, представителями этого семейства являются кактусы).

Аналогичное описание сопряжения потоков воды и СО₂, к которым присоединяется также и поток кислорода при дыхании, можно использовать применительно к циклическому дыханию насекомых (разделение во времени, аналогичное CAM-фотосинтезу, ФЖ, с. 85–86, 93–99) и эмбриональному развитию зародыша из яйца (ФЖ, 80–81). Общее количество потребленного кислорода при развитии зародыша определено состоянием, которое должно быть достигнуто к моменту вылупления. Это позволяет вычислить массу потерянной яйцом воды и выделенного СО₂. В частности, отсюда ясна важность поддержания определенной влажности во время инкубации.

Интересно, что при циклическом дыхании насекомых поток СО₂ (как и, по всей видимости, поток воды) дискриминирован в сравнении с потоком кислорода в отношении 1:20 или даже 1:100 (ФЖ, с. 94). Можно предположить, что дискриминация СО₂ и воды (как гидрофильных молекул) достигается за счет гидрофобной поверхности на пути транспорта внутрь насекомого при малом просвете проводящих каналов/сосудов (дыхалец вместе с трахеями).

Это означает необходимость высвобождения накопленного СО₂ (которое осуществляется «залпом») и соответственно потерь воды, которые значительно уменьшаются за счет увеличения отношения c/w при накоплении углекислоты в трахейной системе и тканях.